杜萍萍，趙穎佳，史桂清，肖 凱

( 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001)

小麥等禾谷類作物生長(zhǎng)過(guò)程中植株經(jīng)常會(huì)遭受干旱逆境脅迫，造成作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成能力的限制［1-2］。提高作物植株對(duì)干旱逆境抵抗能力，對(duì)于促進(jìn)我國(guó)水資源可持續(xù)利用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要實(shí)踐意義。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）通過(guò)與下游基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件（Cis-element）特異性結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率，在增強(qiáng)植株抵御干旱逆境能力中發(fā)揮重要作用［3-4］。近年來(lái)研究表明，核因子Y（NF-Y）是植物種屬轉(zhuǎn)錄因子中的1個(gè)重要家族。該 因 子由NF-YA、NF-YB和NF-YC 3種亞基 組成［5-6］。其中，NF-YA亞基含有1個(gè)負(fù)責(zé)與NFYB/NF-YC結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)特定識(shí)別下游基因啟動(dòng)子區(qū)CCAAT元件的C-末端結(jié)構(gòu)域［7-8］。當(dāng)NF-YB和NF-YC亞基與NF-YA形成三聚體復(fù)合物后，通過(guò)后者識(shí)別下游基因CCAAT元件，與靶基因DNA互作，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄［9-10］。

迄今，有關(guān)NF-Y轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植株生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境防御的研究已有較多報(bào)道。Kumimoto等證實(shí)，擬南芥植株誘導(dǎo)開(kāi)花時(shí)NF-YB3和NF-YB2表達(dá)增強(qiáng)，上述基因參與植株成花特性的調(diào)節(jié)［11］。部分NF-Y亞基通過(guò)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，參與豆科作物植株根瘤形成、始花期、藍(lán)光反應(yīng)和葉綠體發(fā)育的調(diào)控［12-15］。擬南芥NF-YB2和玉米中該基因的同源基因ZmNF-YB2通過(guò)增強(qiáng)干旱逆境下植株光合碳同化和干旱適應(yīng)生理過(guò)程，在介導(dǎo)植株抵御干旱逆境中發(fā)揮重要作用［15］。上述研究表明，NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植株生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境響應(yīng)生物學(xué)過(guò)程。

盡管前人圍繞植物種屬NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子基因分子特征和生物學(xué)功能開(kāi)展了較多研究［12-15］，但迄今有關(guān)小麥該家族基因的功能鑒定仍報(bào)道較少。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期小麥干旱轉(zhuǎn)錄組分析中鑒定的1個(gè)歸屬于NF-YB家族成員（TaNF-YB4）為基礎(chǔ)，對(duì)該基因分子特征、應(yīng)答干旱逆境表達(dá)模式及其介導(dǎo)植株抵御干旱逆境的能力進(jìn)行了鑒定，以期通過(guò)本項(xiàng)研究豐富小麥抗旱分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為今后小麥抗旱遺傳改良和節(jié)水栽培實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TaNF-YB4分子特征分析

作者前期通過(guò)對(duì)小麥干旱脅迫后的根系進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定了1個(gè)歸屬于NF-YB轉(zhuǎn)錄因子家族基因TaNF-YB4（登錄號(hào)：AK457878.1，因其與已報(bào)道植物種屬NF-YB4序列同源予以命名）。利用ExPASY（https://web.expasy.org/protparam/）在線分析工具，對(duì)TaNF-YB4編碼蛋白的分子量（MW）和等電點(diǎn)（pI）進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用DNAMAN生物學(xué)軟件進(jìn)行供試基因編碼蛋白與不同植物種屬同源蛋白保守序列多重氨基酸序列比對(duì)分析。以TaNF-YB4作為對(duì)象進(jìn)行GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）同源查找，獲得與目標(biāo)基因同源的不同種屬基因。采用MEGA 7軟件建立了TaNF-YB4與其植物種屬同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2 TaNF-YB4應(yīng)答干旱脅迫逆境表達(dá)模式鑒定

以小麥品種‘石麥22’為材料，參考實(shí)驗(yàn)室建立的小麥幼苗水培方法（Hoagland營(yíng)養(yǎng)液）培養(yǎng)小麥幼苗至三葉期。然后將幼苗轉(zhuǎn)入含有10%聚乙二醇（PEG-6000）營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行模擬干旱處理。處理1、3、9、27 h后收取根、葉樣本。此外，為鑒定TaNF-YB4表達(dá)對(duì)恢復(fù)處理的響應(yīng)，將部分經(jīng)過(guò)27 h干旱處理的幼苗再度轉(zhuǎn)入正常營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)3 h（R3 h）、9 h（R9 h）和27 h（R27 h）恢復(fù)處理后，分別收獲根、葉樣本。以干旱處理前（0 h）根、葉樣本做對(duì)照。采用TRIzol試劑盒參照說(shuō)明書(shū)提取根、葉樣本RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV進(jìn)行提取RNA中mRNA反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而以轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR的模板。用于擴(kuò)增TaNF-YB4的正向引物為5'- CCATCTCCGTCCATCTCCCTCC，反向引物為5'- TACCTTACACGAGCGAAAGACTG。

1.3 正反義表達(dá)TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系建立

采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建將TaNF-YB4正、反義序列融合至雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301的雙元表達(dá)載體。其中，擴(kuò)增靶基因正義序列引物為5'- AAAAGATCTGATGTCGGAGGCGGTGGGC（正向）和5'- AAAGGTTACCTTACACGAGCGAAAG（反向）；擴(kuò)增靶基因反義序列引物為5'- AAAAGATCTTGGAAAAGGCGTATCTCT（正向）和5'- AAAGGTAACCATCTCCCTCCTAATTA（反向）。參照Sun等［16］的方法建立正、反義表達(dá)TaNF-YB4的煙草轉(zhuǎn)化株系。

1.4 TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系干旱處理下植株形態(tài)性狀鑒定

將野生型對(duì)照（WT）、TaNF-YB4正義表達(dá)典型株系（Sen 1）和反義表達(dá)典型株系（Anti 2）與Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中正常培養(yǎng)。五葉期時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的WT和轉(zhuǎn)化株系幼苗，進(jìn)行正常營(yíng)養(yǎng)液處理（對(duì)照組）和干旱處理（營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)補(bǔ)充5% PEG-6000）。處理期間每5 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。處理4周后用相機(jī)拍照記錄不同處理下各供試材料植株長(zhǎng)勢(shì)。此外，選取處理后代表性WT、正義系和反義系各3株，用葉面積儀測(cè)定植株葉面積后稱取鮮重，再將植株樣本烘干稱重獲得植株干質(zhì)量。

1.5 TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系應(yīng)答干旱的氣孔關(guān)閉特征鑒定

選取代表性WT、正義系和反義系植株，在含有5% PEG-6000營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行干旱處理。利用顯微鏡觀測(cè)處理前對(duì)照（0 h）和處理后不同時(shí)間點(diǎn)（0.25、0.5和1 h）葉片氣孔開(kāi)度。各材料不同處理時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)氣孔樣本數(shù)量均為50個(gè)，以典型氣孔觀測(cè)結(jié)果表示氣孔開(kāi)度特征。

1.6 TaNF-YB4煙草轉(zhuǎn)化株系生理生化指標(biāo)測(cè)定

以正常培養(yǎng)和干旱處理 4 周后WT、Sen 1和Anti 2植株為樣本，參照 guo等的方法測(cè)定光合參數(shù)，包括光合速率（Pn）、胞間 CO2濃度（Ci）、光系統(tǒng) II 光化學(xué)活性 （ΨPSII）和葉綠體光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）［17］。參照Du等的方法測(cè)定可溶蛋白和可溶性糖含量［18］。參照Huang等的方法測(cè)定細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)參數(shù)，包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和過(guò)氧化物酶（POD）活性［19］。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft Excel和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。各測(cè)定數(shù)據(jù)均源于3次測(cè)試重復(fù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaNF-YB4分子特征

TaNF-YB4（登錄號(hào)AK457878）cDNA序列全長(zhǎng)為1 018 bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?11 bp，編碼136個(gè)氨基酸殘基多肽鏈。TaNF-YB4蛋白分子量為14.93 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.65。蛋白保守域預(yù)測(cè)表明，TaNF-YB4蛋白含有1個(gè)NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有的保守H4超家族結(jié)構(gòu)域（圖1A）和核定位信號(hào)區(qū)（aa19～aa83）（圖1B）?；蛳到y(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，在核苷酸水平上，TaNF-YB4與源于油棕、菠蘿、大麥、普通小麥、一粒小麥、水稻和粟等植物的NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子家族基因高度同源（圖1C）。表明上述基因可能具有相似的進(jìn)化途徑。

2.2 TaNF-YB4應(yīng)答干旱脅迫表達(dá)模式

與正常生長(zhǎng)條件下小麥根系和葉片TaNF-YB4相對(duì)較低的轉(zhuǎn)錄水平相比，干旱處理下該基因表達(dá)上調(diào)，在根葉中均表現(xiàn)在干旱處理27 h時(shí)間內(nèi)隨著處理進(jìn)程TaNF-YB4表達(dá)水平不斷增高（圖2）。將干旱處理27 h植株轉(zhuǎn)入正常生長(zhǎng)的恢復(fù)處理后，在根葉該基因的表達(dá)水平下調(diào)，呈隨著恢復(fù)處理進(jìn)程表達(dá)水平不斷降低特征（圖2）。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4轉(zhuǎn)錄呈典型的干旱逆境應(yīng)答模式。

圖 1 TaNF-YB4分子特征Fig. 1 Molecular characterization of TaNF-YB4

圖2 干旱處理下根葉TaNF-YB4表達(dá)模式Fig. 2 Expression patterns of TaNF-YB4 in roots and leaves under drought treatment

2.3 干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系表型和植株生長(zhǎng)特征

正常培養(yǎng)條件下，與野生型對(duì)照（Wild type, WT）相比，TaNF-YB4正義表達(dá)株系（Sen 1）和反義表達(dá)株系（Anti 2）植株長(zhǎng)勢(shì)相近（圖3）。干旱處理下，與WT相比，Sen 1植株長(zhǎng)勢(shì)顯著增強(qiáng)，而Anti 2植株長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱（圖3）。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4在植株響應(yīng)干旱逆境過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)控作用。

圖3 正常生長(zhǎng)和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系植株長(zhǎng)勢(shì)Fig. 3 Growth of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

對(duì)不同處理下轉(zhuǎn)化株系和WT植株形態(tài)學(xué)性狀測(cè)試取得與植株表型特征相吻合結(jié)果。正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)化株系（Sen 1和Anti 2）單株鮮重、干質(zhì)量和葉面積與WT相比無(wú)明顯改變（圖4）。干旱處理下，與WT相比，Sen 1單株鮮重、干質(zhì)量和葉面積顯著增大，而Anti 2上述植株形態(tài)學(xué)性狀則較WT顯著降低（圖4）。

圖4 正常生長(zhǎng)和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系形態(tài)學(xué)性狀Fig. 4 Morphological traits of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

2.4 干旱處理下轉(zhuǎn)化株系葉片氣孔關(guān)閉特征

通過(guò)氣孔顯微觀測(cè)，明確了遺傳轉(zhuǎn)化TaNF-YB4對(duì)干旱處理下氣孔運(yùn)動(dòng)特性的影響。與WT相比，Sen 1株系氣孔在1 h 內(nèi)干旱處理下表現(xiàn)為隨著處理進(jìn)程氣孔關(guān)閉速率加快，在干旱處理0.5～1 h期間其氣孔開(kāi)度明顯小于WT植株（圖5）。

圖5 干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系氣孔關(guān)閉特征Fig. 5 Stomatal closure properties of the TaNF-YB4 transgenic lines under drought treatment

與Sen 1表現(xiàn)相反，Anti 2株系氣孔在1 h內(nèi)干旱處理下表現(xiàn)為隨著處理進(jìn)程氣孔關(guān)閉速率減慢（圖5）。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4通過(guò)調(diào)控植株氣孔在干旱處理下的氣孔關(guān)閉，在一定程度上調(diào)控植株蒸騰和保水能力。

2.5 干旱處理下轉(zhuǎn)化株系光合特性、可溶蛋白和可溶性糖含量

正常處理下，TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系（Sen 1和Anti 2）光合參數(shù)、可溶蛋白及可溶性糖含量與WT相比無(wú)明顯差異（圖6、圖7）。干旱處理下，與WT相比，Sen 1 株系的葉片光合速率和ΨPSII功能、可溶蛋白和可溶性糖含量速率（Pn）以及光系統(tǒng) II光化學(xué)效率（ФPSII）顯著增高，胞間CO2濃度（Ci）和NPQ降低，可溶蛋白和可溶性糖含量增加；Anti 2上述生理參數(shù)的表現(xiàn)則與Sen 1相反（圖6、圖7）。表明TaNF-YB4對(duì)干旱逆境下植株的光合特性和碳氮代謝能力具有重要影響。

圖6 正常生長(zhǎng)和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系形態(tài)學(xué)性狀Fig. 6 Photosynthetic parameters of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

圖7正常生長(zhǎng)和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系可溶蛋白和可溶性糖含量Fig. 7 Soluble protein and sugar contents of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

2.6 干旱處理下轉(zhuǎn)化株系細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)參數(shù)

正常處理下，TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系（Sen 1和Anti 2）SOD活性、CAT活性、POD活性和MDA與WT無(wú)明顯差異（圖8)。

干旱處理下，與WT相比，Sen 1株系上述細(xì)胞保護(hù)酶活性增高，MDA 含量降低；而Anti 2 株系上述細(xì)胞保護(hù)酶活性降低，MDA 含量增高（圖8)。上述結(jié)果表明，TaNF-YB4通過(guò)參與干旱脅迫下細(xì)胞活性氧（ROS）穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，參與植株對(duì)干旱逆境的抵御過(guò)程。

圖8 正常生長(zhǎng)和干旱處理下TaNF-YB4轉(zhuǎn)化株系細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)參數(shù)Fig. 8 Cellular ROS-associated parameters of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

3 討論

NF-Y型轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植株生長(zhǎng)、發(fā)育和非生物逆境響應(yīng)和適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控效應(yīng)［12-15］。其中，部分該家族成員如大豆GmNF-YA3和白楊pdNF-YB7呈干旱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)模式，在介導(dǎo)植株抵御干旱逆境中發(fā)揮重要功能［20,21］。本研究對(duì)歸屬與小麥NF-YB家族基因TaNF-YB4分子特征、應(yīng)答干旱脅迫表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化調(diào)控植株適應(yīng)干旱逆境的功能研究表明，該小麥NF-Y家族成員具有NF-YB蛋白通常具有的保守H4超家族結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)區(qū)，其轉(zhuǎn)錄水平呈干旱誘導(dǎo)模式，表明該轉(zhuǎn)錄因子基因通過(guò)上調(diào)表達(dá)，參與下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與植株適應(yīng)和抵御干旱逆境的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)基因遺傳轉(zhuǎn)化株系抵御干旱逆境能力的鑒定，本研究證實(shí)TaNF-YB4上調(diào)表達(dá)后顯著增強(qiáng)植株抵御干旱逆境的能力。

植株抵御干旱能力的增強(qiáng)，與植株干旱脅迫下維持較高的光合碳同化能力、較強(qiáng)的蛋白和碳水化合物代謝密切相關(guān)［17］。在本研究中，通過(guò)對(duì)干旱處理下的TaNF-YB4正義和反義株系光合參數(shù)、可溶蛋白含量和可溶性糖含量的測(cè)試結(jié)果表明，與野生型對(duì)照（WT）植株相比，正義表達(dá)小麥供試基因典型株系（Sen 1）的光合能力和碳氮代謝能力顯著增強(qiáng)。與此相反，反義表達(dá)TaNF-YB4株系的光合能力和碳氮代謝水平較WT明顯降低。因此，維持較強(qiáng)干旱逆境下植株光合碳同化和碳氮代謝水平，是TaNF-YB4改善植株抵御干旱逆境能力的重要生理基礎(chǔ)。

通過(guò)調(diào)節(jié)植株葉片氣孔開(kāi)閉特性，是減少干旱脅迫下植株蒸騰失水、進(jìn)而增強(qiáng)植株適應(yīng)干旱逆境的重要機(jī)制［18］。研究證實(shí)，部分干旱防御基因通過(guò)脫落酸（ABA）依賴途徑，調(diào)控參與氣孔運(yùn)動(dòng)的ABA相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)干旱逆境下的氣孔關(guān)閉速率［15］。白楊pdNF-YB7提高植株抗旱能力與其調(diào)控氣孔開(kāi)閉及維持逆境下較高細(xì)胞水勢(shì)有關(guān)［22］。本研究表明，TaNF-YB4參與了干旱脅迫下植株氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，正義表達(dá)該基因株系干旱處理下氣孔關(guān)閉速率加快，在減少干旱脅迫下植株水分喪失、維持相對(duì)較高細(xì)胞水勢(shì)，進(jìn)而增強(qiáng)植株抵御干旱脅迫過(guò)程發(fā)揮重要作用。有關(guān)TaNF-YB4調(diào)控的氣孔運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因和生理機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

遭遇干旱脅迫后，植株體內(nèi)誘發(fā)活性氧清除酶的合成，SOD、CAT和POD等細(xì)胞保護(hù)酶活性增強(qiáng)，能有效清除逆境誘發(fā)的活性氧，維持逆境下植株活性氧相對(duì)較低水平及較強(qiáng)的植株代謝功能［21］。本研究對(duì)干旱處理下轉(zhuǎn)化株系的細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)試分析表明，正義表達(dá)TaNF-YB4株系（Sen 1）較WT的細(xì)胞保護(hù)酶（SOD、CAT和POD）活性增強(qiáng)，細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量降低。這表明，TaNF-YB4具有改善干旱逆境下植株活性氧清除能力，緩解細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而改善干旱逆境下植株碳氮代謝、光合碳同化和植株抵御干旱逆境能力。該基因可作為小麥種質(zhì)抗旱能力強(qiáng)弱的重要分子評(píng)價(jià)指標(biāo)。

4 結(jié)論

TaNF-YB4與源于油棕、菠蘿、大麥、普通小麥、一粒小麥、水稻和粟等NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子高度同源。該基因呈干旱脅迫上調(diào)表達(dá)模式，編碼蛋白定位于核內(nèi)。TaNF-YB4正義表達(dá)煙草株系顯著增強(qiáng)的干旱抵御能力，這與其改善干旱逆境下植株光合能力、碳氮代謝、加速氣孔關(guān)閉及改善細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)水平密切相關(guān)。