應(yīng)用TLC-CMS技術(shù)檢測(cè)核桃青皮中二芳基庚烷類化合物

楊衛(wèi)民，杜京旗，王子奇

（呂梁學(xué)院呂梁林果植物化學(xué)省市共建山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西呂梁 033001）

核桃（Juglans regia L.）又稱胡桃，屬于胡桃科核桃屬落葉喬木。核桃青皮為核桃果皮部分，又稱“青龍衣”，含有多種化合物，如醌類、二芳基庚烷類、多酚類、生物堿類、萜類等化合物，具有止痛止痢、祛風(fēng)療癬、清熱解毒等功效。核桃青皮提取物中醌類、二芳基庚烷類、生物堿類等化合物還具有抗腫瘤的活性，成為了現(xiàn)階段核桃青皮研究的重點(diǎn)方向。

二芳基庚烷類化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

核桃青皮中的二芳基庚烷類化合物是一種含有1,7-二芳基庚烷母核的天然化合物的總稱。二芳基庚烷類化合物可根據(jù)其結(jié)構(gòu)劃分為線性二芳基庚烷、內(nèi)環(huán)狀二芳基庚烷、大環(huán)二芳基庚烷3類，大環(huán)二芳基庚烷是比較常見(jiàn)的類型（圖1）。具有廣泛的藥理活性，是核桃青皮中主要的抗腫瘤活性成分，且化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有非常高的研究?jī)r(jià)值，主要存在于許多植物的根部、莖部、表皮、花和果皮等部位。

圖1 二芳基庚烷類化合物結(jié)構(gòu)式

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從核桃青皮中提取分離出其他大量化學(xué)物質(zhì)，具有生物活性物質(zhì)近50種。研究人員采用了BSLB法初步篩選了核桃青皮抗腫瘤活性成分，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物具有較明顯的抗腫瘤活性[1]。周媛媛等人[2]對(duì)核桃青皮中的二芳基庚烷類化合物進(jìn)行了深度研究，并且進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，探索出了5個(gè)二芳基庚烷類化合物。還有研究人員發(fā)現(xiàn)核桃青皮乙醇提取物中有4個(gè)強(qiáng)抗癌活性的環(huán)狀二芳基庚烷類化合物[3-7]。試驗(yàn)以核桃青皮為原料，以75%甲醇為提取劑，經(jīng)微波超聲波組合萃取儀輔助處理，用薄層層析分離純化獲得二芳基庚烷類化合物，應(yīng)用Plate ExpressTM技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)與表征。該技術(shù)可直接從TLC薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點(diǎn)是不經(jīng)過(guò)樣品前處理，可快速?gòu)膹?fù)雜混合物中獲得目標(biāo)物分子質(zhì)量信息，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)器材

材料：胡桃青皮（呂梁當(dāng)?shù)兀?/p>

試劑：甲醇、乙酸乙酯、苯、無(wú)水乙醇均為分析純；色譜甲醇；薄層硅膠板色譜分析板。

儀器：ALB-224型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；XH-300B型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KH-3000Plus型薄層色譜儀，上?？普苌萍加邢薰井a(chǎn)品；Expressions型質(zhì)譜儀、Plate Express TLC-質(zhì)譜接口，美國(guó)Advion公司產(chǎn)品；Tensor-11型傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 核桃青皮中二芳基庚烷類化合物的提取

按料液比（1∶30，M/V）加入75%的甲醇，用微波超聲波萃取儀分為3個(gè)階段進(jìn)行提取，每階段均為10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度分別為40，45，50℃；微波功率分別為100，200，300 MHz；超聲功率分別為850，900，800 W；模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r/min。

甲醇提取液于轉(zhuǎn)速4 000r/min離心3次，每次10 min，合并上清液，收集濾渣。濾渣中加入乙酸乙酯，恒溫振蕩5 h，減壓過(guò)濾3次，獲乙酸乙酯相。在78℃下濃縮至膏狀，甲醇定容至25 mL。

1.2.2 薄層色譜分離純化

用微量進(jìn)樣器吸取25μL的核桃青皮二芳基庚烷樣液，置于全自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)上，設(shè)置點(diǎn)樣參數(shù)（點(diǎn)樣邊距10 mm，點(diǎn)樣間距10 mm，點(diǎn)樣寬度8 mm，點(diǎn)樣數(shù)目5，點(diǎn)樣量為3μL，點(diǎn)樣速度2 s/μL），在10×10硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，共點(diǎn)樣15μL。

以苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V)為展開(kāi)劑，將已點(diǎn)樣硅膠板放入展開(kāi)劑液面高2~3 mm的層析缸內(nèi)，待到展開(kāi)劑前沿距離硅膠板頂端約1 cm處時(shí)，取出晾干。將硅膠板放入薄層色譜成像系統(tǒng)，于波長(zhǎng)365 nm處的紫外光燈下觀察標(biāo)記。

1.2.3 質(zhì)譜檢測(cè)

用色譜甲醇和超純水作為流動(dòng)相。使儀器和軟件處于工作狀態(tài)，將待測(cè)品薄層板置于TLC-質(zhì)譜接口上，使激光對(duì)準(zhǔn)圈出的色譜斑點(diǎn)中心處。用軟件操作進(jìn)行取樣，點(diǎn)開(kāi)譜圖界面對(duì)譜圖進(jìn)行分析并保存。

1.2.4 紅外光譜檢測(cè)

將硅膠板上已標(biāo)記的色譜斑點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)，摳取色譜斑點(diǎn)，甲醇溶解，過(guò)濾。

紅外光譜儀測(cè)量每一個(gè)樣品之前，都需要測(cè)量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細(xì)管點(diǎn)樣至光學(xué)臺(tái)的金剛石上，再進(jìn)行單通道樣品光譜的測(cè)量。每一個(gè)樣品測(cè)量后，都需要進(jìn)行譜圖處理。例如，進(jìn)行氣氛補(bǔ)償，可消除CO2、H2O的干擾，然后將檢測(cè)出來(lái)的光譜轉(zhuǎn)換成倒峰，選擇單峰檢索標(biāo)出每一個(gè)特征峰，保存并進(jìn)行分析。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，記錄高度吻合的條帶。

1.2.5 旋光度和熔點(diǎn)檢測(cè)

設(shè)置自動(dòng)旋光儀至模式2。在參數(shù)（長(zhǎng)度1.0，濃度1.000，復(fù)測(cè)次數(shù)3次，波長(zhǎng)1）下測(cè)定旋光度，計(jì)算平均值。模式1，在參數(shù)（長(zhǎng)度1.0，比旋度設(shè)定為測(cè)量平均值，復(fù)測(cè)次數(shù)3次，波長(zhǎng)1）下測(cè)定比旋度，取平均值。

待提取液完全結(jié)晶后用毛細(xì)管吸取樣液中，高度2~3 mm。然后開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮中二芳基庚烷的提取率

核桃青皮中二芳基庚烷類化合物的提取率見(jiàn)表1。

表1 核桃青皮中二芳基庚烷類化合物的提取率

核桃青皮中二芳基庚烷的提取率：

平均提取率=[(197.0-196.9)/7.2+(197.1-196.9)/7.2+(197.1-196.9)/7.2]×100%÷3=1.6%.

2.2 薄層色譜分離純化與分析

核桃青皮乙酸乙酯相TLC成像圖見(jiàn)圖2。

圖2 核桃青皮乙酸乙酯相TLC成像圖

由圖2可知，核桃青皮乙酸乙酯相在苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V）下，于波長(zhǎng)365 nm處紫外光觀察，展開(kāi)效果良好，出現(xiàn)了5個(gè)色譜斑點(diǎn)，且圖像清晰，色譜斑點(diǎn)之間應(yīng)保持適當(dāng)?shù)拈g距，分離效果良好。5個(gè)色譜斑點(diǎn)自上而下分別用字母A，B，C，D，E標(biāo)記，便于進(jìn)行紅外和質(zhì)譜檢測(cè)與分析。

2.3 質(zhì)譜檢測(cè)與分析

判定該二芳基庚烷類化合物的分子離子峰，根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)將討論范圍劃定到358 m/z左右。分子離子峰需要滿足幾個(gè)必要的條件，即該范圍譜圖內(nèi)的最高質(zhì)量（m/z較大者）的離子。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[2，8]，了解到了二芳基庚烷類化合物的相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。EI-MS給出358[M]+，表明相對(duì)分子質(zhì)量為358。

色譜斑點(diǎn)A質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 色譜斑點(diǎn)A質(zhì)譜圖

由圖3可知，色譜斑點(diǎn)A在358 m/z左右的質(zhì)荷比最高的分子離子峰為361.0，但是二芳基庚烷類化合物不含有氮原子，分子離子峰應(yīng)當(dāng)為偶數(shù)，361為奇數(shù)，所以該結(jié)果不成立。

色譜斑點(diǎn)B質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 色譜斑點(diǎn)B質(zhì)譜圖

由圖4可知，362.0 m/z為該范圍內(nèi)最高質(zhì)量的離子峰。其分子離子峰滿足氮規(guī)則，二芳基庚烷類化合物中不包含氮原子，分子離子峰質(zhì)量數(shù)應(yīng)為偶數(shù)。最后需要判斷其與相鄰碎片離子（m/z較小者）之間的關(guān)系是否合理，分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產(chǎn)生合理的碎片丟失（Δm），Δm=362.0-360.7≈1，表示該化合物在電子的轟擊下打掉了一個(gè)H，為合理丟失。362.0 m/z的離子峰符合這些條件。

色譜斑點(diǎn)C質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 色譜斑點(diǎn)C質(zhì)譜圖

362.0 m/z與文獻(xiàn)中報(bào)道的數(shù)據(jù)358 m/z近似，所以色譜斑點(diǎn)B基本符合二芳基庚烷類化合物的質(zhì)譜特征。

由圖5可知，C條帶在358 m/z左右的質(zhì)荷比最高的分子離子峰為360.7，分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產(chǎn)生合理的碎片丟失，Δm=360-353.3≈7，屬于不合理的碎片丟失。

色譜斑點(diǎn)D質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6。

由圖6可知，D條帶樣品最高分子離子峰為359.6，分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產(chǎn)生合理的碎片丟失，Δm=359.6-349.2≈10，屬于不合理的碎片丟失。

圖6 色譜斑點(diǎn)D質(zhì)譜圖

色譜斑點(diǎn)E質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 色譜斑點(diǎn)E質(zhì)譜圖

由圖7可知，E條帶樣品在358 m/z左右并未出現(xiàn)明顯的離子峰，離子峰大多出現(xiàn)在了370 m/z以上的位置。與文獻(xiàn)所記載的數(shù)據(jù)有很大的偏差，不符合二芳基庚烷類化合物的特征。

2.4 紅外光譜檢測(cè)與分析

依次將色譜斑點(diǎn)A，B，C，D，E用色譜甲醇定容的溶液分別進(jìn)行紅外光譜分析。根據(jù)文獻(xiàn)記載，二芳基庚烷類化合物紅外光譜多在3 300~3 500 cm-1，1 269 cm-1處有羥基的特征吸收峰，在2 931 cm-1和2 858 cm-1處有飽和CH伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，在1 708 cm-1處有羰基特征吸收峰，在1 600 cm-1處、1 500~1 550 cm-1有苯環(huán)的特征吸收峰，在1 070 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰[8]。

色譜斑點(diǎn)A紅外圖譜見(jiàn)圖8。

由圖8可知，A條帶在3 000~3 500 cm-1有明顯的羥基峰，但是其他的特征峰與二芳基庚烷類化合物的紅外光譜特征峰吻合度并不高。

色譜斑點(diǎn)B紅外圖譜見(jiàn)圖9。

圖8 色譜斑點(diǎn)A紅外圖譜

圖9 色譜斑點(diǎn)B紅外圖譜

由圖9可知，色譜斑點(diǎn)B的紅外圖譜與文獻(xiàn)記載最為吻合。斑點(diǎn)B在3 382，1 289 cm-1處出現(xiàn)羥基的特征吸收峰；在2 955，2 925，2 856 cm-1處有飽和CH伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；在1 730 cm-1處有羰基特征吸收峰；在1 590 cm-1處有苯環(huán)的特征吸收峰；在1 073 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰。故判定色譜斑點(diǎn)B可能為二芳基庚烷類化合物。

色譜斑點(diǎn)C紅外圖譜見(jiàn)圖10。

圖10 色譜斑點(diǎn)C紅外圖譜

由圖10可知，C條帶在3 200~3 500 cm-1處有羥基峰出現(xiàn)，但不具備二芳基庚烷類化合物的其他特征峰。

色譜斑點(diǎn)D紅外圖譜見(jiàn)圖11，色譜斑點(diǎn)E紅外圖譜見(jiàn)圖12。

由圖11和圖12可知，D與E條帶的紅外圖譜總體來(lái)說(shuō)很相似，二者圖譜與二芳基庚烷類化合物的特征吸收峰相差甚遠(yuǎn)，吻合度不高。

2.5 二芳基庚烷的旋光度、熔點(diǎn)

使用自動(dòng)旋光儀對(duì)二號(hào)條帶進(jìn)行旋光度和比旋度的測(cè)定。

核桃青皮中二芳基庚烷樣品的旋光度見(jiàn)表2。

圖11 色譜斑點(diǎn)D紅外圖譜

圖12 色譜斑點(diǎn)E紅外圖譜

表2 核桃青皮中二芳基庚烷樣品的旋光度

將3次試驗(yàn)所得出的比旋度、旋光度數(shù)據(jù)取平均值。

平均比旋度=55.365+55.670+56.228/3≈55.754

平均旋光度=0.513+0.581+0.524/3≈0.539

將測(cè)量旋光度和比旋光度后的樣品進(jìn)行結(jié)晶，放置入熔點(diǎn)儀中進(jìn)行熔點(diǎn)的測(cè)定，熔點(diǎn)儀結(jié)果顯示為183℃。則可判定2號(hào)條帶的二芳基庚烷類化合物熔點(diǎn)為183℃。

3 結(jié)論

甲醇-水（3∶1）作提取劑，多級(jí)萃取結(jié)合微波超聲波組合輔助處理從核桃青皮中獲得乙酸乙酯提取液，提取率為1.6%。

核桃青皮樣液在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，以苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V）為最佳展開(kāi)劑，展開(kāi)效果良好；GF254硅膠板在365 nm下，于GoodSsee-20E薄層成像系統(tǒng)中觀察效果良好，5個(gè)色譜斑點(diǎn)清晰。

在展開(kāi)的5個(gè)色譜斑點(diǎn)中，色譜斑點(diǎn)B的分子質(zhì)量（362.0 m/z）與相關(guān)文獻(xiàn)（358 m/z）相近，與相鄰碎片離子之間的關(guān)系合理Δm=362.0-360.7≈1）；在3 382，1 289 cm-1處出現(xiàn)羥基的特征吸收峰，2 955，2 925，2 856 cm-1處有飽和CH伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，1 730 cm-1處有羰基特征吸收峰，1 590 cm-1處有苯環(huán)的特征吸收峰，1 073 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰；比旋度、旋光度、熔點(diǎn)分別為55.754，0.539，183℃。色譜斑點(diǎn)B與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本相一致，可能是二芳基庚烷類化合物[9-15]。

超聲波微波組合萃取儀是集超聲波、微波、溫度等于一體的集合處理系統(tǒng)，對(duì)各個(gè)創(chuàng)新要素和創(chuàng)新內(nèi)容進(jìn)行選擇、集成和優(yōu)化，形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的有機(jī)整體的動(dòng)態(tài)創(chuàng)新過(guò)程。采用了控制一定的溫度，優(yōu)點(diǎn)是條件溫和、易于控制、提取率高、處理時(shí)間短，可提高提取率。

TLC分離、純化技術(shù)能適應(yīng)不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性（如不同極性）的有效成分提供了有利條件。其中，選擇展開(kāi)劑不但要考慮到對(duì)所需成分有良好的溶解性，還要使各個(gè)成分之間分開(kāi)，消除拖尾現(xiàn)象，選擇合適的展開(kāi)劑對(duì)薄層色譜分離純化來(lái)講十分重要。

在紅外檢測(cè)時(shí)，有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)樣品的特征峰與甲醇的特征峰相似的現(xiàn)象，初步推斷出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是甲醇添加過(guò)多，或可能檢測(cè)的物質(zhì)含量過(guò)小，導(dǎo)致其特征峰被甲醇特征峰所掩蓋[16-20]。

質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，存在其他多個(gè)碎片離子峰或者基峰，推測(cè)原因有3個(gè)：其一選擇的離子源不合適，導(dǎo)致打出的碎片雜多；其二在電轟擊過(guò)程中，產(chǎn)生了成倍的碎片離子峰；其三分離純化程度不夠，進(jìn)入質(zhì)譜的樣液尚存在雜質(zhì)。

總之，TLC-CMS-IR聯(lián)用在生物活性物質(zhì)分離純化中具有操作簡(jiǎn)便、容易掌握、回收率高、重現(xiàn)性好、分離效率高、分離量較大等特點(diǎn)[21-23]，有望在標(biāo)準(zhǔn)品的制備、天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究及新藥篩選、評(píng)價(jià)、分析或質(zhì)控需求等領(lǐng)域得到更為廣泛的應(yīng)用。