羅漢參淀粉理化性質及降血糖活性研究

張綿松，賈愛榮，史亞萍，劉雪，趙福江，劉昌衡 *

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103；2.山東省海珍品精深加工技術重點實驗室，山東 濟南 250103；3.中澳特色生物資源產業(yè)技術創(chuàng)新聯合實驗室，山東 濟南 250103）

羅漢參（俗稱香芋），主要種植于魯西南平原地區(qū)，為多年蔓生草本植物，其塊根呈圓球形或不規(guī)則長圓形，長3 cm～5 cm，表皮呈土黃色，上有斷續(xù)的環(huán)狀紋理，肉質潔白細嫩。魯西南地區(qū)居民通常將羅漢參作為藥膳食用，也有少量報道認為羅漢參有預防某些慢性疾病的作用，但相關的現代科學研究報告較少。劉彬[1]研究結果表明，生、熟羅漢參中抗性淀粉的含量均高于土豆、芋頭、地瓜和山藥等4種常見的薯類，另外韓文婷[2]研究表明羅漢參具有降低糖尿病小鼠血糖和改善糖耐量的作用，因此羅漢參可能成為天然抗性淀粉的良好食物來源。

抗性淀粉（resistant starch，RS）可以用來提高食物的纖維含量[3]，根據美國谷物化學家協(xié)會和美國國家科學院醫(yī)學研究所食品營養(yǎng)委員會的定義，RS可以被歸類為一種膳食纖維，RS似乎對人類結腸健康有相當大的好處，但對脂質和葡萄糖代謝的影響較小。此外，在Eerlingen等[4]的研究中，X-射線衍射被用來對RS的結構進行分析，發(fā)現RS是由支鏈淀粉首先形成雙螺旋結構，再由該結構堆積進一步形成B型結晶，此外還包含少量的支鏈淀粉、脂質以及蛋白質，所以RS的化學結構并不同于纖維，仍是淀粉類物質。作為一種新型的食品添加劑，RS具有降低血糖和胰島素的反應，適合肥胖病人和糖尿病人食用，對調節(jié)人體健康起到重要的作用。本研究為拓寬羅漢參淀粉的應用范圍，對其基本的理化性質進行研究，并采用高血糖模型小鼠對羅漢參淀粉的降糖活性進行初步的研究，為羅漢參淀粉在普通食品或輔助降血糖功能食品中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

羅漢參淀粉：山東省科學院生物研究所食品生物技術實驗室自制[5]；SPF級KM小鼠，雄性，體重18 g～20 g（質量合格證號：37009200019058）、基礎飼料、墊料：濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；拜糖平：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；蔗糖：山東東都食品有限公司；膽酸鈉、膽固醇：河南萬邦實業(yè)有限公司；豬油：臨沂新程金鑼肉制品集團有限公司；肝糖原測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；血糖測定試紙：上海羅氏制藥有限公司；鏈脲佐菌素：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；胃蛋白酶（1∶10 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶（26 000 RAU/g）：丹尼斯克（中國）有限公司；葡萄糖淀粉酶（10萬U/mL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3，5-二硝基水楊酸：上海源葉生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

EX124ZHIAD電子天平：美國奧豪斯儀器有限公司；SUPRATM55熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡：德國蔡司公司；HHS21-4-S水浴鍋：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ACCU-CHEK Active血糖測定儀：上海羅氏制藥有限公司；INFINITE 200 PRO酶標儀：瑞士Tecan公司；TU-1810S紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DW-86W100超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；TDL-5-A臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；RVA-TecMaster快速黏度分析儀：瑞典波通儀器公司。

1.3 測定方法

1.3.1 淀粉含量的測定

按照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》的測定方法進行[6]。具體方法為酸水解法，試樣經除去脂肪及可溶性糖類后，其中淀粉用酸水解成具有還原性的單糖，然后按還原糖測定，并折算成淀粉。

1.3.2 抗性淀粉含量測定

改良Goni法[7-8]，具體試驗步驟如下。

1）準確稱取2.000 g樣品，置于250 mL三角瓶中。添加HCl-KCl緩沖溶液（pH值2.0～4.0）20 mL，加入胃蛋白酶20 mg，60℃水浴振蕩1 h，以除去樣品中的蛋白質。

2）取出，冷卻至25℃，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調整pH值至5.4，加入耐高溫α-淀粉酶20 μL，90℃水浴振蕩16 h，酶解糊化狀態(tài)的淀粉為小分子的糊精。

3）加入4倍體積的無水乙醇沉淀，4 000 r/min離心20 min；棄去上清液，沉淀用80%乙醇洗滌3遍，徹底洗去葡萄糖。

4）用4 mol/L KOH溶解沉淀，調整pH值至4.1～4.3，加入葡萄糖淀粉酶 20 μL，40 ℃水解 45 min；沸水浴加熱 5 min；4 000 r/min離心20 min，收集上清液，10 mL蒸餾水洗滌沉淀2次；上清液合并，定容至100 mL。

5）使用 3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定上清液中還原糖含量，在DNS反應中，3，5-二硝基水楊酸與還原糖經過共熱后被還原成棕紅色，在一定范圍內，溶液的顏色與還原糖的含量成正比。測定樣品在540 nm下的吸光值，經過相應的換算，得到還原糖的含量。

6）抗性淀粉含量的計算：還原糖數據乘以0.9即為抗性淀粉質量。

抗性淀粉含量/%=抗性淀粉的質量/總淀粉的質量×100

1.3.3 持水性的測定

稱取1.00 g樣品分散于15 mL蒸餾水中，分別置于45、55、65、75、85℃水浴加熱 30 min，冷卻至 25 ℃后，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，稱沉淀質量[9]。

持水性/%=沉淀質量/樣品質量×100

1.3.4 透明度的測定

取1 g淀粉樣品加水配成1%的淀粉乳液，100℃保溫15min，冷卻至25℃后以蒸餾水為空白測定620nm下的透光率[9]。

1.3.5 膨潤度的測定

取0.50 g的干燥淀粉與25 mL蒸餾水在預先稱重的50 mL離心管中混勻，置于95℃水浴鍋內振蕩30 min。然后在3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，稱量離心后沉淀物質量[9]。按照以下公式計算樣品的膨潤度。

膨潤度/%=離心后沉淀物質量/樣品質量×100

1.3.6 凍融穩(wěn)定性的測定

取一定量的淀粉樣品，配成6%的淀粉乳，100℃加熱20 min，冷卻至25℃，然后-20℃冷凍24 h，取出自然解凍，在5 000 r/min離心15 min，去除上清液，稱重[9]，按照以下公式計算樣品的析水率。

析水率/%=離心后上清液質量/離心前淀粉乳的質量×100

1.3.7 黏度特性的測定

取淀粉樣品3.0000g，置于測定鋁筒內，加25.00mL蒸餾水，用攪拌器槳葉在試樣中上下劇烈攪動10次，然后將樣品置于快速黏度分析儀（rapid viscosity analyzer，RVA）中，攪拌器轉動速度為 160 r/min。RVA初始溫度為50℃保持1 min，然后以12℃/min升高至95℃，在95℃保持2.5 min，再以12℃/min降到50℃保持2.5 min，每測定一個樣品需用時13 min[10-11]。

1.3.8 淀粉的顆粒形態(tài)表征

將經過干燥和良好碾磨后純化的抗性淀粉均勻分布在粘有導電雙面膠的樣品臺面上，真空條件下噴上一層鉑金薄膜，然后固定在載物臺上，置于掃描電子顯微鏡下觀察，并拍攝不同淀粉樣品顆粒的照片[12]。

1.4 實驗方法

1.4.1 高血糖小鼠模型的建立

1.4.1.1 高脂高糖飼料配方（100 kg）及制作方法

小鼠基礎飼料66.5 kg、蔗糖20 kg、膽酸鈉1 kg、豬油10 kg、膽固醇2.5 kg[13]。具體制作方法為：基礎飼料粉碎過篩，混入干料，然后拌入豬油，加適量水壓入塊狀模具，成型后倒出，50℃干燥后直接飼養(yǎng)試驗小鼠。

1.4.1.2 鏈脲佐菌素注射造模

在適應性飼喂1～2周之后，選擇所要造模的KM小鼠，禁食不禁水16h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素（1%，醫(yī)用生理鹽水注射液配制，現配現用，避光）45 mg/kg BW空白對照組注射等劑量醫(yī)用生理鹽水注射液。

1.4.1.3 造模成功的判斷

繼續(xù)喂養(yǎng)1周～2周后，禁食3h采集鼠尾血用血糖測定儀測定小鼠的空腹血糖值，根據保健食品輔助降血糖功能評價方法中的規(guī)定，空腹血糖值10 mmol/L～25 mmol/L為高血糖模型成功動物，將造模成功小鼠和未成功小鼠分開標記飼養(yǎng)，以備下一步實驗分組。

1.4.2 實驗分組

將實驗用高血糖模型小鼠和正常KM小鼠進行隨機分配，一共分為4組：空白對照組（正常小鼠25只，喂養(yǎng)普通飼料）；模型對照組（高血糖模型小鼠25只，喂養(yǎng)普通飼料）；抗性淀粉組（高血糖模型小鼠25只，喂養(yǎng)含羅漢參淀粉飼料）；陽性對照組（高血糖模型小鼠25只，除了喂養(yǎng)普通飼料之外，每天灌胃一次拜糖平溶液，劑量為24.9 mg/kg BW）。

1.4.3 含羅漢參淀粉的飼料配方及制作方法

羅漢參淀粉10%，基礎飼料88%，另外為了防止淀粉的增加，減少飼料中蛋白質的含量，補充2%酪蛋白到飼料中以平衡飼料中蛋白質供給量。制作方法同1.4.1.1。

1.4.4 動物實驗方法

在標記分組之后，動物實驗正式開始，30 d后尾部取血，采用試紙法測定各組小鼠的空腹血糖值，然后脫頸處死，立即進行解剖，取出肝臟，稱重后勻漿-80℃凍存，按照肝糖原試劑盒上的方法進行操作測定肝糖原含量。

1.5 統(tǒng)計分析

計量資料以均數±標準差表示，均使用SPSS軟件統(tǒng)計分析。若計量資料的方差齊，采用單因素方差分析最小顯著性差異法檢驗進行組間比較；若計量資料的方差不齊，采用單因素方差分析檢驗，p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 抗性淀粉含量、透明度、膨潤度、凍融穩(wěn)定性

羅漢參淀粉和玉米淀粉的抗性淀粉含量、透明度、膨潤度和凍融穩(wěn)定性測定結果見表1。

表1 羅漢參淀粉與玉米淀粉的部分理化指標比較Table 1 Comparison of some physicochemical properties between Luohanshen starch and corn starch

從表1可以看出，羅漢參淀粉在透明度和膨潤度明顯優(yōu)于同濃度的玉米淀粉；而兩者在衡量凍融穩(wěn)定性的析水率方面沒有顯著性差異。

2.2 黏度特性

RVA儀測定結果見圖1和圖2。

圖1 羅漢參淀粉的RVA譜圖Fig.1 RVA spectrum of Luohanshen starch

圖2 玉米淀粉的RVA譜圖Fig.2 RVA spectrum of corn starch

數據表明，羅漢參淀粉的糊化溫度79.15℃、峰值黏度4 097 cP、保溫黏度2 266 cP、最終黏度3 315 cP、衰減值18 31 cP、回生值1 049 cP。玉米淀粉的糊化溫度78.25℃、峰值黏度3 062 cP、保溫黏度2 254 cP、最終黏度3 544 cP、衰減值808 cP、回生值1 290 cP。羅漢參淀粉的糊化溫度、保溫黏度均大于玉米淀粉，說明羅漢參淀粉比玉米淀粉難糊化，且黏度穩(wěn)定性較好。糊化溫度與淀粉的直鏈淀粉含量、分支的長短以及結晶的致密程度等因素都顯著相關，一般直鏈淀粉含量低、淀粉顆粒較大、結構比較疏松的淀粉較容易糊化[14]。淀粉糊在達到低谷黏度后，隨著溫度的繼續(xù)下降，淀粉糊發(fā)生老化、回生現象。淀粉分子之間經氫鍵連接，重新締合行程聚集體，導致淀粉糊黏度再次升高，達到最終黏度。羅漢參淀粉的最終黏度和回生值均比玉米淀粉的低，說明羅漢參淀粉在降溫階段的穩(wěn)定性比玉米淀粉好，不易老化。

2.3 持水性

羅漢參淀粉與玉米淀粉持水性比較見圖3。

圖3 羅漢參淀粉與玉米淀粉持水性比較Fig.3 Comparison of water holding capacity between Luohanshen starch and corn starch

淀粉分子在水中形成親水性膠體，隨著溫度的升高，淀粉分子逐漸糊化斷裂，生成更多氫鍵[10]。羅漢參淀粉在45℃～75℃的溫度區(qū)間里，持水性趨勢大致相同，但是在接近它們的糊化溫度時，也就是在75℃～85℃的溫度區(qū)間里，羅漢參淀粉的持水性超過玉米淀粉，這是因為淀粉糊化過程大量吸水的緣故。最終在85℃的條件下，玉米淀粉的持水性在900%左右，而羅漢參淀粉的持水性超過1 400%。

2.4 微觀結構

羅漢參淀粉顆粒形態(tài)見圖4。

圖4 羅漢參淀粉顆粒形態(tài)Fig.4 Morphology of Luohanshen starch granule

淀粉植物來源不同，顆粒大小和形貌也會相異，淀粉顆粒結構有單粒、復粒，淀粉顆粒與淀粉來源在形貌上具有相似性[15]。電鏡圖片顯示羅漢參淀粉的顆粒形狀為橢圓形，與羅漢參的外形相似，淀粉顆粒大小約為3 μm～8 μm。1 000倍的電鏡圖顯示羅漢參淀粉顆粒呈不規(guī)律的團聚狀態(tài)。

2.5 羅漢參淀粉體內降血糖活性

喂養(yǎng)4周后實驗各組小鼠的血糖值變化如圖5。

圖5 各組小鼠的血糖值的變化Fig.5 The column diagram of blood glucose value changes in each group

從圖5可以看出，在第0周，陽性對照組、模型對照組、羅漢參淀粉組的小鼠血糖均值在11 mmol/L左右，空白對照組試驗小鼠的平均血糖值為8 mmol/L，陽性對照組、模型對照組、羅漢參淀粉組的小鼠血糖值與空白對照小鼠的血糖值差異極顯著（p＜0.01）。4周之后，測定的血糖值顯示，陽性對照組和羅漢參淀粉組的小鼠血糖值較第0周的血糖值出現明顯下降，而模型對照組和空白對照組的小鼠血糖值均略有上升。另外，第4周陽性對照組和羅漢參淀粉組的血糖值與模型對照組的血糖值差異極顯著（p＜0.01），且均低于模型對照組小鼠血糖值，說明羅漢參淀粉有助于控制小鼠血糖值。

在喂養(yǎng)4周之后，實驗各組小鼠的肝糖原的組間比較如圖6。

圖6 4周后各組小鼠肝糖原含量比較Fig.6 The column diagram of liver glycogen content in each group after four weeks

II型糖尿病患者的一個特點是肝葡萄糖輸出量持續(xù)增加，以及胰島素抵制作用，所以肝糖原含量與糖尿病有著密切的聯系，肝臟組織中的肝糖原含量的變化可有效反映出機體對于胰島素含量的敏感程度[16]。從圖6中可以看到，模型對照組的模型小鼠的肝糖原含量與空白對照組的正常小鼠的肝糖原含量具有顯著差異（p＜0.05）。模型小鼠的胰島素的分泌受到了藥物的干擾，肝糖原含量的波動正是胰島素含量變化的表征。然而飼養(yǎng)含羅漢參淀粉的飼料，使得羅漢參淀粉組的小鼠的肝糖原含量在4周后與空白對照組的小鼠肝糖原含量基本一致（p>0.05）。

3 結論

經與玉米淀粉進行對比研究，羅漢參淀粉在抗性淀粉含量、透明度、膨潤度、糊化溫度、降溫階段穩(wěn)定性、持水性等指標均高于玉米淀粉，具有較好的加工特性；以高血糖模型小鼠為評價模型，血糖值和肝糖原含量為指標，討論羅漢參抗性淀粉對高血糖模型小鼠的降血糖作用。實驗結果表明：在喂養(yǎng)羅漢參淀粉4周后，高血糖模型小鼠的血糖值得到明顯降低，且肝糖原含量與正常小鼠的肝糖原保持一致。由此可以推斷，在日常飲食中加入羅漢參淀粉，可以有效改善高血糖病人的血糖值和肝糖原含量等指標，所以羅漢參淀粉是高血糖人群良好的碳水化合物來源。