大白菜核不育花藥絨氈層的異常細(xì)胞程序性死亡(PCD)導(dǎo)致小孢子敗育研究*

郭瑛琪，李 祥，崔海芳，侯凌云，岳艷玲**

(1.中國科學(xué)院 昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650223；2.山西高地草莓育苗有限公司，山西 長治 046000；3.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462300；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201)

復(fù)等位核雄性不育具有雄蕊退化徹底、不育性穩(wěn)定等特點(diǎn)，且不受細(xì)胞質(zhì)影響，沒有正、反交遺傳效應(yīng)，是比較理想的大白菜雄性不育材料[1]。經(jīng)過多代轉(zhuǎn)育，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院大白菜育種實(shí)驗(yàn)室已成功將該核不育基因向不同類型的大白菜中轉(zhuǎn)育，獲得多個(gè)具有100%不育株率的核基因雄性不育系[2-5]。本試驗(yàn)從細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)角度研究花藥敗育的原因，進(jìn)一步探索雄性不育發(fā)生的機(jī)理。絨氈層是花藥藥壁組織的最內(nèi)層，由雄蕊原基的L2 和L3 層共同發(fā)育而來[6]。在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂早期，絨氈層完成自身的核內(nèi)有絲分裂，形成多核的細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N極性的分泌細(xì)胞，輸送小孢子發(fā)生和發(fā)育過程所需的營養(yǎng)物質(zhì)[7]。減數(shù)分裂結(jié)束后，絨氈層細(xì)胞合成胼胝質(zhì)酶，分解包圍四分體的胼胝質(zhì)壁，釋放單核小孢子[8]。當(dāng)小孢子從四分體中釋放出來后，絨氈層細(xì)胞開始降解，并向藥室釋放營養(yǎng)物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類等，調(diào)控著花粉壁的形成以及花粉與柱頭的識(shí)別[9]。同時(shí)絨氈層的解體產(chǎn)物還是花粉合成DNA、RNA、蛋白質(zhì)和淀粉的原料[10]。因此，絨氈層的發(fā)育及其降解對(duì)小孢子的發(fā)生和發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，絨氈層細(xì)胞形態(tài)和降解的時(shí)間均會(huì)影響小孢子的生長，進(jìn)而引起雄性不育。

大白菜(Brassica campestrisL.ssp.pekinensis)起源于中國，是中國主要的蔬菜[11]，利用雄性不育系生產(chǎn)一代雜種，可以克服雙親生活力衰退、雜交種子純度不是100%等問題[12]。絨氈層異常與小孢子敗育有關(guān)已得到廣泛認(rèn)可[13-16]，利用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)一步研究絨氈層與小孢子之間的關(guān)系，可進(jìn)一步探究雄性不育的發(fā)生機(jī)理。為進(jìn)一步深入探索大白菜核基因雄性不育系的敗育機(jī)制，本研究以核不育近等基因系10L03 為試材，利用石蠟切片顯微觀察和TUNEL [terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling] 檢測技術(shù)觀察小孢子敗育過程中絨氈層細(xì)胞的發(fā)育和降解動(dòng)態(tài)，以期為揭示大白菜核不育小孢子的敗育機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大白菜核不育近等基因系10L03，系內(nèi)兄妹交后代育性保持1∶1 分離，可育株自交后代可育株與不育株3∶1 分離，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院大白菜育種實(shí)驗(yàn)室選育而成。試材種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地大棚內(nèi)，于盛花期取不同育性不同發(fā)育時(shí)期的花蕾固定于FAA 固定液中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

采用李正理[17]的方法制作石蠟切片，切片厚度8 μm，蘇木素染色。選擇結(jié)構(gòu)清晰的石蠟切片進(jìn)行TUNEL 檢測，方法按Roche 公司In SituCell Death Detection Kit，TRM red 試劑盒說明書進(jìn)行，徠卡DM 2000 光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子敗育過程中花藥絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常

大白菜核不育近等基因系可育花藥在花粉母細(xì)胞時(shí)期花藥壁各層細(xì)胞分化完全，可見完整的絨氈層，此時(shí)花粉母細(xì)胞較大，細(xì)胞間排列緊密(圖1a)?；ǚ勰讣?xì)胞繼續(xù)發(fā)育，于藥室中分散，染色較深，細(xì)胞核極大，能看到有些花粉母細(xì)胞內(nèi)形成兩團(tuán)染色質(zhì)，發(fā)生減數(shù)分裂，此時(shí)的絨氈層細(xì)胞與花粉母細(xì)胞大小相近，細(xì)胞中可以看到液泡，排列緊密(圖1b)。隨后進(jìn)入四分體時(shí)期，藥室中形成四分體，由胼胝質(zhì)包裹和分隔，這一時(shí)期的小孢子總體呈圓形，絨氈層細(xì)胞排列規(guī)則緊密，細(xì)胞內(nèi)含物豐富，細(xì)胞間分隔不明顯，無法看清細(xì)胞核和液泡等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖1c)。隨著小孢子的進(jìn)一步發(fā)育，可育花藥中包裹四分體的胼胝質(zhì)被降解，釋放出單核小孢子，顯微鏡下呈三葉草形，結(jié)構(gòu)清晰，絨氈層細(xì)胞無法分辨?zhèn)€數(shù)，并且出現(xiàn)未染色的空白斑點(diǎn)，發(fā)生降解(圖1d)。小孢子不斷發(fā)育，形成染色深的圓形顆粒，可以清晰地看到大液泡和單個(gè)細(xì)胞核，此時(shí)絨氈層雖然存在，但其細(xì)胞內(nèi)空白部分增多，整體染色變淺，而且薄厚不均勻，可見絨氈層細(xì)胞已出現(xiàn)一定程度的降解(圖1e)。當(dāng)絨氈層完全消失，花粉發(fā)育成熟，可見花藥同側(cè)兩藥室中間的薄壁細(xì)胞斷開，準(zhǔn)備散粉(圖1f)。

不育花藥絨氈層在花粉母細(xì)胞時(shí)期同可育花藥一樣，排列緊湊，可見發(fā)育正常的花粉母細(xì)胞(圖1g)。之后時(shí)期花粉母細(xì)胞與可育材料一樣，染色較深，細(xì)胞核大，有細(xì)胞正在減數(shù)分裂，絨氈層細(xì)胞與可育材料近似，排列緊密，但液泡更多更大，而且絨氈層細(xì)胞比花粉母細(xì)胞大(圖1h)。不育小孢子能夠進(jìn)行第2 次分裂形成四分體，但四分體形狀不規(guī)則，可以看到不規(guī)則的正四面體，都聚集在一起；此時(shí)絨氈層細(xì)胞膨大變長，內(nèi)部出現(xiàn)空泡化，向內(nèi)擠壓小孢子(圖1i)。絨氈層繼續(xù)向內(nèi)膨大，小孢子被擠壓成團(tuán)無法看清形態(tài)(圖1j)。隨著花藥的進(jìn)一步發(fā)育，絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步膨大，幾乎占滿整個(gè)藥腔，藥室內(nèi)細(xì)胞相互粘連，不同藥腔敗育程度不同，有些藥腔開始皺縮變形(圖1k)。最后不育株的藥腔完全干癟坍塌，剩下一些細(xì)胞殘?bào)w染色較深(圖1l)。

圖1 核不育近等基因系10L03 花藥發(fā)育過程Fig.1 Light-microscopic observation of the anther development of GMS line 10L03

2.2 小孢子敗育過程中花藥絨氈層提前爆發(fā)PCD

大白菜核不育近等基因系不育和可育株花藥，在母細(xì)胞時(shí)期，TUNEL 標(biāo)記結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)明顯陽性信號(hào)(圖2a、g)，說明DNA 沒有發(fā)生斷裂，這一時(shí)期可育和不育花藥各層細(xì)胞都沒有發(fā)生PCD?；ǚ勰讣?xì)胞進(jìn)一步發(fā)育進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期，TUNEL 檢測可育花藥和不育花藥出現(xiàn)差異。在減數(shù)分裂時(shí)期，可育花藥橫切圖中的絨氈層細(xì)胞較大，結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，小孢子飽滿(圖2b)；而不育花藥縱切圖中的絨氈層細(xì)胞界限不夠清晰，絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)明顯的陽性信號(hào)(圖2h)。隨后進(jìn)入四分體時(shí)期，TUNEL 檢測顯示小孢子進(jìn)入四分體時(shí)期后，可育和不育的細(xì)胞差異更加明顯?？捎ㄋ幗q氈層部分細(xì)胞出現(xiàn)了陽性信號(hào)，說明此時(shí)可育花藥絨氈層細(xì)胞正在發(fā)生PCD，而且PCD 的發(fā)生并不是同時(shí)開始，而是逐個(gè)凋亡(圖2c)。在不育的花藥中，絨氈層體積異常膨大并且空泡化明顯，小孢子聚集在藥腔中央，嚴(yán)重變形，同時(shí)出現(xiàn)明顯的陽性信號(hào)，說明小孢子細(xì)胞核DNA 也出現(xiàn)斷裂，發(fā)生了凋亡(圖2i)。隨著小孢子的進(jìn)一步發(fā)育，TUNEL 檢測可育小孢子從四分體釋放后進(jìn)入單核期，絨氈層細(xì)胞有的可見絮狀熒光，而有的無熒光，進(jìn)一步說明可育花藥絨氈層細(xì)胞PCD 不是同時(shí)發(fā)生(圖2d)。在單核晚期，可育花藥單核孢子外聚積孢粉素開始形成花粉外壁，大部分絨氈層出現(xiàn)熒光，達(dá)到絨氈層凋亡降解的高峰期(圖2e)。而不育花藥從單核期開始就已無法區(qū)分具體時(shí)期，可見絨氈層細(xì)胞膨大，絨氈層處于解體狀態(tài)，小孢子有陽性信號(hào)，說明此時(shí)期小孢子也發(fā)生了PCD 正在凋亡(圖2j，與圖1j 出自同一材料同一位置)。進(jìn)一步敗育不育株藥腔開始向內(nèi)塌陷干癟，高度膨大的絨氈層和藥腔內(nèi)熒光信號(hào)明顯，小孢子皺縮變形，聚在一起(圖2k)?？捎ㄋ幍乃幥粌?nèi)有成熟花粉粒，絨氈層全部解體，無陽性信號(hào)出現(xiàn)，花粉外壁有孢粉素的沉積，所以出現(xiàn)自發(fā)熒光(圖2f)；不育花藥的藥腔完全干癟，絨氈層和中層細(xì)胞以及小孢子等全部降解，散亂聚集，無法區(qū)分結(jié)構(gòu)，藥腔內(nèi)有明顯的陽性信號(hào)，為殘留的細(xì)胞斷裂破碎的DNA (圖2l)。

3 討論

被子植物花粉的發(fā)育依次經(jīng)過造孢細(xì)胞時(shí)期、花粉母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂時(shí)期、四分體時(shí)期、單核小孢子時(shí)期以及成熟花粉粒時(shí)期，最終發(fā)育成具有育性的花粉。但在許多植物中也發(fā)現(xiàn)雄蕊不能夠正常地形成花粉或形成的花粉不能夠產(chǎn)生種子的現(xiàn)象，即雄性不育。在植物中雄性不育發(fā)生的時(shí)期和方式是多種多樣的，可以發(fā)生在花藥發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，主要集中在花粉母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂時(shí)期、四分體時(shí)期和單核期。就雙子葉植物而言，花藥敗育則多發(fā)生在四分體時(shí)期或小孢子發(fā)育早期階段[18]。王福青等[19]以大白菜核雄性不育系為材料，發(fā)現(xiàn)花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞時(shí)期，減數(shù)分裂出現(xiàn)異常；謝潮添等[20]以白菜細(xì)胞核雄性不育系為材料，四分體的4 個(gè)小孢子分離時(shí)出現(xiàn)異常，不育花藥絨氈層細(xì)胞膨大并且液泡化明顯，導(dǎo)致敗育；許明等[21]以大白菜細(xì)胞核雄性不育甲型“兩用系”為材料，通過細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)敗育時(shí)期為減數(shù)分裂后期到四分體時(shí)期。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明：大白菜核不育花藥敗育起始于減數(shù)分裂期，絨氈層提前發(fā)生PCD，而小孢子的敗育起始于四分體時(shí)期。

絨氈層包圍著花粉母細(xì)胞和小孢子并與其相互作用。當(dāng)小孢子從四分體中釋放出來后，絨氈層細(xì)胞開始降解，并向藥室釋放營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)控著花粉壁的形成以及花粉與柱頭的識(shí)別。絨氈層的發(fā)育及其降解異常會(huì)嚴(yán)重影響小孢子的發(fā)生和發(fā)育，導(dǎo)致雄性不育。謝潮添等[22]在光敏不育水稻不育花藥中發(fā)現(xiàn)：絨氈層沒有隨著小孢子的發(fā)育而退化，卻一直保留到花藥成熟的開花期，導(dǎo)致水稻小孢子敗育；FALASCA 等[23]以獼猴桃為材料，發(fā)現(xiàn)雄性不育材料絨氈層退化比可育材料晚；童哲等[24]利用電鏡觀察對(duì)水稻農(nóng)墾58S 花藥進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：在減數(shù)分裂時(shí)期以前絨氈層內(nèi)細(xì)胞器出現(xiàn)變換，減數(shù)分裂時(shí)期絨氈層內(nèi)側(cè)細(xì)胞壁提前降解，分泌孢粉素，導(dǎo)致了敗育。本研究發(fā)現(xiàn)：大白菜核不育花藥絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)從減數(shù)分裂開始出現(xiàn)異常，但小孢子可以發(fā)育到四分體時(shí)期，此時(shí)絨氈層細(xì)胞異常膨大，未能成功釋放單核小孢子，最終小孢子干癟死亡；可育花藥絨氈層細(xì)胞是逐個(gè)降解，直至散粉前才全部消失，這種絨氈層的提前降解導(dǎo)致小孢子發(fā)育所需的物質(zhì)無法提供，引起小孢子敗育。

早在1997 年，PACINI[25]通過電鏡觀察證實(shí)Lobivia rauschii和Tillandsia albida花藥絨氈層的降解具有明顯的PCD 特征。之后，在禾本科、茄科和百合科等多種植物中證實(shí)花藥絨氈層是植物生長發(fā)育過程中的一種PCD 事件，最終表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，可觀察到細(xì)胞核核膜發(fā)生內(nèi)陷、染色質(zhì)濃縮和DNA 斷裂，可用TUNEL 法進(jìn)行檢測[26-30]?；ㄋ幗q氈層細(xì)胞在特定發(fā)育時(shí)期的PCD與花粉的發(fā)育密切相關(guān)，當(dāng)四分體分開后，絨氈層細(xì)胞開始降解，為單核小孢子的進(jìn)一步發(fā)育提供養(yǎng)分，絨氈層降解也是小孢子發(fā)育的啟動(dòng)，所以認(rèn)為絨氈層是以PCD 的形式適時(shí)為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)。同時(shí)絨氈層的降解也為花粉長大提供空間。張虹等[31]對(duì)水稻花藥絨氈層細(xì)胞發(fā)育的TUNEL 檢測結(jié)果表明：在水稻花藥發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞PCD 的TUNEL 陽性信號(hào)出現(xiàn)在四分體時(shí)期，有些花藥絨氈層細(xì)胞PCD 的發(fā)生還會(huì)受到溫度的影響。絨氈層細(xì)胞PCD 有關(guān)的基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)使絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)異常降解，或提前[32]或延遲[33]。本研究經(jīng)過TUNEL 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)：可育花藥TUNEL 檢測絨氈層細(xì)胞的陽性信號(hào)出現(xiàn)在四分體時(shí)期，并且是部分細(xì)胞有信號(hào)，且一直持續(xù)到花粉成熟，說明絨氈層細(xì)胞降解向小孢子釋放養(yǎng)分是一個(gè)連續(xù)的過程。而不育花藥絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)期就已出現(xiàn)陽性信號(hào)，說明絨氈層細(xì)胞提前發(fā)生PCD，小孢子也隨之出現(xiàn)陽性信號(hào)，發(fā)生凋亡。絨氈層細(xì)胞提前降解，不能持續(xù)供應(yīng)小孢子發(fā)育所需的物質(zhì)，可能是導(dǎo)致小孢子最終死亡的直接原因。

STEIGLITZ[34]研究表明：在小孢子母細(xì)胞完成減數(shù)分裂后，絨氈層適時(shí)地分泌胼胝質(zhì)酶以分解包裹四分孢子的胼胝質(zhì)壁，釋放小孢子。從本研究可知：大白菜可育花藥絨氈層四分體時(shí)期就出現(xiàn)了陽性信號(hào)，說明此時(shí)存在DNA 的斷裂現(xiàn)象，而此時(shí)四分體小孢子依舊被胼胝質(zhì)包裹著，可絨氈層已經(jīng)開始凋亡，所以經(jīng)分析認(rèn)為胼胝質(zhì)酶的運(yùn)轉(zhuǎn)并不是單純的分泌，而可能由絨氈層的降解釋放到藥腔，降解包圍四分體的胼胝質(zhì)，釋放單核小孢子。李振興[35]的研究結(jié)果亦可見不育小孢子能夠發(fā)育形成四分體，但不能及時(shí)釋放單核小孢子這一現(xiàn)象；經(jīng)苯胺蘭染色觀察發(fā)現(xiàn)：包裹四分小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解，而持續(xù)存在直至小孢子凋亡，說明不能正常釋放單核小孢子的原因是包裹四分小孢子的胼胝未能被降解，從而導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻引起完全敗育。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)：可育花藥絨氈層細(xì)胞PCD 現(xiàn)象是不規(guī)律的逐個(gè)出現(xiàn)，而非同時(shí)發(fā)生，說明絨氈層的凋亡具有先后順序，并非同時(shí)全部凋亡，但在不育株中PCD 的出現(xiàn)是同時(shí)間大量發(fā)生的，說明在小孢子發(fā)育過程中，整個(gè)絨氈層的PCD 過程受到嚴(yán)格調(diào)控，大量絨氈層細(xì)胞爆發(fā)性PCD說明不育花藥絨氈層的調(diào)控機(jī)制可能發(fā)生了紊亂，導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞的降解不受控制，使得小孢子進(jìn)一步發(fā)育所需的物質(zhì)得不到持續(xù)的供應(yīng)進(jìn)而引發(fā)完全敗育。

4 結(jié)論

大白菜核不育花藥敗育起始于減數(shù)分裂期絨氈層異常，小孢子在四分體時(shí)期開始敗育；不育發(fā)生后，伴隨著絨氈層細(xì)胞異常膨大，嚴(yán)重空泡化，提前降解，小孢子變形干癟而死亡。大白菜核不育敗育花藥絨氈層細(xì)胞提前在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期發(fā)生PCD，絨氈層細(xì)胞提前集體降解，不能連續(xù)不斷地向發(fā)育中的小孢子供應(yīng)發(fā)育所需的物質(zhì)，是小孢子發(fā)育不良從而敗育的重要原因。絨氈層細(xì)胞提前PCD 還導(dǎo)致胼胝質(zhì)酶異常，不能正常釋放單核小孢子，使小孢子的進(jìn)一步發(fā)育受阻而引起完全敗育，是導(dǎo)致小孢子敗育的直接原因。