劉 凱，趙星哲，王紅霞，趙書崗，張俊佩，馬慶國，張志華

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，河北 保定 071001；2.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071001; 3.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001；4.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所/國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091）

核桃是世界范圍內占有重要地位的經(jīng)濟類果樹之一，高溫、低溫、重金屬等非生物環(huán)境因素會嚴重影響其正常生長發(fā)育，造成較大的經(jīng)濟損失［1］。晚霜易造成核桃的花芽、嫩梢、花器和幼果受凍，影響產(chǎn)量，嚴重時可使核桃絕收，造成大小年現(xiàn)象。而我國北方地區(qū)，春季周期性寒流是不可避免的。因此，如何防治核桃冷害已成為生產(chǎn)上亟待解決的問題［2］。

GRAS家族是一類僅存在于植物體內的轉錄調控因子，由最初發(fā)現(xiàn)的3個家族成員GAI(gibberellic acid insensitive)、RGA (repressor of GA1-3 mutant)、SCR (scarecrow)的特征字母命名［3］，一般由 400～800 個氨基酸殘基組成，該蛋白的C端是高度保守的［4］，分成8個分支，分別為：SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS和HAM［5］。目前已在桃［6］、鐵皮石斛［7］、甜橙［8］、辣椒［9］等多種植物中發(fā)現(xiàn)GRAS轉錄因子。GRAS家族蛋白在赤霉素(GA)信號轉導［10］、腋芽及根的發(fā)育、光信號通路、結瘤信號轉導及在逆境脅迫中發(fā)揮作用［11］，多項研究表明GRAS轉錄因子家族成員廣泛參與到植物響應非生物脅迫過程中［12-13］，特別是調節(jié)植物抗寒性［14-15］。李麗麗等［16］研究發(fā)現(xiàn)，GRAS轉錄因子LaSCL18基因表達與獨行菜幼苗耐受低溫有關；袁陽陽等［17］以山葡萄為試材，證實了GRAS轉錄因子VaPAT1在調節(jié)植物抗逆的過程中特別是低溫過程起正向調控作用。然而在核桃中GRAS家族成員和核桃抗寒性之間的關系報道較少。本研究通過生物信息學在核桃基因組中挖掘GRAS轉錄因子家族成員，并分析該家族成員理化性質、基因結構、保守基序、進化關系、啟動子區(qū)域結合位點及蛋白功能互作，解析核桃GRAS轉錄因子家族響應低溫脅迫的轉錄因子，研究將為逆境應答過程中GRAS轉錄因子的調控網(wǎng)絡與核桃抗逆分子遺傳改良以及分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料核桃(Juglans regiaL.)種植于河北農(nóng)業(yè)大學標本園，盆栽，同一砧木嫁接‘遼寧8號’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫），2年生苗。用于后續(xù)研究的試驗材料分為正常組(冷處理0 h)和0.5 ℃冷處理48 h。采集第1片復葉中自單葉起左數(shù)第2葉片送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq測序，3株混合后為1次，共3次重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃JrGRAS基因家族分析 根據(jù)TAIR（https://www.arabidopsis.org/）擬 南 芥JrGRAS家族蛋白序列信息應用HMMER 3.1b軟件構建隱馬爾科夫模型，并于NCBI搜索下載核桃蛋白序列（www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/?term=txid51240［orgn］，GCF_001411555.1），并結合轉錄組分析對家族成員進行鑒定。利用歐洲生物信息學研究所的PFAM蛋白質家族數(shù)據(jù)庫分析蛋白保守結構域，利用在線分析工具Gene Structure Display Server和MEME（http://meme-suite.org/）對核桃JrGRAS家族基因進行基因結構和保守基序分析。利用MEGA7.0軟件中的生物進化距離法（Neighbour-Joining, NJ）構建JrGRAS和AtGRASs家族系統(tǒng)發(fā)生樹，Bootstrap值為1 000。

1.2.2 核桃JrGRAS基因的生物信息學分析 利用NCBI上的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffnder/)查找JrGRAS基因家族成員的ORF。蛋白質的理化性質使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站分析；利用NetPhos 3.1 Server和Net NGlyc 1.0 Server分別預測蛋白的糖基化和磷酸化位點；利用 SignalP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線工具對信號肽預測；TMHMM 法分析蛋白質的跨膜區(qū)：基于 HMM 方法（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）的蛋白質跨膜區(qū)預測工具；利用ngLOC與Nuc-PLoc在線軟件預測亞細胞定位；利用STRING在線分析蛋白互作；利用Plantcare在線工具分析基因家族成員啟動子序列功能。

1.2.3 核桃JrGRAS基因家族轉錄表達分析 利用轉錄組分析低溫脅迫48 h后‘遼寧8號’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）轉錄表達分析，以FPKM 為基因表達量衡量標準，以 padj ＜0.05 和log2(golden change ＞0)為篩選差異表達閾值，篩選差異表達基因。

2 結果與分析

2.1 核桃基因組GRAS家族成員鑒定及分析

2.1.1 核桃基因組GRAS家族成員基本信息及理化性質分析 利用擬南芥GRASs家族蛋白序列構建隱馬爾科夫模型，結合RNA-seq分析，初步篩選出79個核桃JrGRASs家族基因。利用Pfam結構域分析，去除冗余后最終獲得62個核桃GRASs家族基因（表1），編碼63條蛋白質序列，根據(jù)分子量大小對其命名。該家族成員中基因長度最短的為1 371 bp（JrGRAS11），最長為5 713 bp（JrGRAS32）；開放閱讀框長度在1 263～ 2 472 bp；翻譯得到的JrGRASs蛋白質的長度處于420 ～ 823個氨基酸之間；等電點在4.77～8.40之間，有97 %核桃JrGRASs家族成員為偏酸性蛋白。

表1 核桃JrGRAS家族成員的基因信息Table 1 Basic information of JrGRAS family genes from walnut

續(xù)表：

利用ExPasy對基因的蛋白大?。╧Da）、穩(wěn)定系數(shù)等、疏水性、等蛋白理化性質進行預測（表2），JrGRASs的分子量在46.92～89.97 kD之間；JrGRASs蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)介于34.43～61.97之間，僅有17%為穩(wěn)定蛋白，其余蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；JrGRASs蛋白的平均疏水性介于-0.626～-0.058之間，其家族蛋白均為親水蛋白；利用 SignalP 3.0 Server在線工具和TMHMM法分析蛋白質的信號肽預測和跨膜結構，結果顯示核桃JrGRASs家族除JrGRAS3、JrGRAS11、JrGRAS16、JrGRAS29、JrGRAS39、JrGRAS50和JrGRAS60外其余各成員無跨膜結構，除JrGRAS12外其余各成員無信號肽分泌蛋白；利用ngLOC和Nuc-PLoc在線軟件預測結果顯示，JrGRASs蛋白均定位于細胞核。

利 用Net NGlyc 1.0和NetPhos 3.1 Server預 測家族成員蛋白的磷酸化位點和糖基化，分析核桃JrGRASs家族成員在蛋白翻譯后修飾的差異有助于后續(xù)對蛋白功能的研究。磷酸化位點結果顯示JrGRASs家族蛋白均含有多個磷酸化位點(表2)，主要體現(xiàn)在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點數(shù)量的差異。其中，絲氨酸磷酸化位點在9～70個之間；蘇氨酸磷酸化位點在3～24個之間；僅JrGRAS5和JrGRAS41不含有絡氨酸磷酸化位點，其余蛋白含酪氨酸磷酸化位點在1～12個之間。通過對核桃JrGRASs家族成員N-糖基化和 O-糖化的潛在位點分析結果顯示，除JrGRAS6、JrGRAS23、JrGRAS30和JrGRAS35外，其余JrGRASs蛋白的N-糖基化潛在位點數(shù)量在1～12個之間；另外核桃JrGRASs蛋白含有3～92個O-糖基化潛在位點。

表2 核桃JrGRAS家族蛋白的理化性質Table 2 Basic information of JrGRAS family genes in walnut

續(xù)表：

2.1.2 核桃基因組GRAS家族成員保守結構域分析 利用NCBI在線分析軟件比對核桃GRAS家族成員的蛋白序列并分析其保守結構域(圖1)，看出核桃 63個家族成員含有典型的LAR1、LAR2、VHIID、PFYRE和SAM 5個保守的結構域，特別是VHIID區(qū)域高度保守，可以看出符合GRAS家族類型特點。

2.2 不同物種GRAS家族進化樹分析

本研究對核桃（63個）、擬南芥（33個）GRAS 家族蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。結果發(fā)現(xiàn)，核桃與擬南芥GRAS家族基因有一定的同源性。根據(jù)擬南芥分類將核桃分為9個亞族，HAM亞族最多，有17個成員，在LS亞組最少，只有1個。根據(jù)進化關系，在核桃中出現(xiàn)了一個新的亞族NEW CLASS，具體功能有待進一步研究。

2.3 核桃基因組GRAS家族基因結構與蛋白域保守結構域

為進一步研究核桃GRAS基因結構進化，首先對其外顯子內含子結構進行分析（圖3）。分析表明，除JrGRAS21、JrGRAS47、JrGRAS62、JrGRAS63，該GRAS家族成員均不含內含子，相同亞組中具有相似的基因結構。隨后，利用 MEME 軟件對這些蛋白序列和結構的保守性進行了分析（圖4）。根據(jù)其保守基序分布，在核桃GRAS家族的63個成員間發(fā)現(xiàn)共同的保守基序，而且不同亞家族內的保守基序分布具有極高的相似度；但HAM亞家族中較其他亞族成員相比，缺少相應的保守基序，即motif 4。

圖 2 核桃和擬南芥GRAS 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of JrGRAS family genes of Juglans regia and Arabidopsis thaliana

圖 3 核桃JrGRAS家族基因結構Fig. 3 Gene structure analysis of JrGRAS family from Juglans regia

2.4 核桃GRAS家族基因啟動子元件分析

利用Plantcare在線分析軟件預測核桃GRAS基因啟動子區(qū)與抗逆和激素相關元件的分布，結合基因結構分析，除無N端基因外，其他基因啟動子區(qū)分析結果如圖5所示，核桃GRAS基因啟動子區(qū)存在豐富的激素信號和脅迫應答調控元件，較多成員含有光響應元件，可能與參與核桃響應非生物脅迫相關。

圖 4 核桃JrGRAS家族蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of JrGRAS family from Juglans regia

圖 5 核桃GRAS啟動子區(qū)與抗逆和激素相關元件分布Fig.5 Distribution of stress-related and hormone-related elements in the promoter region of JrGRAS genes

2.5 核桃GRAS家族蛋白互作預測

利用 STRING 分析該蛋白序列的互作蛋白(表3)，以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參照，發(fā)現(xiàn)該家族成員中的差異表達基因與擬南芥SCR、SCL3、SHR、AT3G13840、PAT、RGL2、AT1G63100、LAS和SCL14同源關系較近，分析結果表明家族成員蛋白成員之間及與其他響應非生物脅迫蛋白和激素相關蛋白之間均可以發(fā)生互作，例如，JrGRAS8蛋白可以與GRAS家族成員HAM互作，JrGRAS14蛋白可以與GRAS家族成員赤霉素相關蛋白GAI蛋白互作；JrGRAS20蛋白與乙烯反應蛋白PLT1互作；JrGRAS39蛋白可以與生長素轉運蛋白BIG蛋白互作；JrGRAS53蛋白與乙烯反應蛋白PLT1互作；JrGRAS41蛋白與介導CBF低溫應激途徑蛋白RGL2互作。通過對核桃GRAS家族蛋白互作預測有助于進一步解析GRAS家族成員作用機制。

表3 核桃GRAS家族蛋白互作信息Table 3 Protein interaction information of JrGRASs

續(xù)表：

2.6 核桃GRAS家族成員轉錄表達分析

利用轉錄組分析低溫脅迫48 h后‘遼寧8號’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）轉錄表達分析，以 FPKM 為基因表達量衡量標準，核桃GRAS家族基因成員均出現(xiàn)了不同程度的變化（圖6、7）。以 padj ＜0.05 and log2(golden change ＞0)為篩選差異表達閾值，發(fā)現(xiàn)在‘遼寧8號’中JrGRAS14、JrGRAS15、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS39、JrGRAS41、JrGRAS48、JrGRAS49、JrGRAS51、JrGRAS59和JrGRAS63為差異表達基因，而在‘清香’中為JrGRAS8、JrGRAS14、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS41、JrGRAS51、JrGRAS53和JrGRAS56。在‘遼寧 8 號’中，除JrGRAS14、JrGRAS15、JrGRAS59和JrGRAS63呈下降表達趨勢外，其他7個基因成員呈上調表達趨勢；在‘清香’中，除JrGRAS8、JrGRAS14、JrGRAS53和JrGRAS56呈下降表達趨勢外，其他4個基因成員在低溫條件下都增大了表達量。在‘遼寧8號’（耐低溫）品種與‘清香’（不耐低溫）品種共同差異表達基因為JrGRAS14、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS41、JrGRAS51和JrGRAS63，但 是 在‘遼 寧8號’（耐低溫）品種特異性差異表達為JrGRAS15、JrGRAS39、JrGRAS48、JrGRAS49、JrGRAS59，在‘遼寧8號’（耐低溫）品種特異性差異表達為JrGRAS53和JrGRAS56。本結果更有助于進一步為GRAS轉錄因子在低溫脅迫中的調控機制研究奠定基礎。

圖 6 低溫脅迫48h后‘遼寧 8 號’DEGs轉錄表達分析Fig.6 Transcriptional expression analysis of DEGs in‘Liaoning 8’after 48 hours of low temperature stress

圖 7 低溫脅迫48h后‘清香’DEGs轉錄表達分析Fig.7 Transcriptional expression analysis of DEGs in‘Qingxiang’ after 48 hours of low temperature stress

3 討論與結論

GRAS是在植物中參與生長發(fā)育和非生物脅迫重要的轉錄因子，而且在植物中廣泛分布。目前在多種植物中已經(jīng)鑒定出GRAS轉錄因子家族，桃48個［6］，甜橙47個［7］，葡萄91個［18］，黃瓜37個［19］等。本研究通過轉錄組學與生物信息學結合鑒定出63個GRAS成員，由62條基因編碼63個蛋白。GRAS結構域通常包含5個保守的結構域，2個亮氨酸七肽重復基序（LRI和LRII）位于以最突出的殘基命名的VHIID基序的側面，LR基序和VHIID基序對于蛋白質或DNA相互起重要作用［20］。利用NCBI在線分析軟件比對核桃GRAS家族成員的蛋白序列并分析其保守結構域看出核桃63個家族成員含有典型 的LAR1、LAR2、VHIID、PFYRE和SAM 5個保守的結構域，可以看出符合GRAS家族類型特點，而且與桃［6］和擬南芥［21］中研究一致，也含有5個保守的結構域。

本研究將核桃和擬南芥GRAS家族蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)擬南芥分類將核桃分為9個亞族，根據(jù)進化關系，在核桃中出現(xiàn)了一個新的亞族NEW CLASS，共7個家族成員，不屬于已知的8個亞族，在桃［6］中也出現(xiàn)了區(qū)別于其他8個亞族的U族類似的現(xiàn)象，具體功能有待進一步研究。進行啟動子功能預測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)核桃GRAS基因啟動子區(qū)存在豐富的激素信號和脅迫應答調控元件［21-22］，且較多成員含有光響應元件，進一步證明了可能與參與核桃響應非生物脅迫。利用 STRING 分析該蛋白序列的互作蛋白，以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參照，發(fā)現(xiàn)該家族成員中的差異表達基因與擬南芥SCR、SCL3、SHR、AT3G13840、PAT、RGL2、AT1G63100、LAS和SCL14同源關系較近，分析結果表明家族成員蛋白與其他蛋白之間均可以發(fā)生互作，而且有研究表明 GRAS家族成員蛋白與響應非生物脅迫相關，尤其在低溫［23］、干旱［15］、鹽［24］等。通過對核桃GRAS家族蛋白互作預測有助于進一步了解GRAS家族成員在核桃體內發(fā)揮的功能。

GRAS蛋白功能呈多樣性，并在不同品種、不同組織和不同生長階段所發(fā)揮的作用不盡相同［25-26］。目前，模式植物擬南芥的GRAS基因家族中的多個亞家族成員的功能已被驗證［27］。本研究將同一砧木嫁接‘遼寧8號’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）進行轉錄表達分析發(fā)現(xiàn)，核桃葉片中有多個GRAS家族成員響應低溫處理14個DEGs，響應情況不盡相同。探索GRAS基因家族在核桃不同品種的表達差異有助于更好地了解其抗性表達，結合生物信息學進一步證實了轉錄組表達分析的準確性。這些研究將為我們解析核桃GRAS基因功能驗證奠定基礎，但具體作用機制有待進一步研究。