陳可欣， 喬中全， 曾慧杰， 李永欣，3， 蔡 能，陳 藝， 王曉明，何 鋼

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004；3.長沙市木本花卉工程技術(shù)研究中心， 湖南 長沙 410004 )

紫薇(Lagerstroemiaindica)為千屈菜科紫薇屬木本植物，別名“癢癢樹”“百日紅”[1]，在我國華北、華南、西南地區(qū)分布廣泛[2]。“紫韻”紫薇是湖南省林業(yè)科學(xué)院選育的，于2016年12月獲得國家林業(yè)局植物新品種權(quán)證書的彩葉紫薇新品種。其嫩葉呈深紅色，老葉呈紫灰色[3]，葉片中花青素含量豐富?；ㄇ嗨貫樗苄缘奶烊簧?，在抗氧化、抗癌、清除自由基等方面具有卓越功效[4]。黃烷酮-3-羥化酶(Flavanone-3-hydroxyase，F(xiàn)3H)是花青素合成過程的中間產(chǎn)物，在C3位置羥基化生成二氫黃酮醇化合物[5]。JIANG F等[6]在草莓中構(gòu)建F3H基因的RNAi沉默載體后，發(fā)現(xiàn)其果實(shí)表皮變成了綠色，而內(nèi)部變成了白色。NISHIHARA M等[7]在白色藍(lán)豬耳F3H基因的上游區(qū)域插入一段長重復(fù)序列是致使花瓣未著色的原因，導(dǎo)入外源F3H基因后花瓣呈粉紅色。這說明F3H基因?qū)χ参锘ㄉ?、葉色的形成具有關(guān)鍵作用。目前關(guān)于彩葉紫薇育種的研究主要集中在雜交育種、誘變育種、選擇育種。由于自交不親和，人工授粉率低，誘變后遺傳性狀不穩(wěn)定，因此，傳統(tǒng)方法培養(yǎng)新彩葉紫薇品種需耗費(fèi)大量物力和時(shí)間。采用基因工程技術(shù)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上改變?nèi)~色、花色基因的表達(dá)將開啟紫薇育種的新模式。目前已從矮牽牛[8]、獨(dú)行菜[9]、茶樹[10]、芒果[11]等植物中克隆出F3H基因，而在紫薇中的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究通過同源克隆和RACE技術(shù)克隆了紫薇F3H基因的cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步研究F3H基因在紫薇花青素生物合成中的功能奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)“紫韻”紫薇分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為湖南省林業(yè)科學(xué)院選育的紫薇新品種“紫韻”。于2019年6月在湖南省林業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地取其新鮮葉片進(jìn)行速凍處理，保存于-80 ℃的冰箱。

1.2 總RNA的提取與cDNA第一條鏈的合成

利用艾德萊公司RNA快速提取試劑盒提取總RNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照HIScript II Q RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京諾唯贊)說明書上的方法合成cDNA第一條鏈，再使用酶標(biāo)儀測定其初始濃度并稀釋到終濃度200 ng·μL-1，保存在-20 ℃度的冰箱備用。

1.3 紫薇的F3H(LiF3H)基因的保守片段合成

在NCBI上通過木本植物(茶樹、石榴、柑橘、核桃、梨、蘋果、桃子)選擇F3H基因保守片段較高的部分序列設(shè)計(jì)簡并性引物。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×EsTaq MasterMix(Dye)12 μL，正反向引物各0.8 μL，“紫韻”紫薇嫩葉cDNA 2.5 μL，無菌水8.9 μL。設(shè)置PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，32個(gè)循環(huán)；經(jīng)過電泳跑膠，得到與預(yù)期差不多大小的片段；利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒切膠回收，送至長沙擎科生物公司測序。

1.4 LiF3H基因的全長克隆

根據(jù)保守片段測序結(jié)果，設(shè)計(jì)5′和3′內(nèi)側(cè)、外側(cè)各兩條引物，按照TAKARA SMARTER?RACE 5′/3′Kit Components(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)說明書上的方法將完整性質(zhì)量較好的RNA分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并設(shè)置PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。將最后一輪PCR擴(kuò)增條帶切膠回收，與pTOPO-TA載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，經(jīng)搖床過夜培養(yǎng)；挑單克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 LiF3H蛋白的生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder預(yù)測其最大開放閱讀框；利用在線網(wǎng)站ProtParam預(yù)測LiF3H蛋白的基本理化性質(zhì)；通過Conserved Domains分析LiF3H蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用SOPMA、Swiss-Model對(duì)LiF3H蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用SignalP4.1和TMHMM Sever 2.0工具進(jìn)行LiF3H蛋白質(zhì)信號(hào)肽和跨膜區(qū)的預(yù)測。通過DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹。

表1 LiF3H基因克隆引物及退火溫度Tab.1 LiF3H gene cloning primers and annealing tempera-ture℃引物名稱引物序列退火溫度LiF3H—M—OFCGGGACTACTCCCGGTGGCCC55 LiF3H—M—ORGGGCCACCGGGAGTAGTCCCG55LiF3H—CDS—OFTGCTCTAGAATGGCGCCCACGGC-CACCA60LiF3H—CDS—ORCCCAAGCTTCTCGCGAGCTCGAG-GTCCTT60LiF3H—3RACE_INGAAGACGTGGATCACGGTCCAAC68LiF3H—3RACE_OUT ACTACTACCCGAAGTGCCCA68LiF3H—5RACE_IN TGCTGCGTCACGGTTTTC68LiF3H—5RACE_OUT TTGTGGGCACTTCGGGTAG68

2 結(jié)果與分析

2.1 LiF3H基因保守片段的克隆

對(duì)LiF3H基因保守片段進(jìn)行擴(kuò)增得到其測序正確大小為345 bp的條帶(見圖1)，將其在NCBI數(shù)據(jù)庫上比對(duì)。結(jié)果顯示，該基因片段與石榴的F3H基因相似度最高，可以確定已經(jīng)克隆得到紫薇的F3H基因的一部分。

圖1 LiF3H基因保守片段的擴(kuò)增條帶Fig.1 Cloning of LiF3H conserved fragment

2.2 LiF3H基因的全長克隆

對(duì)LiF3H基因的保守片段設(shè)計(jì)5′和3′內(nèi)外側(cè)特異性引物，經(jīng)過切膠回收與pTOPO-TA連接轉(zhuǎn)化以及測序，得到大小都為563 bp的片段(見圖2、圖3)；將5′、3′序列和保守片段進(jìn)行拼接得到LiF3H基因的cDNA序列，通過ORF Finder在線預(yù)測LiF3H基因最大CDS序列，設(shè)計(jì)引物測序得到大小為1116 bp的條帶(見圖4)，與預(yù)期的結(jié)果一致。

圖2 LiF3H基因3′RACE擴(kuò)增條帶Fig.2 Amplified band of LiF3H gene 3'RACE

圖3 LiF3H基因5′RACE擴(kuò)增條帶Fig.3 Amplified band of LiF3H gene 5'RACE

圖4 LiF3H基因CDS擴(kuò)增條帶Fig. 4 Amplified band of LiF3H gene CDS

2.3 LiF3H蛋白的基本理化性質(zhì)

將LiF3H蛋白序列輸入ProtParam在線網(wǎng)站進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該蛋白的分子量為41.600 36 KD，分子式為C1842H2923N505O563S14，等電點(diǎn)為5.26，不穩(wěn)定系數(shù)為45.4，親水性為-0.427，說明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.4 LiF3H蛋白的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測

利用NCBI上的Conserved Domains分析LiF3H蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，該蛋白含有的PcbC保守結(jié)構(gòu)域位于37～315，2OG-Fell-Oxy結(jié)構(gòu)域位于200～294。其中 His(220，278)、Asp222是依賴 Fe2+的活性結(jié)合位點(diǎn)，Arg288和 Ser287是依賴2-酮戊二酸的活性結(jié)合位點(diǎn)。

2.5 LiF3H蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)預(yù)測

利用SignalP 4.1工具進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，LiF3H蛋白無信號(hào)肽；利用TMHMM Sever 2.0工具進(jìn)行預(yù)測該蛋白無跨膜區(qū)域，屬于非膜蛋白。

2.6 LiF3H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線網(wǎng)站對(duì)LiF3H蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示：該蛋白以α-螺旋和不規(guī)則盤繞為主，分別占39.62%和37.74%；延伸鏈占17.79%，β-轉(zhuǎn)角占4.85%(見圖5)。

圖5 LiF3H蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.5 Prediction of secondary structure of LiF3H protein

利用Swiss-Model在線網(wǎng)站對(duì)LiF3H蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，以擬南芥花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS，PDB ID：1gp4)為模版，結(jié)果顯示，該蛋白的三維模型覆蓋率為88%，序列的一致性為29.97%(見圖6)。

圖6 LiF3H蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of the tertiary structure of LiF3H protein

2.7 LiF3H蛋白的多序列對(duì)比及系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，LiF3H蛋白與石榴、楊梅、榴蓮、巨桉、木槿的F3H蛋白同源性分別為90.39%、87.06%、86.25%、84.91%和81.13%，說明LiF3H蛋白在進(jìn)化上較為保守(見圖7)。

圖7 LiF3H蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 7 Prediction of the conserved domain of LiF3H protein

在MEGA上用鄰接法將LiF3H蛋白的氨基酸序列與其他12種植物F3H蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)LiF3H蛋白與同屬千屈菜科的石榴F3H蛋白的親緣關(guān)系最近，其次為月季的(見圖8、圖9)。

圖8 LiF3H蛋白與其它物種F3H蛋白的多序列比對(duì)Fig.8 Multiple sequence alignments between LiF3H protein and F3H protein of other species

圖9 LiF3H蛋白與其它物種F3H蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of LiF3H and F3H proteins of different species

3 結(jié)論與討論

花青素苷在植物體內(nèi)是通過糖苷鍵結(jié)合從而穩(wěn)定存在于細(xì)胞的液泡中[12]?；ㄇ嗨睾铣赏緩降钠鹗记绑w是苯丙氨酸，經(jīng)過苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)、4-香豆酸 CoA連接酶(4CL)、查爾酮合酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、花青素合成酶(ANS)等一系列酶的作用下生成各色花青苷[13]。黃烷酮-3-羥化酶(F3H)是花青素苷合成途徑的一個(gè)中間樞紐。有研究表明，F(xiàn)3H基因的表達(dá)量與花青素含量密切相關(guān)，從而影響植物呈色的變化。師守國等[14]研究棗的F3H基因發(fā)現(xiàn)其紅熟期表達(dá)量最大，綠熟期表達(dá)量最低，且表達(dá)量變化與花色苷含量變化有相同趨勢。范月婷等[15]通過在煙草中表達(dá)HbF3H基因，其顏色顯著加深，同時(shí)促進(jìn)了花青素的積累。本研究中，“紫韻”紫韻嫩葉時(shí)期為深紅色，推測可能紫薇的F3H(LiF3H)基因在葉片生長初期表達(dá)量較高，酶活性較強(qiáng)，積累了較多的花青素，從而使葉片呈現(xiàn)出不同于常見的綠色。這些還需進(jìn)一步做熒光定量表達(dá)與花青素含量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

在本研究中，克隆得到了LiF3H基因長度為1372 bp的cDNA序列，5′非翻譯區(qū)長113 bp，3′非翻譯區(qū)長106 bp，包含了30 bp的polyA，表明在紫薇中成功克隆到了F3H完整基因。得到的最大開放閱讀框?yàn)?116 bp，編碼為371個(gè)蛋白。該蛋白為2-酮戊二酸雙加氧酶超家族成員，其保守結(jié)構(gòu)域與其他植物F3H蛋白的相類似。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，LiF3H蛋白與同為千屈菜科的石榴F3H蛋白的親緣關(guān)系最近。本研究為進(jìn)一步深入研究LiF3H基因在紫薇花青素合成中的功能奠定了基礎(chǔ)，也可為紫薇轉(zhuǎn)基因育種提供參考。