河北省黑木耳主產(chǎn)區(qū)5種黑木耳的功能性成分及抗氧化性研究

馬欣欣，王晨，楊林英，楊嘉雪，張鐵軍，王謙*

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)院，河北 保定 071000；2.承德市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，河北 承德 067000）

黑木耳（Auricularia auricula）又名光木耳，云耳，細(xì)木耳，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳屬（Auricularia），是我國(guó)珍貴的食藥兼用菌類[1]。黑木耳具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，不僅含有豐富的黑木耳多糖，還含有多酚和黃酮等功能性成分及 Ca、Mg、Fe、Mn 等微量元素[2-4]。有關(guān)研究表明，黑木耳具有抗凝血、提高人體免疫力、抗氧化和延緩衰老、降低血液膽固醇、抗菌作用等多種功能活性[5-9]。近年來，我國(guó)黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為我國(guó)栽培量第二大的食用菌品種，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全國(guó)黑木耳產(chǎn)量達(dá)751.85萬噸，約占全國(guó)食用菌總產(chǎn)量的20.25%[10]。黑木耳栽培規(guī)模的快速提升帶來的初級(jí)產(chǎn)品的流通壓力，必然帶來其高附加值食品資源化開發(fā)利用的技術(shù)需求。

黑木耳中含有多糖、黃酮及多酚等多種抗氧化的活性成分，可調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，抑制活性氧自由基，從而減少機(jī)體的損傷和疾病的發(fā)生。在黑木耳的特色食藥加工方面，徐田輝等[11]將木耳粉添加到曲奇制作過程中，通過控制配料的添加量，獲得了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的風(fēng)味曲奇餅干；何靜仁等[12]發(fā)明公開了一種含有黑木耳成分治療糖尿病及高血脂癥的藥品，可使用者擺脫使用化學(xué)藥物降糖所帶來的副作用；秦丹丹等[13]以黑木耳黑枸杞為原料研發(fā)出了一種復(fù)合飲料，并證明了復(fù)合飲料具有良好的抗氧化活性。本文對(duì)相同條件下培養(yǎng)的5個(gè)黑木耳品種的子實(shí)體進(jìn)行部分功能性成分的相關(guān)檢測(cè)分析及抗氧化活性比較，為河北省黑木耳主產(chǎn)區(qū)品比研究及高附加值食品的開發(fā)利用提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用樣品均來自河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)食用菌產(chǎn)業(yè)體系黑木耳產(chǎn)業(yè)企業(yè)試驗(yàn)站-承德雙承生物有限公司。

5個(gè)黑木耳樣品分別為：黑威15、黑山、青灰小碗、黑厚圓、黑雜19。所用樣品均為相同栽培基質(zhì)下的春耳。

試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的三級(jí)水；乙醇、蘆丁、硫酸、葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、沒食子酸、福林酚試劑：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉、2，2′-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2′-hydrazine-bis（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）：北京索萊寶生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、VC：福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（JJ224BC）：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；LD4-2高速離心機(jī)：鄭州博科儀器設(shè)備有限公司；渦旋振蕩器（WH-861）：常州市華怡儀器制造有限公司；恒溫振蕩器（DLHR-Q200）：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；超聲清洗器（KH-5200B）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；722型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速多功能粉碎機(jī)（Q-400B3D）：上海冰都電器有限公司；恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳浸提物的制備

采摘新鮮的黑木耳樣品，在50℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，然后在高速粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過50目篩，將處理后的黑木耳粉放于干燥容器中備用[14]。

準(zhǔn)確稱取3.000 g黑木耳粉放入250 mL錐形瓶中，按1∶25（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液，在頻率40 kHz、功率200 W、溫度55℃的條件下超聲振蕩浸提30 min；過濾后將料液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，回流提取1 h；接著進(jìn)行抽濾，先用提取劑潤(rùn)洗抽濾瓶和布式漏斗，放置濾紙，將冷卻后的料液倒入，抽濾后定容，測(cè)定浸提液中粗多糖、黃酮及多酚含量。將上述剩余浸提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到黑木耳浸提物，將浸提物用75%的乙醇溶液配成不同的質(zhì)量濃度，測(cè)定抗氧化活性。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 粗多糖含量測(cè)定

黑木耳浸提液中粗多糖含量的測(cè)定采用苯酚硫酸法。參考文獻(xiàn)[15]制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以去蒸餾水為空白對(duì)照，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=7.151 4X+0.005 8，回歸系數(shù)R2=0.999 2。精確量取1.0 mL樣品溶液，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同的方法計(jì)算樣品中粗多糖含量。

1.3.3 黃酮含量測(cè)定

黑木耳浸提液中黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法。參考文獻(xiàn)[16]制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，以無水乙醇為空白對(duì)照，于508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.011 3X-0.011 7，回歸系數(shù)R2=0.998 9。精確量取1.0 mL樣品溶液，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同的方法計(jì)算樣品中黃酮含量。

1.3.4 多酚含量測(cè)定

黑木耳浸提液中多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu比色法。參考文獻(xiàn)[17]制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蒸餾水為空白對(duì)照，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.108 4X+0.031 1，回歸系數(shù)R2=0.999 1。精確量取1.0 mL樣品溶液，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同的方法計(jì)算樣品中多酚含量。

1.3.5 ABTS+·清除率測(cè)定

將黑木耳浸提物配成不同質(zhì)量濃度（1 mg/mL～6 mg/mL）的樣品溶液備用。配得ABTS儲(chǔ)備液：將7 mmol/L的ABTS與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合均勻；在使用前用無水乙醇將儲(chǔ)備液稀釋為在734 nm波長(zhǎng)下吸光度2.00±0.10的ABTS工作液。取3 mL ABTS工作液與0.3 mL樣品溶液，室溫（25℃）下反應(yīng)6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)得吸光度為Ax[18-19]；每個(gè)濃度平行試驗(yàn)3次，取平均值，根據(jù)公式（1）計(jì)算黑木耳不同質(zhì)量濃度浸提物對(duì)ABTS+·的清除率。

式中：Ax為樣品溶液中加入各工作液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；Ax0為蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.6 DPPH·清除率測(cè)定

參考Zhou等[20]的方法稍作修改，將黑木耳浸提物配成1 mg/mL～8 mg/mL的樣品溶液備用，分別取2 mL樣品溶液放于具塞試管中，各加入2 mL 100 μmol/L DPPH工作液，放于25℃恒溫箱中避光培養(yǎng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)得吸光度為Ay，每個(gè)濃度平行試驗(yàn)3次，取平均值，根據(jù)公式（2）計(jì)算黑木耳不同質(zhì)量濃度浸提物對(duì)DPPH·的清除率。

式中：Ay為樣品溶液中加入各工作液的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品溶液的吸光度；Ay0為無水乙醇代替DPPH工作液的吸光度。

1.3.7 還原力檢測(cè)

參考邱軍強(qiáng)等[21]的方法稍作修改，將黑木耳浸提物配成不同質(zhì)量濃度（2 mg/mL～10 mg/mL）樣品溶液，取1 mL的樣品溶液與1 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）和 1 mL 1%鐵氰化鉀 K3Fe（CN）6溶液混合均勻，在50℃條件下孵化20 min，冷卻后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻，取2 mL的混合液和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后迅速在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)得吸光度為Az，每個(gè)濃度平行試驗(yàn)3次，取平均值，根據(jù)公式（3）計(jì)算黑木耳不同質(zhì)量濃度浸提物的相對(duì)還原能力。

式中：Az為樣品溶液中加入各工作液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；AVC為VC溶液（0.25 mg/mL）代替樣品溶液的吸光度。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0軟件中Duncan式新復(fù)極差法，進(jìn)行差異顯著性分析；采用origin9進(jìn)行數(shù)據(jù)處理繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳功能性成分

2.1.1 子實(shí)體粗多糖含量對(duì)比結(jié)果

黑木耳子實(shí)體粗多糖含量對(duì)比結(jié)果見表1。

表1 黑木耳子實(shí)體粗多糖含量對(duì)比結(jié)果Table 1 Comparison of crude polysaccharide content in fruit body of Auricularia auricula

由表1可知，不同黑木耳品種中粗多糖含量不同。在5種黑木耳子實(shí)體中，粗多糖介于7.52 g/100 g至10.39 g/100 g，其中黑厚圓粗多糖含量最高達(dá)到10.39 g/100 g，與其它4個(gè)黑木耳品種中粗多糖含量產(chǎn)生了極顯著性差異（P<0.01），青灰小碗與黑山中粗多糖含量差異不顯著（P>0.05），黑山與黑雜19之間差異也不顯著（P>0.05），其它4個(gè)黑木耳品種的黑威15中粗多糖含量相對(duì)較少為（7.52±0.26）g/100 g。

2.1.2 子實(shí)體黃酮含量對(duì)比結(jié)果

黑木耳子實(shí)體黃酮含量對(duì)比結(jié)果見表2。

表2 黑木耳子實(shí)體黃酮含量對(duì)比結(jié)果Table 2 Comparative results of flavonoids content in fruit body of Auricularia auricula

由表2可知，不同黑木耳品種中黃酮含量存在差異。在5種黑木耳子實(shí)體中，黃酮含量介于3.61mg/100 g至5.92 mg/100 g，其中黑山黃酮含量最高為5.92 mg/100 g，與其他4個(gè)黑木耳品種產(chǎn)生了極顯著性差異（P<0.01），其它4個(gè)黑木耳品種的黃酮含量由多到少依次為青灰小碗、黑厚圓、黑威15、黑雜19，分別為5.08、4.68、4.26、3.61 mg/100 g。

2.1.3 子實(shí)體多酚含量對(duì)比結(jié)果

黑木耳子實(shí)體多酚含量對(duì)比結(jié)果見表3。

表3 黑木耳子實(shí)體多酚含量對(duì)比結(jié)果Table 3 Comparison of polyphenol content in fruit body of Auricularia auricula

由表3可知，不同黑木耳品種多酚含量存在一定差異，黑威15與其它4個(gè)品種多酚含量出現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01），黑山和青灰小碗多酚含量差異不顯著（P>0.05），黑厚圓和黑雜19多酚含量差異也不顯著（P>0.05）。5種黑木耳子實(shí)體多酚含量介于1 025.59 mg/100 g至1 309.87 mg/100 g，黑威15多酚含量最多為1 309.87 mg/100 g，其它4個(gè)黑木耳品種的多酚含量由多到少依次為黑山、青灰小碗、黑厚圓、黑雜 19，分別為 1 132.90、1 103.08、1 042.37、1 025.59 mg/100 g。

2.2 黑木耳抗氧化活性

2.2.1 ABTS+·清除率

黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)ABTS+·的清除率見圖1。

圖1 黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)ABTS+·的清除率Fig.1 Scavenging rate of extracts from Auricularia auricula fruit body on ABTS cation free radical

ABTS+·是由過硫酸鉀氧化ABTS+產(chǎn)生的一種自由基，當(dāng)體系中存在氫供體的抗氧化劑時(shí)，ABTS+·就會(huì)因?yàn)榘l(fā)生還原反應(yīng)而褪色。由圖1可知，不同品種黑木耳浸提物的濃度與ABTS+·清除率存在著量效關(guān)系，在樣品溶液的質(zhì)量濃度為0～6 mg/mL范圍內(nèi)，5種黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)ABTS+·的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加逐漸提高。在樣品質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，黑山對(duì)ABTS+·的清除率為最大即85%，黑雜19對(duì)ABTS+·的清除率最小為70%。采用半數(shù)抑制率（IC50）定義為清除自由基達(dá)50%時(shí)的樣品濃度，5種黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)ABTS+·的清除能力的IC50大小依次為：黑山（IC50=2.246 mg/mL）<黑威 15（IC50=2.509 mg/mL）<青灰小碗（IC50=2.988 mg/mL）<黑厚圓（IC50=3.148 mg/mL）<黑雜 19（IC50=3.524 mg/mL）。

2.2.2 DPPH·清除率

黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)DPPH·的清除率見圖2。

圖2 黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)DPPH·的清除率Fig.2 DPPH·free radical scavenging rate of extracts from Auricularia auricula fruit body

DPPH·在有機(jī)溶劑中可穩(wěn)定存在，溶于乙醇溶液后呈紫紅色，且在517 nm處有最大吸收，當(dāng)體系中的抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)時(shí)，顏色變淺，逐漸變?yōu)榈S色，吸光度也逐漸減小，可通過測(cè)定溶液的吸光度來判斷其清除自由基的效果。由圖2可知，在樣品溶液的質(zhì)量濃度為0～7 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品對(duì)DPPH·的清除率也逐漸提高，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到7 mg/mL之后，樣品對(duì)DPPH·的清除率增加緩慢。在樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，黑山對(duì)DPPH·的清除率達(dá)由大到小依次為黑山>黑威15>青灰小碗>黑厚圓>黑雜19。5種黑木耳子實(shí)體浸提物對(duì)DPPH·的清除能力的IC50大小依次為：黑山（IC50=4.693 mg/mL）<黑威 15（IC50=4.992 mg/mL）<青灰小碗（IC50=5.389 mg/mL）<黑厚圓（IC50=5.694 mg/mL）<黑雜 19（IC50=5.882 mg/mL）。

2.2.3 還原力

黑木耳子實(shí)體浸提物的還原力見圖3。

圖3 黑木耳子實(shí)體浸提物的還原力Fig.3 Reducing power of extracts from Auricularia auricula fruit body

還原能力的測(cè)定是根據(jù)鐵氰化鉀與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)，生成亞鐵氰化鉀，再加入三價(jià)鐵離子與亞鐵氰化鉀反應(yīng)，生成的藍(lán)色物質(zhì)在700 nm處有較強(qiáng)的吸收，吸光度越大，樣品還原能力越強(qiáng)。由圖3可知，在質(zhì)量濃度0～8 mg/mL范圍內(nèi)，5種黑木耳子實(shí)體的還原力隨著浸提物質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)濃度超過8 mg/mL時(shí)，還原力隨著濃度的進(jìn)一步增大變化趨勢(shì)變小。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，5種黑木耳子實(shí)體浸提物還原力最強(qiáng)的是黑山達(dá)到88%，其次是黑威15還原力為80%，黑雜19還原力相對(duì)較低為72%。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，在河北省主產(chǎn)區(qū)相同環(huán)境條件下栽培的5種黑木耳子實(shí)體粗多糖、黃酮、多酚含量及抗氧化活性存在一定差異。5個(gè)黑木耳品種子實(shí)體中粗多糖含量7.52 g/100 g～10.39 g/100 g，黃酮含量3.61 mg/100 g～5.92 mg/100 g，多酚含量 1 025.59 mg/100 g～1 309.87mg/100g。粗多糖含量最高的品種為黑厚圓，黃酮含量最高的品種為黑山，多酚含量最高的品種是黑威15，表現(xiàn)出生物多樣性中種水平上生物活性物質(zhì)含量的多樣性。5個(gè)黑木耳品種子實(shí)體浸提物均具有有效的自由基清除能力和還原力，黑山的抗氧化性表現(xiàn)最強(qiáng)，其次為黑威15、青灰小碗、黑厚圓、黑雜19。黑木耳子實(shí)體浸提物中還含有除粗多糖、黃酮及多酚以外的有關(guān)抗氧化成分的活性物質(zhì)，在以后的試驗(yàn)中應(yīng)繼續(xù)深入研究。該項(xiàng)研究也為本崗位團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)的河北省黑木耳產(chǎn)業(yè)體系工作提供了技術(shù)支撐，同時(shí)，對(duì)河北省黑木耳高附加值食品的技術(shù)創(chuàng)新具有現(xiàn)實(shí)意義。