張旭飛,羅曉琳,吉宏武,2,劉書成,2,任惠峰,毛偉杰,2
(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室// 廣東省海洋生物制品工程實驗室// 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心// 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室,廣東 湛江,524088;2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034;3.東京海洋大學(xué),日本 東京)
凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei),又稱南美白對蝦,是世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大、經(jīng)濟價值較高的對蝦品種[1]。顏色是評價對蝦品質(zhì)的重要指標(biāo)[2-3]。蝦青素是影響對蝦顏色變化的主要色素,隨著加熱溫度升高蝦青素被釋放導(dǎo)致對蝦體表顏色逐漸變紅[4-5]。目前凡納濱對蝦品質(zhì)研究中均通過色差儀來測定顏色[7-8],但由于對蝦的形狀不規(guī)則、加熱時顏色變化不均勻,具有一定的局限性,尤其不適合連續(xù)化生產(chǎn)時顏色變化的測定。計算機視覺系統(tǒng)(CVS)是一種客觀、快速、非接觸、無損傷的連續(xù)檢測方法,可以實現(xiàn)分析食物整個表面的每個像素并量化表面特征和缺陷[9],如番茄[10]、烤雞[11]、鲇魚[12]等,但利用CVS 對對蝦色澤測定的研究報道較少。Hosseinpour 等[13]利用CVS 分析干燥過程中的對蝦顏色變化,但其方法較為繁瑣,將圖像進行分割,然后獲取其RGB 值,最后轉(zhuǎn)換成CIE 系統(tǒng)的L*、a*、b*值。目前利用CVS 對對蝦加熱過程中色澤進行連續(xù)性的測定尚未有研究報道。
蝦青素具有很強的抗氧化能力,但是在光或熱的作用下,其結(jié)構(gòu)很容易被破壞[6]。從蝦殼中提取的蝦青素,其DPPH 或ABTS 自由基清除能力是抗壞血酸的72 倍或220 倍[14]。目前從對蝦廢棄物中提取的蝦青素研究報道較多,但對蝦肉中蝦青素及其抗氧化活性在加熱過程中變化情況的研究報道較少。在連續(xù)加熱過程中對蝦顏色變化與蝦青素含量及其抗氧化活性之間是否存在相關(guān)關(guān)系尚待深入研究。本研究利用CVS 首次對水煮加熱過程中對蝦的顏色進行連續(xù)化測定,確定CVS 參數(shù),通過與色差儀測定的色值之間的相關(guān)性分析,探討其應(yīng)用可能性,以期為對蝦加工提供連續(xù)化測定方法;分析水煮加熱過程中對蝦顏色與蝦青素含量及其體外抗氧化活性之間的相關(guān)關(guān)系,為對蝦產(chǎn)品的開發(fā)及品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。
凡納濱對蝦,購于湛江歡樂海洋水產(chǎn)品批發(fā)市場(體長14~ 16 cm,體質(zhì)量20~ 23 g)。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),購于上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、過二硫酸鉀均為分析純,購于汕頭西隴科學(xué)股份有限公司;氫氧化鈉(分析純),購于廣東光華科技股份有限公司;甲醇、乙腈、二氯甲烷均為HPLC 色譜級,購于賽默飛世爾科技;DPPH(純度≥98%)和ABTS(純度≥98%),均購于阿拉丁生物科技有限公司。
Agilent 半制備1200 高效液相色譜儀,美國Agilent 公司;Multiskan FC 酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;旋蒸儀(N-1100D-WB),上海愛朗儀器有限公司;氮吹儀(MGS-2200H),東京理化器械株式會社;Opsens 數(shù)顯光纖溫度探針,中國深圳歐普申光電科技有限公司;數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(T25);色差儀(尼卡美能達(dá)CR-20),日本柯尼達(dá)美能達(dá)股份有限公司;攝影棚(DEEP40cm 型),上海諾美攝影器材有限公司;三腳架(輕裝時代Q999H 橫臂三腳架),廣州輕裝攝影器材有限公司;數(shù)碼相機(Canon PowerShot G12),日本佳能股份有限公司;287 標(biāo)準(zhǔn)色卡(RAL-D9),德國勞爾公共有限責(zé)任公司。
1.3.1計算機視覺系統(tǒng)與色差儀評價顏色相關(guān)性
1.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)色卡預(yù)處理 將標(biāo)準(zhǔn)色卡根據(jù)色差儀測量面積要求進行適當(dāng)裁剪,編號。
1.3.1.2色差儀測定色卡顏色 色差儀開機預(yù)熱后進行校正,將色卡按編號順序置于色差儀中測量三次并記錄相應(yīng)L*、a*和b*值。
1.3.1.3CVS 測定色卡顏色 CVS 的建立:主要由照明系統(tǒng)、圖像采集系統(tǒng)及圖像處理系統(tǒng)組成[15]。采用兩盞平行燈(長40 cm、每盞燈均勻分布著120顆LED 燈珠)照明,燈板可以在棚體框架上移動以靈活布光,色溫5 700 K,顯色指數(shù)(Ra)大于92%,兩盞燈都位于樣品上方40 cm 處并與樣品呈45°,作為標(biāo)準(zhǔn)照明系統(tǒng)。數(shù)碼相機垂直放置在距背景板30 cm 處,相機鏡頭與光源軸線之間的角度約為45°以捕獲顏色的漫反射(造成顏色的漫反射主要發(fā)生在入射光45°),作為標(biāo)準(zhǔn)拍攝條件。
圖像在白色背景下拍攝,相機設(shè)置如下:手動模式,ISO 400,鏡頭光圈f 4.0,快門速度 1/160,分辨率為2 816×1 880 像素,無變焦,無閃光,JPEG格式存儲。相機通過IFC-400PCU 界面連接線連接到帶有Adobe Photoshop 2018 的計算機USB 端口,直接從計算機中獲取圖像。
用Adobe Photoshop 2018 軟件打開待處理圖片,用菜單欄中的橢圓選框工具選定需要分析的區(qū)域,在圖像中選擇Lab 顏色模式,然后在圖像里的“直方圖”中查看選中區(qū)域的并實時記錄L值、a值、b值,重復(fù)測量3 次取平均值[16]。
CVS 測定色卡L、a、b值:照明系統(tǒng)預(yù)熱30 min后,將色卡按編號順序置于攝影棚中心,照相機垂直放置于攝影棚上開口,在標(biāo)準(zhǔn)的拍攝條件下和特定照相機參數(shù)下拍攝色卡圖像,以JPEG 形式儲存后備用。使用Adobe Photoshop 2018 軟件橢圓工具選中色差儀所測量的面積,使用Lab 模式提取圖像L、a、b值,每個色卡測量3 次。
1.3.2加熱過程中凡納濱對蝦顏色變化研究
1.3.2.1材料預(yù)處理 在加熱試驗前從-80 ℃超低溫冰箱中取出樣品,于冰水中解凍至蝦中心溫度達(dá)到0 ℃,即解凍完成。用濾紙擦干蝦表面水分,將溫度探針插入樣本蝦的第二腹節(jié)中心,以一只蝦為單位裝入帶密封口的聚乙烯透明塑料袋。
1.3.2.2加熱方法 將樣品分別置于40、50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴鍋中隔袋水煮加熱,于樣品中心溫度到達(dá)水浴溫度第0、3、6、9、12 min 分別取出3 個樣品并置于封口袋中冰水冷卻至0 ℃,用濾紙擦干蝦表面水分備用。此樣品用于分析對蝦CVS 測定與色差儀測定的相關(guān)性。
將樣品置于90 ℃恒溫水浴鍋中隔袋水煮加熱30、60、90、120、180、300、360、540、720 s,分別取出3 個樣品并置于封口袋中冰水冷卻至0 ℃、用濾紙擦干蝦表面水分備用。
1.3.2.3顏色測定 色差儀測定樣品L*、a*、b*值:色差儀開機預(yù)熱后進行校正,測量凡納濱對蝦樣品去殼后的第二肌節(jié)L*、a*、b*值。
CVS 測定樣品L、a、b值:照明系統(tǒng)預(yù)熱30 min后,將色差儀測定后的樣品置于攝影棚中心,在標(biāo)準(zhǔn)的拍攝條件下和特定照相機參數(shù)下拍攝樣品圖像,以JPEG 形式儲存圖像,使用Adobe Photoshop 2018 軟件橢圓工具選中色差儀所測量的面積,使用Lab 模式提取圖像L、a、b值。
1.3.3水煮加熱過程中凡納濱對蝦蝦青素含量的測定 蝦青素的提?。簠⒖糎u 等[17]的做法,略有改動。將2 g 樣品放入50 mL 離心管中,按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶7 添加乙醇,5 000 r/min 均質(zhì),勻漿1 min,混合均勻,并用40 ℃水浴搖床浸提2 h,4 ℃下8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5min,收集上清液,將沉淀按上述步驟重復(fù)萃取3 次直至樣品無色,合并上清液。為保證蝦青素不被破壞,提取過程全程溫度控制在4 ℃左右。將上清液混合均勻后放在棕色玻璃瓶中密封保存,旋轉(zhuǎn)蒸干樣液,用10 mL 無水乙醇復(fù)溶。取5 mL 粗提液于試管中,加入1 mL的0.02 mol/L 的NaOH 乙醇溶液,混勻,氮氣吹掃至總體積為5 mL,置于4 ℃避光靜置12 h,得到蝦青素提取物。過孔徑0.22 μm 濾膜過濾后進行高效液相色譜(HPLC)分析。
蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:準(zhǔn)確稱取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)2.5 mg,用無水乙醇溶解定容至25 mL,配制蝦青素濃度為2、4、6、8、10、12 μg/mL,在474 nm 處測定其光密度值。以蝦青素濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=50.713x+10.23,R2=0.999 9。
HPLC 條件:色譜柱為反相C18 柱(Agilent Technologies,ZORBAX,4.6 mm × 250 mm,5 μm),流動相是乙腈/ 甲醇/ 二氯甲烷(體積比80∶15∶5),使用前流動相超聲脫氣30 min;流速1 mL/min;檢測波長474 nm;柱溫為25 ℃;進樣量為20 μL。
1.3.4體外抗氧化活性的測定 DPPH 自由基清除能力的測定:參考劉涵等[18]的方法,并略有改動。準(zhǔn)確稱取DPPH 標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇配制濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液。測定時,在96 孔板中加入DPPH 乙醇溶液100 μL,然后再加入樣品溶液100 μL,置于室溫黑暗處30 min,測定517 nm 處的光密度Di。同時,測定100 μL 樣品溶液+100μL乙醇溶液在517 nm 波長處的光密度Dj。再測定100 μL DPPH 溶液+100 μL 乙醇溶液在517 nm 處的光密度D0。DPPH 自由基清除率按下面公式計算:DPPH 自由基清除率(%)=[1 -(Di-Dj)/D0]。
ABTS 自由基清除能力的測定:參考Pu 等[19]方法,并略有改動。配制ABTS 儲備液:將5 mL 7 mmol/L ABTS 和88 μL 140 mmol/L 過硫酸鉀混合,室溫、避光條件下靜置12 h,使用前用無水乙醇稀釋,使其在30 ℃、734 nm處的光密度為0.70±0.02。測定時,在96 孔板中加入ABTS 工作液100 μL,然后再加入樣品溶液100 μL,振蕩混勻,10 min 后測定其在734 nm 波長處的光密度Dt,空白光密度D0為100 μL ABTS 工作液+100 μL 無水乙醇,測定100 μL 樣品溶液+100 μL 無水乙醇吸光度光密度Dr。ABTS 自由基清除率按下面公式計算:
羥自由基清除能力的測定:在96 孔板中加入50 μL 樣品,再加入50 μL 6 mol/L FeSO4溶液,100 μL 6 mol/L H2O2溶液,充分振蕩10 min。繼續(xù)加50 μL 6 mol/L 水楊酸乙醇溶液,室溫、避光放置30 min,510 nm 處測定光密度Dj;用水代替水楊酸,同樣的方法進行測定光密度Dj;D0為空白對照。羥自由基清除率按下面公式計算:
3 個樣品為一組,每個樣品重復(fù)測量3 次。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,使用JMP 進行顯著性分析,P< 0.05 表示差異顯著;利用excel 表中的correl 函數(shù)計算相關(guān)系數(shù)r,r越接近1,表示相關(guān)程度越強。繪圖使用Origin 2018。
使用CVS 和色差儀分別對287 色色卡測得L、a、b與L*、a*、b*,對數(shù)據(jù)進行線性回歸分析,結(jié)果如圖1 所示。建立回歸模型:
由此可以看出,CVS 與色差儀在測量均勻顏色樣品方面具有顯著線性相關(guān)規(guī)律(P< 0.05),且相關(guān)性較高,說明可以用CVS 代替色差儀測定物質(zhì)的顏色。并成功建立CVS 系統(tǒng)及其參數(shù),即在40 cm的攝影棚中采用兩盞平行燈(長40 cm、每盞燈均勻分布著120 顆LED 燈珠)照明,燈板可以在棚體框架上移動以靈活布光,色溫5 700 K,顯色指數(shù)(Ra)大于92%,兩盞燈都位于樣品上方的40 cm處并與樣品45°的角度,作為標(biāo)準(zhǔn)照明系統(tǒng)。數(shù)碼相機垂直放置在距離背景板30 cm 處,相機鏡頭與光源軸線之間的角度約為45°,拍攝背景為白色,相機設(shè)置為手動模式,ISO:400,鏡頭光圈f 為4.0,快門速度為1/160,分辨率為2 816 × 1 880像素,無變焦,無閃光??刹捎猛瑯拥臈l件去測定色澤均勻的物質(zhì)。
凡納濱對蝦在加熱時顏色變化并不均勻,同時CVS 是否可以檢測顏色的不斷變化,需對加熱過程中的凡納濱對蝦顏色變化進行研究。
使用CVS 對水煮加熱過程中凡納濱對蝦測定得L、a、b,使用色差儀對90 組加熱過程中的凡納濱對蝦測定得L*、a*、b*,用數(shù)據(jù)L、a、b與L*、a*、b*進行相關(guān)性分析。結(jié)果如圖2 所示,建立回歸模型:
結(jié)果表明對于凡納濱對蝦樣品顏色測量,CVS測定值L、a、b與色差儀測定值L*、a*、b*之間的線性關(guān)系顯著相關(guān)(P< 0.05),可使用CVS 代替色差儀測定樣品的色差。L值的相關(guān)性略低于a,b值,可能是因為在加熱過程中蝦肉蛋白變性及體內(nèi)水分的溶出,在測定時出現(xiàn)反光現(xiàn)象。通過色差儀和CVS 的測定的色值相關(guān)關(guān)系可知,CVS 可以用于顏色的連續(xù)化測定。但是由于在實際生產(chǎn)過程中,對蝦顏色是在升溫過程中發(fā)生顯著變化的,所以有必要進一步研究升溫過程中顏色及蝦青素的變化。
圖1 CVS 與色差儀測定標(biāo)準(zhǔn)色卡L*、a*、b*值的回歸模型,F(xiàn)ig.1 Regression model of L*,a*,and b* values of standard color card measured by CVS and colorimeter,
圖2 CVS 與色差儀測定加熱過程中對蝦的L*、a*、b*值的回歸模型Fig.2 Regression model of L*,a*,and b* values of shrimp during heating by CVS and colorimeter
由圖3 可知,90 ℃水浴加熱 720 s,在300 s前,L、a、b值均隨加熱時間的增加而增加,呈上升趨勢。0 s 時為生鮮蝦,中心溫度為4 ℃,L、a、b值為初始值,當(dāng)加熱時間為30 s 和60 s 時,蝦的中心溫度達(dá)到13.9 ℃和37.5 ℃;當(dāng)加熱時間為90 s 時,蝦的中心溫度為49.7 ℃,超過蝦青蛋白起始變性溫度45 ℃,此時蝦青蛋白已經(jīng)開始變性。當(dāng)加熱時間為300 s 時,蝦中心溫度已經(jīng)達(dá)到84.5 ℃,隨著加熱時間的延長,凡納濱對蝦的中心溫度逐漸增加從而導(dǎo)致蝦青蛋白逐漸受熱變性。隨著溫度升高,變性程度加劇,釋放出的蝦青素增多,使對蝦發(fā)生紅變、黃變現(xiàn)象,且變化程度逐漸增強。當(dāng)加熱時間大于300 s,隨著加熱時間的延長,蝦中心溫度升溫速率逐漸減緩,加熱360 s 時,中心溫度從74.1 ℃升到87 ℃,540 s 后逐漸趨于平穩(wěn),此時蝦青蛋白已完全變性。隨著加熱時間的延長,a、b值均無顯著變化(P> 0.05);L值隨著加熱時間的增加呈下降趨勢,但總體變化趨勢不大。這是因為凡納濱對蝦隨著加熱時間增加蝦青素發(fā)生降解,同時也與細(xì)胞內(nèi)外水分遷移以及肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生收縮、變性有關(guān)[20]。董志儉等[21]也發(fā)現(xiàn)在360 s 前隨著煮制時間的延長,凡納濱對蝦的L*、a*、b*值均呈上升趨勢;在360 s 后L*、a*、b*值逐漸趨于平穩(wěn),變化趨勢不大。
圖3 升溫加熱對凡納濱對蝦顏色的影響Fig.3 Effect of heating on the color of Litopenaeus vannamei
如圖4 所示,隨著加熱時間的延長,蝦青素的含量先逐漸增大然后減少,在300 s 時,蝦青素含量達(dá)到最高,為19.87 μg/g,之后蝦青素含量降低。加熱后蝦青素含量升高主要是因為蝦青素在對蝦體內(nèi)是與蛋白質(zhì)結(jié)合存在,加熱后蛋白質(zhì)變性,釋放出更多的蝦青素;而后降低可能是由于在加熱過程中蝦青素發(fā)生氧化降解以及隨著水分流失等原因[22]。蔡燕萍等[23]發(fā)現(xiàn)煮制過程中對蝦蝦青素含量隨加熱時間的呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,與本研究一致。結(jié)合圖3,在300 s 之前,蝦青素含量與L、a、b值都隨著加熱時間的延長呈上升趨勢,這是由于蝦青素的釋放引起的;在300 s 時,L、a、b值與蝦青素含量均達(dá)到最大值;而在300 s 之后,a值、L值呈下降趨勢,蝦青素也呈下降趨勢,說明對蝦色澤的變化與蝦青素含量是相關(guān)的,與Niamnuy等[24]得到的結(jié)論一致。
圖4 水煮加熱過程中凡納濱對蝦蝦青素含量的影響Fig.4 Change of the astaxanthin content of Litopenaeus vannamei during boiling
由圖5 可知,凡納濱對蝦中蝦青素對DPPH 自由基、羥基自由基和ABTS 自由基有較高的清除能力,隨著加熱時間的延長,蝦青素對DPPH 自由基的清除能力逐漸增強,對羥基自由基和ABTS 自由基的清除能力先增大后趨于平穩(wěn)。鮮蝦中蝦青素對DPPH 自由基的清除率為47.84%,加熱到720 s 時,DPPH 自由基的清除率升高到70.41%,蝦青素含量在加熱300 s 后降低,但其DPPH 自由基清除能力卻增強,這可能是因為加熱破壞了蝦青素的結(jié)構(gòu),使其結(jié)構(gòu)發(fā)生異構(gòu)化,蝦青素受熱后其反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成了順式結(jié)構(gòu)。楊澍等[6]研究發(fā)現(xiàn),凡納濱對蝦經(jīng)水煮 15 min 后,全反式蝦青素含量下降了51.84%,而13-順-蝦青素增加了17.59%,并產(chǎn)生了9-順-蝦青素,表明對蝦經(jīng)加熱后全反式蝦青素會轉(zhuǎn)化成順式異構(gòu)體。有文獻報道蝦青素的順式異構(gòu)體的抗氧化活性均高于全反式[25]。當(dāng)加熱時間為300 s時,蝦青素幾乎可以完全清除羥基自由基和ABTS自由基,與張麗瑤等[26]的實驗結(jié)果相似。
圖5 水煮加熱過程中凡納濱對蝦體外抗氧化活性的變化Fig.5 Change the vitro antioxidant activity of Litopenaeus vannamei during boiling
根據(jù)國際食品法典標(biāo)準(zhǔn)中要求,對蝦的熟制是將產(chǎn)品中心溫度加熱到 65~ 70 ℃[27],本研究中凡納濱對蝦水煮加熱300 s 時,中心溫度可達(dá)到84 ℃,已符合工廠生產(chǎn)的實際要求。對300 s 內(nèi)其L、a、b值和蝦青素含量及自由基清除率做相關(guān)分析,結(jié)果見表1。在加熱過程中L、a、b值變化與蝦青素含量、DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率、ABTS 自由基清除率均極顯著相關(guān)(P<0.01),并呈正相關(guān)關(guān)系,均隨著L、a、b值的增大而增大。L、a、b值均與DPPH 自由基清除率達(dá)到了極高相關(guān)性(r> 0.9),與羥基自由基清除率、蝦青素含量分別達(dá)到高度相關(guān)(r> 0.7);L值、b值與ABTS 自由基清除率達(dá)到極高相關(guān)(r> 0.9);L值、a值與羥基自由基清除率的相關(guān)性較低。
表1 顏色值、蝦青素及抗氧化性的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between color value and astaxanthin and antioxidant properties
蝦青素隸屬于萜烯類不飽和化合物,其結(jié)構(gòu)中包含共軛雙鍵的長鏈具有一定的顯色規(guī)律,隨著雙鍵數(shù)量的增多,其吸收光譜的波長向著可見光區(qū)不斷移動,長鏈的兩端存在羥基和羰基官能團,具有更高的電子效應(yīng),可以吸引自由基或向自由基提供電子,具有強大的抗氧化能力[28]。加熱后由于含有共軛雙鍵的長鏈被破壞,而引起光密度變化,被用作各種類胡蘿卜素捕獲自由基的方法[29]。表1 中顏色變化L、a、b值與蝦青素變化的相關(guān)性均達(dá)0.8以上,說明對蝦加熱變色與蝦青素的含量相關(guān),同時對蝦中還有其他色素類物質(zhì)可能也會對顏色產(chǎn)生影響[30]。本研究發(fā)現(xiàn)蝦肉中蝦青素含量較少,但加熱后仍保留較強的抗氧化活性,可通過加熱時間和加熱過程中對蝦顏色的變化判斷其抗氧化作用。
本研究結(jié)果表明CVS 與色差儀測定的蝦肉色值呈線性相關(guān),說明使用CVS 對蝦顏色進行連續(xù)化測定是可行的,本研究建立的CVS 法更為簡單和方便,可以直接通過photoshop 軟件進行顏色值轉(zhuǎn)換,操作簡單更易普及,為對蝦品質(zhì)的無損檢測、連續(xù)化檢測方法的開發(fā)提供了理論依據(jù);在300 s前L、a、b值均隨加熱時間的增加而增加,呈上升趨勢;蝦青素在加熱時間為300 s 時含量最高;隨著加熱時間的延長,DPPH 自由基的清除能力越好,羥基自由基清除率和ABTS 自由基清除率呈先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢;在300 s 內(nèi),顏色值與蝦青素、自由基清除率顯著相關(guān),均呈上升趨勢,說明加熱初期可以通過顏色判斷凡納濱對蝦蝦青素及抗氧化活性變化。