不同規(guī)格鹿茸飲片的多指標質(zhì)量等級評價△

郭曉晗，程顯隆，柳溫曦，李明華，魏鋒，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

鹿茸是傳統(tǒng)名貴的動物藥，《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版一部鹿茸片項下只規(guī)定其炮制方法為“取鹿茸，燎去茸毛，刮凈，以布帶纏繞茸體，自鋸口面小孔灌入熱白酒，并不斷添酒，至潤透或灌酒稍蒸，橫切薄片，壓平，干燥”[1]，對鹿茸片的規(guī)格無明確的劃分。實際上，市場上的鹿茸片常分為蠟片、粉片、砂片、血片和骨片等[2-4]?！吨腥A人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準》NY/T1162—2006[5]雖對鹿茸片的規(guī)格進行了劃分，但農(nóng)業(yè)農(nóng)村部標準理化測定指標較少，只對不同規(guī)格等級鹿茸片的總氨基酸和鈣的含量進行規(guī)定。鹿茸飲片質(zhì)量等級標準不完善，導致難以對鹿茸產(chǎn)品進行有效的質(zhì)量控制和評價，市場中出現(xiàn)的易混品、劣品與偽品[6-8]，更給市場監(jiān)管帶來挑戰(zhàn)。面對鹿茸片質(zhì)量等級混亂問題，根據(jù)其傳統(tǒng)應用及化學成分特點，建立多指標的綜合質(zhì)量評價體系顯得尤為重要。

近年來，學者們對鹿茸的化學成分的一系列研究表明，其成分復雜多樣，主要成分是蛋白質(zhì)和氨基酸，還包括激素、脂類、多糖、多胺、生物堿等多種化學成分[9-11]，其中蛋白質(zhì)是鹿茸質(zhì)量控制的重要指標[12-13]。同時，研究表明，鹿茸中化學成分隨生長周期不同呈規(guī)律的變化[14-16]，與這些指標相關(guān)的檢測項目，包括總灰分、稀乙醇浸出物、總氮、氨基酸等，這些指標與鹿茸的質(zhì)量密切相關(guān)；并且隨著其生長年限的增加，鹿茸會逐漸骨化，鈣的含量發(fā)生變化。因此，本研究根據(jù)《中國藥典》2015年版中的檢測指標設定慣例，對鹿茸蠟片、粉片、血片和骨片的總灰分、稀乙醇浸出物、總氮、氨基酸等進行測定，以期結(jié)合多指標定量分析為不同商品規(guī)格的鹿茸飲片的質(zhì)量評價和等級劃分提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；Binder FED-115型熱循環(huán)干燥箱(賓德公司)；KjeltecTM2400型自動凱式定氮儀(瑞典福斯公司)；AE240型電子天平(Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

乙腈為色譜純(英國Thermo Fisher公司)；氨基酸(含量測定用)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院：絲氨酸(純度：99.9%)、甘氨酸(純度：100.0%)、組氨酸(純度：99.9%)、精氨酸(純度：99.9%)、蘇氨酸(純度：99.9%)、丙氨酸(純度：99.9%)、脯氨酸(純度：99.9%)、酪氨酸(純度：99.8%)、纈氨酸(純度：99.9%)、甲硫氨酸(純度：99.9%)、異亮氨酸(純度：99.9%)、亮氨酸(純度：99.9%)、苯丙氨酸(純度：100.0%)、賴氨酸(純度：100.0%)，批號均為140624-201506；羥脯氨酸(批號：111578-201602，純度：99.9%)；異硫氰酸苯酯(Urchem公司，純度：98.0%)；三乙胺、正己烷、無水醋酸鈉、冰乙酸、無水乙醇為分析純，鹽酸為優(yōu)級純，硫酸銨(批號：20170110)、氫氧化鈉(批號：20170323)、硫酸鉀(批號：20161215)、無水硫酸銅(批號：20170105)、硼酸(批號：20170228)、甲基紅(批號：20161020)、溴甲酚綠(批號：20160330)、無水乙醇(批號：20160729)、硫酸(批號：20170321)、碳酸氫銨(批號：20131028)均購自國藥集團化學試劑有限公司；0.05 mol·L-1硫酸滴定液(中國食品藥品檢定研究院，批號：539906-170405)；水為自制純水。

54批不同規(guī)格的鹿茸飲片購買自11家飲片公司(表1)，由中國食品藥品檢定研究院魏鋒研究員鑒定為正品，其中4種代表性規(guī)格飲片見圖1。

表1 鹿茸樣品信息

注：A.蠟片；B.粉片；C.血片；D.骨片。圖1 4種規(guī)格代表性鹿茸飲片

2 方法與結(jié)果

2.1 灰分測定

不同規(guī)格鹿茸飲片隨生長周期的變化，其骨化部分也呈現(xiàn)較為規(guī)律的變化，因此，參照《中國藥典》2015年版四部(通則2302)灰分測定法，對收集到的不同規(guī)格的鹿茸飲片的灰分進行測定，從而確定其灰分的變化規(guī)律。

2.2 浸出物含量測定

2.2.1冷浸法 取鹿茸供試品粉碎，使能通過二號篩，并混合均勻。取供試品約2 g，精密稱定，以稀乙醇為提取溶劑，參照《中國藥典》2015年版四部(通則2201)浸出物測定法項下的冷浸法進行測定。

2.2.2熱浸法 取鹿茸供試品粉碎，使能通過二號篩，并混合均勻。取供試品約2 g，精密稱定，以稀乙醇為提取溶劑，參照《中國藥典》2015年版四部(通則2201) 浸出物測定法項下的熱浸法進行測定。

2.3 總氮含量測定

以定氮儀法測定不同規(guī)格鹿茸飲片的總氮含量[參照《中國藥典》2015年版四部(通則0704)氮測定法中第三法]。

2.3.1反應溶液 堿液(40%的氫氧化鈉溶液)；吸收液(每升的1%硼酸溶液加0.1%甲基紅乙醇7 mL與0.1%溴甲酚綠乙醇10 mL)。

2.3.2供試品溶液 取供試品粉末約0.3 g，精密稱定于消化管中，依次加入硫酸鉀(5 g)、無水硫酸銅(0.5 g)、硫酸(10 mL)，置于消化儀中，消解至溶液呈澄清透明的藍綠色之后，再繼續(xù)消化20 min，取出，冷卻，備用。

2.3.3空白溶液 將未加供試品粉末的消化管，按2.3.2項下方法消解。

2.3.4測定方法 樣品測定開始前，用空白溶液測定，以便扣除空白值；然后將按照2.3.2項下方法將消解好的供試品溶液置于凱氏定氮儀中，設定好加入試劑的量(堿液50 mL、吸收液50 mL、水60 mL)及其他儀器參數(shù)，進行蒸餾和滴定。并且要不斷測定硫酸銨化學試劑的含氮量，作為儀器校準使用。

2.3.5線性關(guān)系考察 分別精密量取硫酸銨溶液(26.435 2 mg·mL-1)0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL置于25 mL量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，分別轉(zhuǎn)移至消化管中，按照上述方法依次制備和測定。將硫酸銨溶液取樣體積(X)對含氮量滴定結(jié)果(Y)進行線性回歸，結(jié)果表明，取樣含氮量為2.76～56.07 mg時，具有較好的線性相關(guān)性，線性方程：Y=5.610 3X-0.043 7(r=1.000 0)。

2.3.6精密度試驗 精密配制硫酸銨溶液(12.817 mg·mL-1)于消化管中，分別加入硫酸銨溶液10 mL及硫酸10 mL，按照上述方法連續(xù)測定6次。硫酸銨溶液的6次含氮量結(jié)果基本一致，平均值為21.15%，RSD為0.05%(n=6)，表明精密度良好。

2.3.7重復性試驗 精密稱定同一供試品(批號：LP-1)粉末0.3 g(n=6)于消化管中，按照上述方法依次測定。結(jié)果含氮量分別為9.31%、9.30%、9.26%、9.26%、9.33%、9.33%，平均值為9.30%，RSD為0.54%(n=6)，表明實驗重復性良好。

2.3.8加樣回收試驗 分別精密稱定供試品粉末(含氮量為9.30%)6份于消化管中，每份約0.15 g，按照上述方法依次測定含氮量，計算加樣回收率，結(jié)果分別為98.49%、99.40%、103.36%、98.84%、100.88%、103.30%，平均回收率為100.71%，RSD為2.71%(n=6)，結(jié)果表明準確度良好。

2.4 氨基酸成分的含量測定

鹿茸中氨基酸成分通過柱前衍生化技術(shù)，使用高效液相色譜法進行含量測定?？瞻兹芤?、混合對照品溶液及供試品溶液的制備參考相關(guān)文獻[17]。系統(tǒng)適用性考察結(jié)果顯示，15種氨基酸的分離度(R)和理論塔板數(shù)均符合要求，高效液相色譜圖見圖2。15種氨基酸線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4，平均回收率為96.9%～103.2%，RSD均小于3.0%；精密度、穩(wěn)定性及重復性結(jié)果均符合規(guī)定，相應的RSD均小于3.0%。分別取50批不同規(guī)格的鹿茸飲片粉末各0.20 g，精密稱定，按參考文獻[17]中的方法進行水解和衍生，利用標準曲線法分別計算15種氨基酸的含量及15種氨基酸的總量。

注：A.供試品；B.混合對照品溶液；C.空白溶液；1.羥脯氨酸；2.絲氨酸；3.甘氨酸；4.組氨酸；5.精氨酸；6.蘇氨酸；7.丙氨酸；8.脯氨酸；9.酪氨酸；10.纈氨酸；11.甲硫氨酸；12.異亮氨酸；13.亮氨酸；14.苯丙氨酸；15.賴氨酸。圖2 鹿茸供試品、混合對照品溶液和空白溶液的高效液相色譜圖

3 結(jié)果

3.1 不同規(guī)格鹿茸飲片的總灰分、浸出物的含量測定

取其中40批鹿茸飲片進行總灰分檢測，測定結(jié)果見表1。蠟片：3.5%～4.2%，平均總灰分為3.76%；粉片：31.9%～37.7%，平均總灰分為35.68%；血片：26.3%～37.4%，平均總灰分為31.23%；骨片：37.2%～46.6%，平均總灰分為43.83%。4種鹿茸飲片規(guī)格中，蠟片總灰分最低，骨片最高，具有明顯差異；血片和粉片的總灰分有所交叉，不易區(qū)別。

以稀乙醇為提取溶劑，對鹿茸飲片分別進行冷浸和熱浸，浸出物的含量測定結(jié)果見表2。冷浸條件下，蠟片：13.4%～14.5%；粉片：6.5%～7.9%；血片：5.7%～6.5%；骨片：1.6%～3.1%。熱浸條件下，蠟片：19.8%～22.9%；粉片：9.2%～12.5%；血片：8.0%～9.0%；骨片：4.0%～5.8%。鹿茸飲片隨著骨化程度的加重，醇溶性浸出物呈降低趨勢，依次為蠟片>粉片>血片>骨片。

表2 不同規(guī)格鹿茸飲片的總灰分、浸出物的含量測定 %

3.2 不同規(guī)格鹿茸飲片的總氮含量測定

取其中46批鹿茸飲片進行總氮測定，其質(zhì)量分數(shù)為6.79%～14.03%。其中蠟片總氮含量(12.25%～14.03%)最高，平均質(zhì)量分數(shù)為13.52%；粉片(9.31%～10.51%)和血片(9.29%～9.97%)兩者總氮含量相差不大，平均質(zhì)量分數(shù)分別為9.65%和9.77%；骨片總氮含量最低(6.79%～7.09%)，平均質(zhì)量分數(shù)為6.95%，結(jié)果見表3。

表3 不同規(guī)格鹿茸飲片的總氮含量測定 %

3.3 不同規(guī)格鹿茸飲片的氨基酸含量測定

50批不同規(guī)格鹿茸飲片氨基酸的含量測定結(jié)果顯示，15種氨基酸的總量為29.53%～54.09%。其中甘氨酸含量最高，約占6.43%～10.44%，脯氨酸、丙氨酸和精氨酸次之。蠟片(44.56%～54.09%)平均質(zhì)量分數(shù)為49.84%；粉片(40.00%～45.33%)平均質(zhì)量分數(shù)為41.31%；血片(32.88%～39.96%)平均質(zhì)量分數(shù)為38.10%；骨片(29.53%～33.95%)平均質(zhì)量分數(shù)為31.45%。由上述比較分析可知，鹿茸飲片隨著骨化程度的加重，氨基酸平均含量呈降低趨勢，與浸出物變化趨勢保持一致，呈現(xiàn)蠟片>粉片>血片>骨片的趨勢。

3.4 指紋圖譜分析

利用Chem.Pattern軟件對4種規(guī)格鹿茸飲片的氨基酸HPLC圖譜進行處理，對圖譜的保留時間進行校正，指紋圖譜圖結(jié)果見圖3。經(jīng)Chem Pattern軟件相似度評價系統(tǒng)對HPLC指紋圖譜相似度分析，50批不同規(guī)格的鹿茸飲片指紋圖譜中檢測到15個共有峰，4種商品規(guī)格的鹿茸飲片的相似度均大于0.985，說明以氨基酸為分析指標，4種規(guī)格的鹿茸飲片具有較高的均一性。

注：A.蠟片；B.粉片；C.血片；D.骨片。圖3 鹿茸蠟片、粉片、血片、骨片高效液相色譜指紋圖譜

3.5 鹿茸飲片質(zhì)量分級量表

根據(jù)上述不同商品規(guī)格鹿茸飲片的總灰分、稀乙醇浸出物、總氮、氨基酸含量，進行分析比較，最終，將鹿茸蠟片定為一等品；粉片與血片的各含量測定指標均有所交叉，無法較為明確區(qū)分，因此將兩者歸為一類，定為二等品；骨片定為三等品，結(jié)果見表4。

表4 鹿茸飲片質(zhì)量分級

4 討論

4.1 實驗條件的優(yōu)化與注意事項

浸出物含量測定時，由于鹿茸飲片的主要成分是蛋白質(zhì)，在浸出物過濾時要使用干燥濾器趁熱盡快過濾，否則溶液會變黏稠甚至凝固，導致浸出物含量測定結(jié)果偏低。由于不同的人員在操作時實驗操作上的差別，容易出現(xiàn)測定結(jié)果重復性較差的情況。因此，本實驗采用抽濾裝置迅速抽濾并用稀乙醇清洗濾器，最后定容。

氨基酸的含量測定采用柱前衍生化法，可使衍生化與高效液相色譜分離系統(tǒng)相隔離，防止彼此干擾。衍生化試劑選擇異硫氰酸苯酯(PITC)，衍生化產(chǎn)物單一穩(wěn)定、靈敏度高；同時，為保證衍生化反應完全，所加PITC需過量；最后加入正己烷進行萃取，防止衍生化試劑色譜峰的干擾，避免色譜柱柱效的降低。通過對色譜柱的考察，最終確定使用Agilent TC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，使得異亮氨酸和亮氨酸的色譜峰得到較好的分離。此外，考慮到羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，特意考慮對其進行考察。

4.2 不同規(guī)格鹿茸飲片質(zhì)量等級評價

本研究通過對鹿茸蠟片、粉片、血片、骨片的總灰分、醇溶性浸出物、總氮、氨基酸的含量測定結(jié)果進行分析比較，其總灰分呈升高趨勢，其中蠟片平均總灰分含量最高，骨片平均總灰分含量最低，粉片和血片兩者總灰分相差不大。冷浸及熱浸條件下的醇溶性浸出物、總氮含量、氨基酸含量均呈現(xiàn)蠟片>粉片>血片>骨片的降低趨勢，其中粉片和血片兩者各指標含量相差不大，有所交叉。綜上，鹿茸血片與粉片無法明顯區(qū)分，這與兩者被切割的部位比較接近有關(guān)，且不同的廠家與產(chǎn)地的炮制工藝有所不同，因此，部分鹿茸粉片和血片的相應指標含量會有所交叉。因此，如表4所示，在對鹿茸飲片性狀的初步判斷的基礎上，根據(jù)鹿茸飲片的多指標含量測定結(jié)果，將鹿茸飲片依次劃分為鹿茸蠟片(一等品)、粉片與血片(二等品)、骨片(三等品)3個等級，由此可在一定程度上規(guī)范鹿茸飲片等級混亂、以次充好的現(xiàn)象。

根據(jù)鹿茸飲片的化學成分及傳統(tǒng)使用特點，鹿茸飲片的指紋圖譜及多指標的含量測定可以較全面地對其進行質(zhì)量評價，從而將不同商品規(guī)格的鹿茸飲片進行質(zhì)量等級劃分，這不僅可以規(guī)范鹿茸飲片市場，維護消費者的利益，更是對中藥材及飲片質(zhì)量等級評價新模式的有益嘗試和探索[18]。