基于在位光還原銀膠法的核酸堿基快速檢測

申浩 申慧彬

摘要：核酸遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)合成過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對生物遺傳和變異起著關(guān)鍵性作用。核酸堿基多樣性特點決定了堿基反應(yīng)性能，進而發(fā)生生物進化和衰老。組合核酸堿基能夠得到足夠多的信息，是形成高分子生物物質(zhì)的基礎(chǔ)。因此，提出了基于在位光還原銀膠法的核酸堿基快速檢測。制備表面增強拉曼光譜常規(guī)基底，準(zhǔn)備核苷酸、核苷、堿基實驗材料。制備核酸堿基、硝酸銀溶液、銀膠溶液和銀膜，測量拉曼光譜。使用激光誘導(dǎo)獲取銀基質(zhì)，利用NaCIO4分子的CI-O鍵振動作為內(nèi)標(biāo)，分析在位光還原合成銀膠法增強光譜效果。由分析結(jié)果可知，該方法可以獲得高信噪比的表面增強拉曼光譜，且具有良好穩(wěn)定性，在核酸堿基低濃度檢測方面具有實用價值。

關(guān)鍵詞：在位光還原;銀膠法;核酸堿基;檢測

中圖分類號：T0041⁺.7 文獻識別碼：A 文章編號：1001—5922（2021）02—0041—05

0引言

利用焦磷酸序列測定和等位基因特異性擴增方法，可以快速檢測核酸堿基。在DNA鏈擴增和延展過程中，焦磷酸測序是一種基于實時動態(tài)檢測熒光變化以確定核酸序列的技術(shù)。在PCR擴增完成之后，擴增DNA鏈。脫氧核苷酸和4種特殊酶共同參與DNA序列測定，三磷酸腺苷的作用是消除單個脫氧核苷酸，并不與DNA鏈相連，從而避免釋放單個脫氧核苷酸產(chǎn)生的熒光對信號收集造成的影響，根據(jù)熒光未知的DNA序列讀取信號，完成核酸堿基檢測。此方法無需人工操作，可準(zhǔn)確判斷單基突變類型，實現(xiàn)定量檢測。但也存在著僅能測量短序列DNA的問題;利用等位基因特異性擴增的方法，設(shè)計兩種PCR引物，其中一種與目標(biāo)突變體DNA完全互補，或者出現(xiàn)單堿基錯配，另一種是引物設(shè)計正常。反應(yīng)分為兩組實驗，在遇到不匹配的堿基引物時，DNA無法繼續(xù)延伸。如在待測基因型中有突變，則在跑膠后會出現(xiàn)突變擴增帶，而在待測基因型中未發(fā)生突變現(xiàn)象，那么就不會產(chǎn)生擴增帶，通過這兩種現(xiàn)象確定是否存在突變序列。盡管該方法的優(yōu)點是簡單、快速、低成本，但它也存在由于引物只有一個基點，有時會出現(xiàn)放大不正常而導(dǎo)致實驗結(jié)果不準(zhǔn)確的缺陷。

為解決上述問題，提出了一種利用在位光還原銀膠法快速檢測核酸堿基的方法。采用激光誘導(dǎo)光還原法制備銀膠增強基的拉曼光譜信號，并利用拉曼散射增強法對低濃度分子進行檢測。

1表面增強拉曼光譜常規(guī)基底制備

1.1拉曼光譜分析

拉曼光譜能夠反映出分子結(jié)構(gòu)特征，其光譜振動是一個相對薄弱的環(huán)節(jié)，拉曼光譜散射光強通常只有10-10。常規(guī)拉曼光譜的信號強度特別低，激光激發(fā)分子產(chǎn)生拉曼散射信號時，常伴有熒光信號。根據(jù)以上特點，需要對某些物質(zhì)進行增強效應(yīng)研究。

拉曼信號的增強主要有兩種方法：一種是以激光作激勵光源，其波長與被電子測量物質(zhì)的吸收波長相近或相等，從而提高被測量物質(zhì)的拉曼轉(zhuǎn)換概率;另一種是提高分子的拉曼散射截面振動模式，能夠增強拉曼散射信號，這就是所謂的共振拉曼效應(yīng)，但是該效應(yīng)并不具有表面的特異性，并且溶液中的同種物質(zhì)可能嚴(yán)重干擾拉曼光譜增強效果;而表面增強拉曼光譜增強效應(yīng)是一種選擇性增強技術(shù)，可以檢測單分子信號。

1.2常規(guī)基底制備

活化基底的制備一直是表面增強拉曼光譜快速檢測技術(shù)發(fā)展的重要因素，對擴大應(yīng)用效果有重要意義?；谋砻嬖鰪娎庾V效應(yīng)與基底的表面強度有密切關(guān)系，但僅能在少數(shù)基底表面上觀測到。由于對分子的拉曼信號具有很大的增強作用，銀被用作表面增強拉曼光譜底物。在顯微鏡下觀察銀面粗糙度，一般可分為3種類型：①宏觀粗糙度，銀表面的顆粒尺寸在20-500nm之間;②亞微觀粗糙度，銀表面的顆粒尺寸在5～20nm之間;③微觀粗糙度，銀表面顆粒尺寸小于5nm。銀表面顆粒粗糙度大于激發(fā)光波長，將不會引起拉曼譜效應(yīng)，但是還沒有確定最佳表面粗糙度。一般而言，在50-100nm范圍內(nèi)，粗糙度的提高最大，最佳粗糙度的形成是由于吸附原因造成的，其中大多數(shù)是亞微和微細(xì)顆粒的形成。

表面增強拉曼散射效應(yīng)基底應(yīng)具有表面增強效應(yīng)強、基底穩(wěn)定性高、保存期長等優(yōu)點，表面增強拉曼光譜常規(guī)基底制備是表面增強領(lǐng)域的一個重要研究課題。使用金屬溶膠法，其是表面增強拉曼散射活性基底之一，由于其制備工藝簡單，不需特殊處理，存儲方便，增強效果好，所以被選擇作為表面增強拉曼散射基底。目前金屬溶膠的制備通常采用氧化還原、光化學(xué)還原和電化學(xué)還原方法，在這些方法中，氧化還原法最為常用。利用檸檬酸鈉來還原硝酸銀來制備銀膠，該過程也是使用硼氫化鈉來還原硝酸銀，并根據(jù)溶膠基體制備條件，以銀膠為基體，研究了和生物分子表面增強拉曼譜，并在銀基體上檢測到拉曼信號。

核酸堿基是核酸的重要組成成分，從堿基基本組成原子上分析，其主要包括氫、碳、氮、氧等元素，這決定了堿基的多種反應(yīng)性質(zhì)。堿基會發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)，如烷基化，鹵化，反硝化，氰化或加氧。正是因為這些反應(yīng)，像儲存和傳遞信息這樣的生命事件才會發(fā)生。由于核酸堿基種類較多，通過不同組合模式能夠得到足夠多的的信息。

由于堿基類型的多樣性，通過適當(dāng)?shù)慕M合可以得到足夠多信息。

2基于在位光還原銀膠法的核酸堿基快速檢測實驗

2.1實驗材料及準(zhǔn)備

實驗材料選擇如表1所示。

將堿基、核苷及核苷酸固體粉末放置在載玻片上，改善玻璃蓋壓平，并放置在顯微鏡下調(diào)整焦距。借助拉曼光譜儀檢測樣品。

2.2實驗方法

2.2.1核酸堿基、硝酸銀溶液制備與拉曼光譜測量

1）將含有腺嘌呤A、胞嘌呤C、鳥嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶u的核酸堿基溶液注入經(jīng)過凈化系統(tǒng)處理的水中，混合成1×10^-5mol/L溶液。

具體配置流程為：

分別將過量的A、c、G、T、u溶解于5mL水中，將其稀釋成吸收值為0.5-1之間的溶液，根據(jù)核苷酸分子中不同堿基吸光系數(shù)計算飽和溶液，最后將核苷酸分子濃度稀釋，得到1×10^-5mol/L溶液。在稀釋過程中，將各種樣品放置在50%水中溶解一天，能夠完全溶解樣品。

2）硝酸銀溶液制備：將硝酸銀溶液溶于凈化系統(tǒng)處理后的水中，配制成lmol/L溶液，并依次稀釋配制成O.1mol/L，O.01mol/L和0.001mol/L硝酸銀溶液。

3）拉曼光譜測量：將制備的核酸堿基溶液與濃度分別為lmol/L、0.1mol/L、0.01mol/L和0.00lmoYL硝酸銀溶液混合，倒入內(nèi)徑為0.5mm的石英毛細(xì)管之中，使用顯微拉曼光譜儀對樣品檢測，激發(fā)光譜波長為500nm，樣品照射功率為5mW，曝光時間為15s，迭代次數(shù)為15次，由此完成拉曼光譜檢測。

2.2.2銀膠溶液制備與拉曼光譜測量

1）銀膠溶液制備：利用檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O還原硝酸銀制備銀膠溶液，將80mg硝酸銀溶于600mL水中，并加熱到水沸騰，然后將1%C6H5Na3O7·2H2O水溶液沿著杯壁緩慢滴人硝酸銀溶液中，始終保持溶液處于沸騰狀態(tài)。使用攪拌棒快速、持續(xù)攪拌，再靜置90min后取出，并將其放在低溫避光位置處保存?zhèn)溆谩?/p>

在銀膠溶液制備過程中，為了檢測銀膠顆粒，需使用紫外監(jiān)測圖譜，隨著時間變化，最大吸收峰位置發(fā)生改變，峰位先出現(xiàn)向最大吸收峰向長波長方向移動，后又出現(xiàn)向最大吸收峰向短波長方向移動，由此得到大小均勻的銀膠顆粒。為了證明該結(jié)論，需進行掃描電鏡實驗，如果掃描結(jié)果中銀膠顆粒大小在50nm～100nm之間，則說明銀膠顆粒是均勻顆粒。

2）拉曼光譜測量：將1×10^-5mol/L核酸堿基溶液與銀膠溶液混合，倒入內(nèi)徑為0.5mm的石英毛細(xì)管之中，該拉曼光譜測量條件與銀膠溶液制備拉曼光譜測量條件一致。

2.2.3銀膜制備與拉曼光譜測量

1）銀膜制備：使用電子蒸鍍機蒸鍍銀，并將獲得的銀膜低溫避光保存。

2）拉曼光譜測量：為保證核酸堿基溶液制備、硝酸銀溶液制備及銀膠溶液制備拉曼光譜測量堿基一致，需先將1×10^-5mol/L核酸堿基溶液稀釋后直接滴在銀膜表面，再使用顯微拉曼光譜儀對樣品進行拉曼光測量。

3實驗結(jié)果與分析

將O.1mol/L核酸堿基溶液及1×10^-5mol/L核酸堿基溶液混合，放置在激光波長為480nm，功率大小為0.5W激光下照射，充足照射30min后，在lmL吸水池中使用光譜儀對樣品進行紫外可見光掃描，得到的掃描結(jié)果如下。

在銀膠溶液合成過程中，使用光還原方法獲得銀膠溶液，這種方法合成的銀基質(zhì)可以得到高信噪比的表面增強拉曼光譜，因此，使用激光誘導(dǎo)獲取銀基質(zhì)。

將不同濃度硝酸銀和腺嘌呤溶液混合，利用NaCl04分子的C1-O鍵振動作為內(nèi)標(biāo)，研究混合溶液拉曼信號增強效果，如圖1所示。

圖1中：a、b、c、d分別表示0.5mol/L、5mol/L、50mol/L、500mol/L銀離子濃度。在沒有銀離子存在的情況下，由A、c、G、T、u核酸堿基溶液測量拉曼光譜信號較弱，很難發(fā)現(xiàn)特征譜峰。

當(dāng)銀離子濃度升高時，核酸堿基拉曼光譜信號得到了顯著提高，從光譜中可以發(fā)現(xiàn)其有各自峰值。在一定銀離子濃度條件下，核酸堿基混合溶液在激光誘導(dǎo)情況下能夠發(fā)生光反應(yīng)，并制備銀膠體，由此產(chǎn)生拉曼光譜表面增強效果。

為了研究核酸堿基溶液在銀離子作用下拉曼光譜位移變化原因，對腺嘌呤和銀離子混合溶液在激光照射下對拉曼光譜時間依賴性和激光強度依賴性展開分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：在激光強度較低的情況下，拉曼峰值逐漸顯現(xiàn)出來，由此獲得拉曼信號。核酸堿基拉曼信號增強主要原因是當(dāng)銀離子經(jīng)過激光誘導(dǎo)后，被還原成銀顆粒，由此增強核酸堿基拉曼信號。由圖2（b）可知，混合溶液拉曼信號強度和位置都沒有出現(xiàn)明顯變化，足以證明銀離子光還原性表面增強拉曼光譜具有一定穩(wěn)定性。

為了驗證在位光還原銀膠法制備的表面增強譜具有良好穩(wěn)定性，需將拉曼光譜峰值、紫外可見光譜峰值與理論峰值進行對比分析，結(jié)果如表2所示。

由表2可知：在三次迭代次數(shù)下，5種核苷酸分子拉曼光譜峰值與理論峰值基本一致，只是在腺嘌呤1次迭代;胞嘧啶3次迭代;鳥嘌呤2、3次迭代;尿嘧啶1次迭代情況下出現(xiàn)偏差，而在其它迭代次數(shù)下均一致。而紫外可見光譜峰值與理論峰值相差較大，由此可知，在位光還原銀膠法制備的表面增強譜具有良好穩(wěn)定性。

4結(jié)語

對拉曼散射光譜、紫外可見光譜進行了綜合分析，結(jié)果表明，在Ag+溶液體系中，拉曼散射光譜信號增強是由于銀原子的表面增強所致，而這種增強來自于堿基分子的光還原。經(jīng)多次測量，拉曼散射光譜的位置和強度都有較大變化。研究發(fā)現(xiàn)，在位光還原銀膠法制備的表面增強譜具有良好穩(wěn)定性。

核酸堿基的表面增強拉曼光譜檢測還處于較初步的階段，希望能有足夠的時間對其結(jié)構(gòu)影響和核酶變過程進行監(jiān)測。該技術(shù)可以監(jiān)測核酶的切割過程，為核酸堿基結(jié)構(gòu)形成過程中的折疊過程分析提供數(shù)據(jù)支持。