付文慧，劉成龍，田 陽，陶 莎，薛文通*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖中心 北京100083 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

小麥過敏、乳糜瀉、非乳糜瀉小麥敏感（NCGS）等“小麥相關(guān)疾病”在世界各地的發(fā)病率在不斷上升[1]。對于這些疾病患者而言，避免攝入小麥致敏蛋白是唯一且有效的方法[2]。除探究過敏機制、尋找治療的突破點外，研發(fā)低致敏性的小麥食物成為當(dāng)前亟待解決的問題。乳酸菌在發(fā)酵過程中通過自身的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)降解相關(guān)蛋白質(zhì)及多肽，并通過產(chǎn)酸改變發(fā)酵面團的pH 值以激活面粉的內(nèi)源性蛋白酶，進一步加強蛋白質(zhì)的降解[3]。在蛋白質(zhì)降解為多肽及氨基酸時，既改變了面團風(fēng)味，也改變了致敏蛋白的含量。此外，乳酸菌代謝產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)可以延長產(chǎn)品貨架期，產(chǎn)生的胞外多糖可以改善面團的品質(zhì)[4]。鑒于此，乳酸菌發(fā)酵作為一種很有前景的發(fā)酵方式，值得進一步的探究。乳酸菌種類繁多，目前對于其降低小麥蛋白抗原性的研究多集中于植物乳桿菌發(fā)酵方面。干酪乳桿菌被證實具有細胞被膜蛋白酶，而這種酶在降解蛋白質(zhì)的過程中起到很重要的作用[3，5-7]。此外，大量研究表明加工方式影響食物蛋白的抗原性，目前用于降低食物蛋白抗原性的加工方法主要有熱加工（蒸煮、烘烤等）和非熱加工（發(fā)酵、酶解、超聲等）[8]。蒸煮等熱加工方式會改變食物蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而改變抗原的構(gòu)象表位，而抗原蛋白線性表位的破壞主要發(fā)生在發(fā)酵和酶解過程中[8-9]。Rao 等[10]研究發(fā)現(xiàn)低溫烘烤和水煮能夠產(chǎn)生較低致敏性的花生。Rui 等[11]利用植物乳桿菌發(fā)酵降低了大豆分離蛋白的抗原性。Li 等[12]利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶連續(xù)酶解降低了小麥中致敏谷蛋白含量。本研究利用分離自老面中的1 株干酪乳桿菌發(fā)酵面團，研究其對小麥致敏蛋白含量及抗原性的影響，研究加工條件與抗原性之間的關(guān)系，為開發(fā)低致敏性小麥制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革蘭氏染色試劑盒、細菌組DNA 提取試劑盒、乳酸桿菌選擇性瓊脂、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 分離/濃縮膠緩沖液、預(yù)染蛋白Maker、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；EL-TMB 顯色試劑盒，上海生工生物；試驗所用試劑均為分析純級，兔過敏血清由實驗室自制。

1.2 主要儀器

PCR 熱循環(huán)儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC 酶標儀，上海賽默飛公司；mini-proteanⅡ凝膠儀，美國伯樂公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干酪乳桿菌的分離鑒定 稱取酸面團樣品5 g 于無菌均質(zhì)袋中，加入45 mL 滅菌后的蛋白胨水（1%蛋白胨，0.43% NaCl，0.72% Na2HPO4，0.36% KH2PHO4，pH 7.0），混勻后梯度稀釋，取10-5～10-7稀釋梯度，涂布于乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，隨機挑取菌落進行過氧化氫酶和革蘭氏染色試驗。取過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性且鏡檢為桿狀的菌株進行進一步分子鑒定。

采用細菌組DNA 提取試劑盒提取所分離菌株的DNA，利用細菌通用引物27F（5’-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTAC GA-3’）和1492R（5’-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）通 過PCR 反應(yīng)對16S rRNA 基因進行擴增。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，35 個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送于北京生工生物工程有限公司測序。所得序列與NCBI 文庫比對后，用MegaX 構(gòu)建進化樹。

1.3.2 菌株生長曲線和菌落數(shù)與OD 值對應(yīng)關(guān)系的測定 取一支凍存菌種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃下活化24 h。取0.5 mL 活化菌液于6 個分別裝有30 mL MRS 肉湯的三角瓶中，37℃培養(yǎng)0，4，8，12，16，20 h，在波長600 nm 處測量各時段菌液吸光度值，繪制生長曲線。

取活化菌液用MRS 肉湯稀釋2，2.5，3，4，5，6倍，測定OD600nm值，并梯度稀釋，傾注于MRS 瓊脂中，37℃培養(yǎng)48 h 后計算活菌數(shù)。

1.3.3 酸面團的制備 取指數(shù)生長期菌液，6 000×g 離心10 min，生理鹽水洗滌2 次，雙蒸水重懸浮至50 mL，調(diào)節(jié)OD600nm值為0.8。100 g 面粉與50 mL 菌懸液投入和面機，和面15 min，面團內(nèi)菌體數(shù)量約為108CFU/g。發(fā)酵溫度30℃，相對濕度80%，發(fā)酵24 h，定時取樣。

1.3.4 發(fā)酵過程中pH 值、可滴定酸度（TTA）和面團蛋白含量的測定 每隔2 h 取樣，于無菌均質(zhì)袋中10 倍稀釋后混合均勻，測定pH 值并用0.1 mol/L NaOH 滴定至pH 值為8.3，記錄所消耗NaOH 的體積數(shù)即TTA 值。

將發(fā)酵面團樣品凍干后磨粉于-20℃保存。蛋白提取參照Prado 等[13]的方法，具體操作如下：向500 mg 面粉中加入10 mL Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH 8.8），于4℃下攪拌1 h，20 000×g，4℃離心20 min，收集上清液（清蛋白和球蛋白）；沉淀用5 mL 緩沖液洗滌3 次，加入10 mL 75%乙醇，室溫下攪拌1 h，離心20 min，收集上清液（醇溶蛋白）；采用5 mL 75%乙醇洗滌沉淀3 次，加入10 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8，1% SDS，0.5%DTT），4℃攪拌2 h，離心20 min，收集上清液（谷蛋白）。采用考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.5 SDS-PAGE 電泳及免疫印跡分析 參照Rao 等[10]的方法，具體操作如下：制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，樣品溶液稀釋為相同濃度后與5x 上樣緩沖液混合并沸水加熱5 min，進樣后進行垂直電泳（濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓110 V），電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍R250 染色，脫色后于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

未染色的電泳膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（300 mA 冰浴下轉(zhuǎn)膜90 min），麗春紅染色確認轉(zhuǎn)膜成功。加入5%脫脂奶粉，搖床上搖動封閉2 h；加入稀釋的一抗（抗小麥蛋白兔血清），4℃下孵育過夜；TBST 緩沖液（0.02 mol/L TBS，0.05% Tween-20，pH 7.6）洗膜后，加入稀釋的AP-羊抗兔二抗，室溫下孵育90 min；洗膜后，利用BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。

1.3.6 不同發(fā)酵方式及熱加工方法制作饅頭 向100 g 面粉（乳酸菌菌落數(shù)108～109CFU/g）中加入50 mL 菌懸液和0.35 g 安琪酵母調(diào)制面團后分別發(fā)酵。冷藏發(fā)酵條件為：4℃發(fā)酵3 d 后于37℃，80%相對濕度發(fā)酵60 min；一次發(fā)酵條件為：37℃，80%相對濕度發(fā)酵60 min；二次發(fā)酵條件為：中種面團（60 g 面粉，0.35 g 酵母，30 mL 菌懸液）于37℃發(fā)酵4 h 后加入40 g 面粉和20 mL 水繼續(xù)發(fā)酵1 h。發(fā)酵好的3 種面團用于烤制（180℃，20 min）和蒸制（沸水蒸制20 min）。取樣凍干，磨粉備用。

1.3.7 蛋白含量及酶聯(lián)免疫吸附試驗測定 總蛋白提取參照Akagawa 等[14]的方法，具體操作如下：25 mg 面粉加入1 mL 蛋白提取液【40 mmol/L Tris，8 mol/L 尿素，4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）】，冰浴下超聲提取30 s，6次；4℃下16 000×g 離心20 min，收集上清液，考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)量濃度。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗評價樣品抗原性[15]。使用50 mmol/L，pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋蛋白至5 μg/mL，按100 μL/孔加入酶標板，4℃靜置過夜；用TBST 洗板4 次，按150 μL/孔加入1%BSA封閉液，37℃溫育2 h；TBST 洗板后按100 μL/孔加入使用1% BSA 稀釋的抗小麥蛋白兔血清稀釋液（1∶10 000），37℃溫育2 h，洗板；按100 μL/孔加入500 倍稀釋的羊抗兔HRP-IgG，37℃溫育1 h，洗板；使用TMB 顯色試劑盒顯色，于波長450 nm 處測OD 值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 軟件處理，圖由GraphPad Prism 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌的分離鑒定

從培養(yǎng)基中隨機挑選白色、圓形的凸起菌落，經(jīng)過氧化氫酶和革蘭氏染色試驗后，選出過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性菌株進行16S rRNA 基因測序，經(jīng)同源序列比對后，共鑒定出4 株干酪乳桿菌和2 株糞腸球菌。由圖1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹可以看出，共檢測到2 個屬：腸球菌屬（Enterococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。MM1（干酪乳桿菌）、MM6（干酪乳桿菌）、MM8（副干酪乳桿菌）、MM9（干酪乳桿菌）和YL1（屎腸球菌）、YM2（屎腸球菌）形成了2 個類群并與對應(yīng)的模式菌株聚在一起，進一步驗證了分子學(xué)鑒定結(jié)果的可靠性。

圖1 乳酸菌16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of lactic acid bacteria

2.2 菌株生長曲線和菌落數(shù)與OD 值對應(yīng)關(guān)系的測定

選擇與模式菌株親緣關(guān)系最近的MM6 菌株進行發(fā)酵試驗。如圖2所示，干酪乳桿菌MM6 在2～14 h 處于指數(shù)生長期，在14～20 h 進入生長穩(wěn)定期，20 h 以后由于營養(yǎng)物質(zhì)不足和代謝物的積累，菌體死亡數(shù)量增多。試驗收集指數(shù)生長后期菌體進行發(fā)酵試驗，此時菌株生長旺盛，酶等代謝相關(guān)物質(zhì)活性較高。通過倒平板記取菌落數(shù)，得到其與OD600nm值的對應(yīng)關(guān)系（圖2b），縱坐標為稀釋106后的菌落數(shù)，雙蒸水重懸浮菌泥至相應(yīng)OD600nm值以保證發(fā)酵面團中活菌體的含量為108CFU/g。

圖2 干酪乳桿菌菌落數(shù)變化Fig.2 Changes of number of Lactobacillus casei MM6 colonies

2.3 發(fā)酵過程中pH 值、TTA 值的變化

如圖3所示，隨著發(fā)酵時間延長，空白組（K）pH 值和TTA 值變化不大，然而干酪乳桿菌添加組（LAB）的pH 值逐漸降低，24 h 后低至3.9，TTA值與pH 值變化呈相反的趨勢。干酪乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，發(fā)酵過程中乳酸、醋酸等有機酸的代謝導(dǎo)致面團pH 值下降、TTA 值增加。

圖3 面團發(fā)酵過程中pH 值和TTA 值的變化Fig.3 Changes of pH and TTA during dough fermentation

2.4 發(fā)酵過程中蛋白組分及抗原性的變化

采用SDS-PAGE 試驗對發(fā)酵過程中面團蛋白的變化進行了評估。如圖4所示，在發(fā)酵24 h后，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的組分和含量均有變化。隨著發(fā)酵的進行，清、球蛋白中25～35，15～25，10～15 ku 條帶變淺；醇溶蛋白條帶無明顯變化；谷蛋白80 ku 和40 ku 左右的條帶發(fā)酵后明顯變淺。12，15～25，40，88 ku 區(qū)域分別對應(yīng)著小麥過敏原Tri a 37，Tri a 18，Tri a 36 和Tri a 26，從圖4可以看出，這些區(qū)域的蛋白在發(fā)酵24 h 后均有一定程度的降解。

圖4 干酪乳桿菌MM6 發(fā)酵對蛋白組分的影響Fig.4 Effects of Lactobacillus casei MM6 fermentation on wheat protein composition

圖5顯示，發(fā)酵后的大部分蛋白樣品仍與抗小麥蛋白兔血清發(fā)生了較為強烈的反應(yīng)。清蛋白和球蛋白中12 ku 和15～25 ku 區(qū)域的Tri a 37 和Tri a 18 含量大大降低，與抗體結(jié)合反應(yīng)隨著發(fā)酵時間的延長而減弱。醇溶蛋白和谷蛋白在25～30 ku 區(qū)域內(nèi)逐漸出現(xiàn)了新的免疫結(jié)合條帶，說明一些免疫肽段可被降解成更小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，但是仍具有抗原性，可能是由于過敏原線性表位仍未被破環(huán)。發(fā)酵過程中面團蛋白組分及蛋白抗原性變化表明，大部分小麥過敏原難以通過發(fā)酵得到降解，Loponen 等[16]和G?nzle[17]的研究指出，酸面團發(fā)酵過程中一部分谷蛋白會被降解成30 ku 左右的醇溶蛋白，這與本試驗結(jié)果相符。發(fā)酵是一種緩慢酶解的過程，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸能將面團的pH 值降至4 左右，可激活面團中主要的蛋白酶（天冬氨酸蛋白酶）分解大分子蛋白。面粉中的內(nèi)源蛋白酶以及乳酸菌中的肽酶等均能起到水解面團蛋白的作用。已有研究表明干酪乳桿菌具有膜蛋白酶，可將體系中的大分子蛋白水解為多肽，膜上的多肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)會將多肽轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，胞內(nèi)肽酶將繼續(xù)水解肽段[3，18]。因此，相比于空白組，添加干酪乳桿菌的面團，小麥蛋白被部分水解。

圖5 干酪乳桿菌MM6 發(fā)酵對過敏原抗原性的影響Fig.5 Effects of Lactobacillus casei MM6 fermentation on wheat allergens

2.5 不同加工方式對干酪乳桿菌降低小麥蛋白抗原性的影響

已有研究表明，加工方式對食物抗原性變化有較強的影響[8-9]，為進一步探究干酪乳桿菌對小麥蛋白抗原性的影響，本試驗中采用不同發(fā)酵方式制作面團后蒸制或烤制，并取樣測定蛋白質(zhì)量濃度及抗原性的變化。由圖6a 和6b 可知，熱加工后蛋白含量降低。已有研究證實，熱加工可使蛋白質(zhì)發(fā)生降解或聚集，導(dǎo)致含量下降[19-20]。由圖6c～e 可知，未經(jīng)熱加工時，干酪乳桿菌添加組并未起到明顯地降低小麥蛋白抗原性的作用（與未添加組相比），可能是由于發(fā)酵作為一種緩慢地發(fā)生方式，體系中的蛋白酶、肽酶需要時間和適宜的環(huán)境發(fā)揮酶解作用降解致敏原蛋白，而本研究所用的3 種發(fā)酵方式時間均相對較短，雖然冷藏發(fā)酵時間較長，但是4℃的低溫并不能使酶充分發(fā)揮作用。經(jīng)發(fā)酵后烘烤處理，部分處理組抗原性略有增高。已有研究證實，烘焙時美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可能會增高小麥蛋白的過敏原性[20-21]。如圖6e所示，經(jīng)冷藏發(fā)酵后蒸制，干酪乳桿菌添加組的抗原性明顯降低（與未添加組相比），可能是由于發(fā)酵降解了部分難溶過敏原，經(jīng)蒸制后，水溶性小分子蛋白發(fā)生聚集，掩蓋了抗原線性表位從而進一步降低了混合發(fā)酵面團的抗原性。如圖6f所示，顏色由紅到綠代表抗原性逐漸降低。僅發(fā)酵、發(fā)酵后蒸制、發(fā)酵后烘烤分別聚成了3 類，然而干酪乳桿菌添加組）與干酪乳桿菌空白組并未聚成2 類，快速發(fā)酵、中種發(fā)酵和冷藏發(fā)酵聚成了2 類，說明干酪乳桿菌作為發(fā)酵種時加工方式對小麥蛋白抗原性的影響大于干酪乳桿菌發(fā)酵。中種發(fā)酵和冷藏發(fā)酵之間無顯著差異但是區(qū)別于快速發(fā)酵。此外，蒸制位于加工聚類圖的最下方，與圖6c 和6d 一致。無論是干酪乳桿菌空白組還是添加組，蒸制都有別于發(fā)酵和烤制，具有更好地降低面團抗原性的能力。在所有處理中，具有顯著優(yōu)勢的是干酪乳桿菌添加組冷藏/中種發(fā)酵后蒸制。

圖6 加工方式對面團蛋白質(zhì)量濃度及抗原性的影響Fig.6 Effects of processing on mass concentration and antigenicity of wheat protein

3 討論

乳酸菌在發(fā)酵過程中通過自身的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)水解相關(guān)蛋白質(zhì)及多肽，并通過產(chǎn)酸改變發(fā)酵面團的pH 值以激活面粉的內(nèi)源性蛋白酶，增加麩質(zhì)蛋白的溶解性，進一步促進蛋白質(zhì)的降解[3，22]。發(fā)酵作為一種天然安全的加工方式，已被很多研究者用來制作品質(zhì)較好的低敏性食物。然而仍需要探索更優(yōu)質(zhì)的菌種及加工方式之間的相互作用規(guī)律，為規(guī)?；?、標準化的生產(chǎn)低敏性食物提供基礎(chǔ)。Rizzello 等[23]、Zannini 等[24]和Rashmi等[25]利用希式乳桿菌、消化乳桿菌、短小乳桿菌和舊金山乳桿菌復(fù)配物發(fā)酵面團，發(fā)現(xiàn)長時間發(fā)酵可以顯著降低面團蛋白的IgE 結(jié)合能力。此外，植物乳桿菌和類食品乳桿菌也被應(yīng)用到低敏性產(chǎn)品——無麩質(zhì)食品的制作中。

本次試驗結(jié)果顯示，干酪乳桿菌發(fā)酵能顯著降低過敏原Tri a 37，Tri a 18，Tri a 36 和Tri a 26 的含量，降低Tri a 37 和Tri a 18 的抗原性。然而，發(fā)酵后產(chǎn)生的一些新的小分子質(zhì)量的條帶仍具有抗原性，推測可能是由于抗原線性表位未被破壞。為進一步探究干酪乳桿菌對小麥蛋白抗原性的影響，采取不同的發(fā)酵方式及熱加工方式處理面團。結(jié)果顯示：中種發(fā)酵和冷藏發(fā)酵對小麥蛋白抗原性的影響無顯著差異但是區(qū)別于快速發(fā)酵；蒸制區(qū)別于發(fā)酵和烤制，具有顯著地降低小麥蛋白抗原性的能力；干酪乳桿菌添加組經(jīng)冷藏或中種發(fā)酵后蒸制，顯著地降低了小麥蛋白的抗原性。得到這種結(jié)果的主要原因可能是：1）長時間的發(fā)酵能使菌種生長充分，有機酸等代謝產(chǎn)物積累，從而充分發(fā)揮自身蛋白水解系統(tǒng)的作用，激活面粉內(nèi)源酶，并增加難溶蛋白的溶解性；2）蛋白質(zhì)受熱后其空間構(gòu)象發(fā)生改變，可能破壞了部分過敏原蛋白的構(gòu)象表位，然而烘烤過程中產(chǎn)生的美拉德產(chǎn)物增強了蛋白的抗原性，此外蒸制過程中水溶性小分子蛋白聚集，掩蓋了抗原線性表位，進一步降低了蛋白的抗原性。

4 結(jié)論

干酪乳桿菌發(fā)酵24 h 能降低小麥中致敏原Tri a 37，Tri a 18，Tri a 36 和Tri a 26 的含量，并降低Tri a 37 和Tri a 18 的抗原性。相比于中種發(fā)酵和冷藏發(fā)酵，快速發(fā)酵對于小麥蛋白的抗原性影響較小；蒸制區(qū)別于發(fā)酵和烤制，具有顯著地降低小麥蛋白抗原性的能力。面團經(jīng)干酪乳桿菌發(fā)酵后蒸制，抗原性得到了進一步的降低，接下來將從復(fù)合加工方式對于小麥蛋白抗原性的影響進一步進行研究。