低溫脅迫對軍曹魚幼魚脂代謝相關(guān)生理生化的影響

蔡潤佳，張 靜，黃建盛，陳 剛，張健東，潘傳豪，王忠良，謝瑞濤，湯保貴,3

（1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江 524025；3.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088；4.廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司，廣東 湛江 524000；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點實驗室，廣東 湛江 524088）

水溫是影響魚類生存最重要環(huán)境因子之一，與魚類多種生命活動密切相關(guān)[1]。1971 年，Lyons 等[2]指出，低溫可導致膜脂從液相向凝膠相轉(zhuǎn)變，并導致生物膜內(nèi)物質(zhì)大量向膜外泄露，打破生物膜內(nèi)外離子平衡。自此，低溫與生物脂代謝的關(guān)系廣受關(guān)注。在魚類方面，邵彥翔等[3]發(fā)現(xiàn)，隨水溫不斷降低，云紋石斑魚 (Epinephelus moara,♀) × 鞍帶石斑魚 (E.lanceolatus,) 雜交后代血清甘油三酯（TG）呈先升后降再升趨勢。He 等[4]研究表明，低溫脅迫對吉富羅非魚（GIFTOreochromis niloticus）肌肉脂肪酸不飽和度有明顯提高作用，對增強細胞膜流動性有較大作用。Alba 等[5]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對低溫脅迫下的金頭鯛（Sparus aurata）進行肝臟轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟在低溫下產(chǎn)生的大量差異基因富集在脂代謝的相關(guān)通路上?？梢?，調(diào)節(jié)脂代謝是魚類應(yīng)對低溫脅迫的重要措施之一。

軍曹魚（Rachycentron canadum）屬于鱸形目（Perciformes）軍曹魚科（Rachycentridae）軍曹魚屬（Rachycentron），適宜溫度范圍為21～ 31 ℃，屬于暖水性魚類，分布于地中海、印度-太平洋（東太平洋除外）等海域，在我國南方部分海域也有少量分布[6]。軍曹魚對低溫的不耐受性導致其在我國只能在南方養(yǎng)殖。目前，關(guān)于軍曹魚在低氧脅迫[7]、鹽度適應(yīng)[8]、營養(yǎng)[9]等已有研究報道，而軍曹魚溫度相關(guān)研究主要涉及溫度對生長和抗氧化酶活性的影響[10-11]，對低溫條件下的軍曹魚生理調(diào)節(jié)機制了解極為有限。筆者研究低溫條件下軍曹魚的脂代謝，旨在補充軍曹魚在低溫條件下生理調(diào)節(jié)機制資料，為進一步培育軍曹魚耐低溫品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

廣東海洋大學魚類種子工程與養(yǎng)殖實驗室人工繁育的軍曹魚幼魚，體質(zhì)量（211.17±9.51）g，體長（32.68±0.78）cm，于湛江恒興南方海洋科技有限公司6 個300 L 養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)5 d。設(shè)置低溫組和常溫對照組，每組設(shè)3 個平行組。隨機取魚90 尾，每組15 尾。常溫對照組采用流水養(yǎng)殖且不間斷充氣，保持溶氧5 mg/L 以上，水溫（30.5±1.0）℃，每天08:00 和16:00 飽食投喂。低溫組采用冰塊（以密封瓶裝冰）降溫法以2 h/℃勻速降溫至（20.0 ± 0.5）℃，幼魚由于低溫不攝食故不投喂飼料，實驗期間靜水養(yǎng)殖，每天更換50%等溫新鮮海水，不間斷充氣，使溶氧保持在5 mg/L 以上。每天用水質(zhì)檢測試劑盒監(jiān)測水質(zhì)，保持6 個桶氨氮質(zhì)量濃度小于0.02 mg/L，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度小于0.01 mg/L，pH 7.4～ 7.8。

1.2 樣品采集

根據(jù)預實驗結(jié)果，軍曹魚幼魚在20 ℃下半致死時間為7 d，故正式實驗周期設(shè)為7 d。在1、4、7 d時每桶分別隨機采樣3 尾。采樣前停飼24 h，采樣時用丁香酚麻醉后于尾靜脈處采血；取部分肝臟樣品，用體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定，制作切片；肌肉、部分肝臟和腹腔脂肪樣品分裝入標記有采樣時間、實驗處理方式和組織來源的封口袋；血液置4 ℃冰箱12 h，以3 500 r/min、15 min、4 ℃條件離心，血清于-80 ℃冰箱保存；切片樣品常溫保存；其余樣品-80 ℃冰箱中保存，用以檢測脂肪酸組成。

1.3 生化指標分析

采用全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技，Chemray800）測定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）含量；血清丙二醛（MDA）含量、總抗氧化能力（T-AOC）均用酶標檢測儀（BioTeK，Epoch）根據(jù)南京建成生物工程研究所的商業(yè)試劑盒說明書測定。

1.4 肝臟組織學觀察

參考蕭培珍[12]方法制作肝臟切片。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗、梯度蔗糖溶液脫水、包埋、冷凍切片機切片、恢復室溫、油紅O 染色、封片等步驟，用體視鏡（Leica M205FCA）觀察并采集圖像，用Image J 軟件統(tǒng)計切片脂滴面積。

1.5 肝臟、肌肉、腹腔脂肪組織脂肪酸組成分析

肝臟、肌肉和腹腔脂肪組織（IPF）用烘箱60 ℃烘干至恒重，用粉碎機粉碎樣品，每個樣品稱取50 mg，分別加入2 mL 體積分數(shù)0.5%的硫酸-甲醇溶液，于60 ℃水浴鍋中溫浴1 h，再分別加入2 mL 正己烷混合萃取，靜置，取上層清液加入適量無水硫酸鈉，采用氣相色譜法進行脂肪酸組成分析（委托恒興質(zhì)量檢測中心進行）。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0 軟件的T檢驗對數(shù)據(jù)進行差異分析。當P＜0.05時表示差異顯著，P＜0.01 時表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對幼魚血清脂代謝相關(guān)指標的影響

低溫條件下飼養(yǎng)1 d 時，軍曹魚幼魚血清TG含量顯著高于對照組（P＜0.05），而4 d、7 d 時，低溫組血清TG 含量均升高，與同期對照組差異極顯著（P＜0.01）（圖1_a）。軍曹魚血清T-CHO 含量在低溫條件下呈先降后升再降的趨勢，1 d 時顯著低于對照組（P＜0.05），4 d 時顯著高于對照組（P＜0.05），7 d 時則下降至與對照組水平（P＞0.05）（圖1_b）。低溫脅迫下軍曹魚血清HDL 在1 d 和4 d 時含量無明顯變化（P＞0.05），7 d 時則顯著下降（P＜0.05）（圖1_c）。血清LDL 含量在低溫脅迫1 d 時與對照組無顯著差異（P＞0.05）；4 d 時升高并顯著高于對照組（P＜0.05）；7 d 時含量進一步升高，與對照組差異極顯著（P＜0.01）（圖1_d）。

2.2 低溫脅迫對幼魚血清氧化指標的影響

低溫飼養(yǎng)1 d 時，軍曹魚幼魚血清MDA 含量極顯著升高（P＜0.01），4 d 時最高，7 d 時下降，但仍顯著高于同期對照組（P＜0.05）（圖2_a）。血清T-AOC 整體呈下降趨勢，1 d 時與對照組無顯著差異（P＞0.05），4 d 時顯著降低（P＜0.05），7 d 時進一步降低，極顯著低于對照組（P＜0.01）（圖2_b）。

2.3 低溫脅迫對幼魚肝臟脂滴分布的影響

常溫條件下，軍曹魚幼魚脂滴均勻分布，無明顯空白區(qū)域，且脂滴邊緣清晰，融合現(xiàn)象不明顯（圖3）。低溫條件下，1 d 時，脂滴融合，形成形狀不規(guī)則的較大脂滴，但無明顯空白區(qū)；4 d 時，脂滴融合現(xiàn)象有所減少，大部分脂滴邊緣清晰；7 d 時，出現(xiàn)較多空白區(qū)域，脂滴界限模糊，普遍融合成片。統(tǒng)計肝臟油紅O 染色切片脂滴面積，低溫組脂滴面積在1、4、7 d 時均極顯著高于對照組（圖3_g）。

2.4 低溫脅迫對幼魚肝臟、腹腔脂肪和肌肉脂肪酸組成的影響

軍曹魚幼魚應(yīng)對20 ℃的低水溫環(huán)境時，肝臟、腹腔脂肪及肌肉組織脂肪酸代謝不同。表1 可見，肝臟脂肪酸中，飽和脂肪酸（Saturated fatty acid，SFA）7 d 內(nèi)與對照無顯著差異（P＞0.05），單不飽和脂肪酸（Monounsaturated fatty acid，MUFA）含量平均值不斷下降，但與對照組差異不顯著（P＞0.05），多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量總體上不斷上升，7 d 時極顯著高于對照組（P＜0.01），n-6 系列PUFA 7 d 時顯著提高（P＜0.05）。表2 可見，腹腔脂肪脂肪酸中，SFA、MUFA含量在低溫脅迫時保持相對穩(wěn)定（P＞0.05），而PUFA 含量在1 d 時即顯著高于對照組（P＜0.05），在4 d 和7 d 時含量進一步提高并極顯著高于同期對照組（P＜0.01），其中n-3 系列PUFA 從1 d 時起即極顯著高于對照組（P＜0.01），n-6 系列在1 d、4 d 時顯著高于對照組（P＜0.05），并在7 d 時與對照組差異極顯著（P＜0.01）。肌肉脂肪酸組成變化見表3，低溫脅迫下，低溫組三種脂肪酸占總脂肪酸比例與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 低溫脅迫對軍曹魚血清TG、T-CHO、HDL 和LDL 含量的影響Fig.1 Effects of low temperature stress on the content of TG,T-CHO,HDL and LDL in serum of cobia

圖2 低溫脅迫對軍曹魚血清MDA 和T-AOC 含量的影響Fig.2 Effects of low temperature stress on the content of MDA and T-AOC in serum of cobia

圖3 軍曹魚肝臟組織學觀察及脂滴面積統(tǒng)計Fig.3 Histological observation of cobia liver and lipid droplet area statistics

表1 低溫脅迫對軍曹魚肝臟脂肪酸組成的影響Table 1 Effects of low temperature stress on fatty acid composition of liver in cobia

表2 低溫脅迫對軍曹魚腹腔脂肪脂肪酸組成的影響Table 2 Effects of low temperature stress on fatty acid composition of IPF in cobia

表3 低溫脅迫對軍曹魚肌肉脂肪酸組成的影響Table 3 Effects of low temperature stress on fatty acid composition of muscle in cobia

3 討論

3.1 低溫脅迫對軍曹魚幼魚血脂水平的影響

血液是動物物質(zhì)代謝的重要載體，血液生化指標改變可指示機體多種生理變化[13]。血脂（TG 和T-CHO）水平可反映機體脂代謝情況。TG 是儲存在魚體的高效能量源，對魚體能量代謝有重要調(diào)節(jié)作用。本研究中，軍曹魚血清TG 在20 ℃脅迫1 d 時即顯著提高，4、7 d 時持續(xù)升高至與對照組差異極顯著。在吉富羅非魚[14]、暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）[15]、鯉魚（Cyprinus carpio）[16]等研究中也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。魚類在低溫環(huán)境下無氧代謝增強，有氧代謝與脂代謝受抑制，使血清TG 消耗量減少，血清TG 增多[14]。但不同魚類血清TG 對低溫脅迫的響應(yīng)不同。低溫脅迫褐藍子魚（Siganus fuscescens）導致魚體血清TG 呈先升后降趨勢[17]，而斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）則呈與褐藍子魚完全相反結(jié)果，有先降后升趨勢[18]。多鱗白甲魚（Onychostoma macrolepis）血清TG 在低溫脅迫前3 h 逐步上升，6 h 時顯著下降而后又逐漸上升[19]。這種物種間的血脂變化差異機制有待進一步研究。

血清膽固醇主要是細胞漿膜、類固醇激素等的合成原料，適宜血清膽固醇水平是保持細胞膜流動性的條件之一[20]。當血清T-CHO 含量減少時，可能會干擾細胞膜穩(wěn)態(tài)從而影響多種生化過程[14]，本研究中，軍曹魚血清T-CHO 在低溫脅迫1 d 時顯著降低，但在4 d 時升至極顯著升高，7 d 時又降至對照組水平，說明軍曹魚對血清T-CHO 的調(diào)節(jié)能力較強。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[21]和斜帶石斑魚[20]中均發(fā)現(xiàn)低溫會減少血清T-CHO含量?？梢?，不同物種的血清T-CHO 對低溫脅迫的響應(yīng)不盡相同。低溫會導致軍曹魚血清LDL 在4 d 和7 d 時升高，HDL 7 d 時降低。LDL 主要從肝臟向外周組織轉(zhuǎn)運內(nèi)源膽固醇，而成熟的HDL 是機體從外周組織回收內(nèi)源性膽固醇的載體，有清除血漿中膽固醇的作用。血清LDL、HDL 對低溫脅迫的響應(yīng)表明軍曹魚脂代謝出現(xiàn)異常。

3.2 低溫脅迫對軍曹魚幼魚組織脂肪酸組成的影響

脂肪酸對生物體代謝有重要作用。吉富羅非魚在水溫28、22 ℃條件下飼養(yǎng)40 d 后，22 ℃組肌肉SFA、MUFA、PUFA 含量均與28 ℃組無顯著差異，僅n-6 系列PUFA 顯著高于28 ℃組[22]；而吉富羅非魚在13 ℃低溫脅迫時，隨著脅迫時間的延長，肌肉中SFA 含量持續(xù)下降，MUFA 和PUFA 均呈先升后降趨勢[4]；謝妙等[20]發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚在20 ℃條件下脅迫15 d 后，肌肉SFA 含量顯著下降，MUFA和PUFA 含量則顯著上升?？梢?，組織脂肪酸組成對低溫脅迫的響應(yīng)與物種、環(huán)境條件、脅迫時間等均有較大關(guān)系。本研究中，不同組織對低溫脅迫的響應(yīng)也存在較大差異。在脂肪酸組成方面對低溫脅迫響應(yīng)最小的組織是肌肉，各脂肪酸均與對照組無顯著差異。其次是肝臟，MUFA 含量有下降趨勢，而PUFA 含量則在7 d 時顯著高于對照組。對低溫脅迫響應(yīng)程度最大的組織是IPF，其中n-3、n-6 系列PUFA，總PUFA 均不斷增加，在1 d 時即顯著或極顯著高于對照組。研究表明，PUFA 在維持細胞膜結(jié)構(gòu)[23]、參與信號傳遞[24]等方面均有重要作用，所以提高PUFA 的占比可能是軍曹魚對低溫脅迫的適應(yīng)性調(diào)節(jié)方式之一。對鯉魚[25]、尖吻鱸[26]等的研究均發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境會提高不飽和脂肪酸比例，這是魚體為提高細胞膜流動性，而削弱低溫導致細胞膜流動性差的負面影響的結(jié)果。

3.3 低溫脅迫對軍曹魚幼魚氧化應(yīng)激的影響

魚體在抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)下，體內(nèi)活性氧（ROS）較低并保持動態(tài)平衡[27]。當魚體處于低溫環(huán)境時ROS 逐漸積累，過量的ROS 會促進脂肪酸尤其是不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，ROS 主要攻擊脂肪酸側(cè)鏈位置，可從脂質(zhì)雙鍵中提取氫原子改變脂質(zhì)結(jié)構(gòu)[28]，最終生成丙二醛和壬烯等脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，還會進一步生成過氧自由基，進一步加劇機體過氧化[29]。軍曹魚血清T-AOC 隨低溫脅迫時間的延長而顯著降低，抗氧化能力的降低會導致機體ROS 含量升高，從而阻礙正常脂代謝[30]。且魚體在低溫環(huán)境下占比增多的多不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸更易積累ROS[31]，這可能是軍曹魚在低溫脅迫1 d 時就迅速積累大量丙二醛的原因。肝臟是魚體脂代謝最重要調(diào)節(jié)器官，低溫可誘導暗紋東方鲀肝臟凋亡相關(guān)基因的表達[32]，在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[33]、斜帶石斑魚[20]等物種中，低溫會導致谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，指示肝細胞受損傷。本研究中，軍曹魚肝臟低溫脅迫后出現(xiàn)脂滴分布不均、融合、邊緣模糊、脂滴面積極顯著增加等現(xiàn)象，也說明了肝臟脂代謝活動出現(xiàn)異常。

3.4 低溫脅迫時不攝食與常溫條件下饑餓的血脂響應(yīng)機制

低溫條件下，軍曹魚不攝食，與常溫饑餓脅迫同屬內(nèi)源性營養(yǎng)代謝階段，但魚體響應(yīng)兩種脅迫的血脂相關(guān)指標表現(xiàn)不同。胡文君[34]發(fā)現(xiàn)，黃鱔（Monopterus albus）于5 ℃環(huán)境時，與25 ℃正常投喂組相比THO 含量顯著降低，HDL 含量顯著升高，而TG 和LDL 含量則與對照組無顯著差異。而當黃鱔于25 ℃環(huán)境中進行饑餓脅迫時，THO、TG和HDL 含量均與25 ℃正常投喂組無顯著差異，而LDL 含量則顯著降低，表明血脂指標在低溫脅迫和常溫饑餓脅迫中，除血清TG 外，血清THO、HDL和LDL 等指標均有不同的變化趨勢，故推測低溫脅迫的脂代謝調(diào)節(jié)機制與饑餓脅迫不同，本研究低溫脅迫結(jié)果與停食的關(guān)系不大。

4 結(jié)論

軍曹魚幼魚在低溫脅迫過程中，機體抗氧化能力降低并積累大量MDA，從提高血清TG 含量、增加血清膽固醇含量（增加LDL、減少HDL）、調(diào)整肝臟和IPF 中的脂肪酸組成等方面響應(yīng)低溫脅迫。