萬 瓊，郝婧羽，張新艷，鞠 愷，王文靜，任迎春，黃 鑫

(西安科技大學 建筑與土木工程學院，陜西 西安 710054)

0 引言

硝酸鹽在厭氧或缺氧狀態(tài)下可以發(fā)生硝酸鹽還原過程，自然條件下，完全反硝化過程為主要反應過程，而在人工濕地、土壤、河流、湖泊和海洋底泥等生態(tài)環(huán)境中，存在明顯的硝酸鹽異化還原為銨(dissimilatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)的過程[1-6]。近年來，在活性污泥中也發(fā)現(xiàn)了DNRA氨化過程[7-11]。DNRA氨化將硝化生成的硝酸鹽氮還原為氨氮，浪費曝氣耗能、降低系統(tǒng)碳源利用率，進一步影響系統(tǒng)脫氮除磷性能。因此，探討活性污泥中DNRA氨化的影響因素，對于減少或消除DNRA氨化，提高脫氮效率有重要意義。

目前，針對DNRA氨化過程影響因素的研究多集中在生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域。生態(tài)環(huán)境中已發(fā)現(xiàn)硝酸鹽限制、碳源、碳氮比是影響DNRA氨化和反硝化競爭的關(guān)鍵因素[2-3]，除此之外，溫度[12]、pH[13]、氧化還原電位[14]、高鹽[15]、硫化物[16]、水力停留時間(hydraulic retention time，HRT)[17]和污泥齡(sludge retention time, SRT)[3]等也會影響兩者競爭。DNRA氨化環(huán)境具有低流速(HRT長、稀釋率較高、硝酸鹽限制)、低擾動(水力剪切力弱、SRT長)和具備載體等共性[16-20]，而城市污水處理廠具備低流速、連續(xù)流、硫酸鹽含量高等特點，因此，研究流態(tài)、水力停留時間和硫離子(sulfion, S2-)對DNRA氨化的影響，對于提高污水廠脫氮效率具有重要意義。

本文通過連續(xù)流和間歇流兩種流態(tài)下硝酸鹽還原試驗，分析了HRT和投加硫化物(S2-)對反應過程中化學需氧量(chemical oxygen demand, COD)、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化的影響，且針對DNRA氨化過程中的微生物進行高通量測序，探討流態(tài)、HRT和S2-的投加對活性污泥DNRA氨化的影響規(guī)律。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

試驗污泥取自實驗室兩個反應器(1#間歇流和2#連續(xù)流)。兩個反應器均采用有機玻璃制成，結(jié)構(gòu)為立式圓柱形，內(nèi)徑14 cm，外徑16 cm，高50 cm，有效體積5.0 L。反應器啟動時，接種污泥為西安市某污水處理廠A2O工藝剩余污泥。1#間歇流反應器進水0.25 L/min，出水1.25 L/min，加熱攪拌300 min。2#連續(xù)流反應器(連續(xù)進水，間歇出水)進水0.008 1 L/min，出水1.25 L/min，加熱攪拌310 min。兩個反應器運行溫度是25 ℃，HRT為6 h，SRT為10 d。測試開始時均已穩(wěn)定運行140 d，系統(tǒng)COD去除率分別是70.7%及71.7%，硝酸鹽去除率分別是28%及31%，出水氨氮質(zhì)量濃度分別為2.32 mg/L和2.68 mg/L。

試驗廢水為人工配制，按照文獻[17]提供的活性污泥系統(tǒng)DNRA菌富集方法馴化活性污泥：采用易降解基質(zhì)乙酸鈉為碳源，磷酸二氫鉀為磷源，硝酸鈉為氮源和電子受體，CH3COONa 770 mg/L，NaNO3100 mg/L，KH2PO472 mg/L，微量元素溶液使用量為0.6 mL/L，每升組份如下：90 g MgSO4·7H2O，14 g CaCl2·5H2O，7.5 g FeSO4·7H2O，0.15 g H3BO3，0.03 g CuSO4·5H2O，0.18 g KI，0.12 g MnCl2·H2O，0.06 g Na2MoO4·2H2O，0.12 g ZnSO4·7H2O，0.15 g CoCl2。配水中加入1 mol/L HCl調(diào)節(jié)初始pH值為6.50±0.05。為消除氨氮的影響，試驗廢水采用純水配制。

1.2 試驗方法

本試驗反應器為500 mL廣口瓶，有效體積為500 mL。試驗步驟如下：選取1#間歇流反應器中1 500 mL的泥水混合液離心淘洗3次，均分成3份，分別加入空白試驗(只投加碳源COD 300 mg/L，未投加硝酸鹽氮和S2-)、HRT試驗(投加硝酸鹽氮80 mg/L和碳源COD 300 mg/L，未投加S2-)與S2-投加試驗(投加20 mg/L的S2-、碳源COD 300 mg/L及硝酸鹽氮80 mg/L)，反應器分別記為1a、1b、1c。用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)各反應器初始pH為6.50±0.05。且用高純氮氣曝氣3 min以脫除反應器混合液中的氧氣。將反應器置于恒溫旋轉(zhuǎn)水浴搖床中，控制轉(zhuǎn)速為140 r/min，溫度為30 ℃，分別在HRT為0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h時取樣，進行相關(guān)指標的測定分析。同樣選取2#連續(xù)流反應器中的泥水混合液重復如上試驗，反應器分別記為2a、2b、2c。反應結(jié)束后，取1b、1c、2b、2c的污泥進行高通量測序。

1.3 分析方法

試驗中常規(guī)水質(zhì)項目的測定采用國家標準方法[21]，pH由pH計(PHS-3C，雷磁)測定。氮物料平衡計算時，總氮的損失量認為是通過反硝化生成了N2或N2O，氨氮質(zhì)量濃度均已除去空白試驗中氨氮產(chǎn)生的質(zhì)量濃度。

高通量測序送至上海美吉公司測定，首先提取污泥脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)，在DNA樣品定量和檢查合格后，進行高通量測序。引物選取V3-V4區(qū)Nobar_341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)及Nobar_805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)。具體擴增程序如文獻[22]，測序平臺為Illumina Miseq，進行雙端測序。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同流態(tài)下HRT和S2-的投加對硝酸鹽還原方式的影響

2.1.1 間歇流下HRT和S2-投加對硝酸鹽還原方式的影響

取1#間歇流反應器中馴化的活性污泥作批式試驗，得到空白試驗樣1a、HRT試驗樣1b和S2-投加試驗樣1c的COD、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度隨HRT的變化，如圖1所示。

空白試驗因未投加任何形式的氮和S2-，其他運行條件相同，增加的氨氮可認為是由內(nèi)源呼吸產(chǎn)生。由圖1a可得：當HRT在36 h以內(nèi)，氨氮質(zhì)量濃度均小于5.00 mg/L，因此內(nèi)源呼吸的影響可忽略不計。當HRT為48 h時，氨氮質(zhì)量濃度為11.40 mg/L，且COD質(zhì)量濃度有所上升，此時活性污泥內(nèi)源呼吸的影響較大，因此不再繼續(xù)延長HRT。

(a) 空白試驗，無硝酸鹽氮，無S2- (b) HRT試驗，c(碳)/c(氮)=300/80，無S2-

由圖1b可得：當HRT小于6 h時，硝酸鹽氮質(zhì)量濃度下降較快，亞硝酸鹽氮積累較多(最高積累到28.00 mg/L，3 h)，生成含氮氣體較多，反硝化占據(jù)主導地位。氨氮質(zhì)量濃度較低(0.43 mg/L)，只發(fā)生了少量DNRA氨化。隨著HRT逐漸延長，DNRA作用逐漸增強，36 h時達到峰值(氨氮質(zhì)量濃度為15.98 mg/L)，之后趨于平緩。說明延長HRT能夠促進DNRA氨化，這也與文獻[23]研究結(jié)果類似，世代時間(或生長速度)是影響反硝化和DNRA對硝酸鹽競爭的關(guān)鍵要素，反硝化在較短的SRT(高增長率)下占優(yōu)勢。且DNRA氨化菌還原單位硝酸鹽所需的碳源多，受到電子供應瓶頸的影響，DNRA反應速率較低(所需HRT較長)，世代時間較長(所需SRT較長)。

由圖1b與圖1c對比可知：當HRT為6 h時，投加S2-后，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度增加6.83 mg/L，說明投加S2-促進了亞硝酸鹽氮的積累，從而有利于將部分亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氨氮。當HRT為36 h時，投加S2-后氨氮質(zhì)量濃度為17.83 mg/L，比投加前增加11.58%。表明投加S2-對于間歇流馴化的活性污泥系統(tǒng)的DNRA氨化有促進作用，但不顯著。

2.1.2 連續(xù)流下HRT和S2-的投加對硝酸鹽還原方式的影響

取2#連續(xù)流反應器中馴化的活性污泥作批式試驗，得到空白試驗樣2a、HRT試驗樣2b與S2-投加試驗樣2c的COD、氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度隨HRT的變化，如圖2所示。

與間歇流相比，內(nèi)源呼吸對連續(xù)流的影響較小。由圖2a可得：當HRT為48 h時，空白試驗反應器產(chǎn)生氨氮質(zhì)量濃度為5.90 mg/L。與間歇流類似，為避免內(nèi)源呼吸影響，HRT同樣不適合再延長。

由圖2b可知：當HRT由6 h延長至48 h時，氨氮質(zhì)量濃度由2.03 mg/L升至20.78 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度峰值比間歇流條件下增加4.80 mg/L。文獻[17]在富集培養(yǎng)DNRA菌時也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)流的環(huán)境更適合DNRA菌的生長。連續(xù)流條件下HRT為48 h更有利于DNRA氨化。

(a) 空白試驗，無硝酸鹽氮，無S2- (b) HRT試驗，c(碳)/c(氮)=300/80，無S2-

對比圖2b和圖2c可知：當HRT為36 h時，投加S2-后，氨氮質(zhì)量濃度達到峰值，為24.49 mg/L，比投加前增加24.82%。說明投加S2-對DNRA氨化有促進作用，且這種促進作用對于連續(xù)流馴化的活性污泥更有效果。

2.2 不同流態(tài)下微生物群落差異

取反應48 h后的活性污泥進行高通量測序，測定污泥中所含DNRA菌的豐度及群落結(jié)構(gòu)的組成。并比較投加S2-前后活性污泥中所含DNRA菌的占比及細菌的α-多樣性指數(shù)，驗證S2-對DNRA菌的促進作用。結(jié)果如圖3、圖4及表1所示。

表1 細菌的α-多樣性指數(shù)

2.2.1 間歇流下投加S2-前后的DNRA細菌群落組成

參照文獻[7,9,24-25]中的生態(tài)環(huán)境及活性污泥常見DNRA功能菌屬，本試驗中間歇流下投加S2-前的樣本中主要DNRA菌屬(見圖3)為：叢毛單孢菌屬(Comamonas)(相對豐度最大，為29.82%)，接下來依次為梭菌屬(Clostridium)(相對豐度為7.01%)、索氏菌屬(Thauera)(相對豐度為6.74%)、厭氧醋菌屬(Acetoanaerobium)(相對豐度為4.18%)、鐵桿菌屬(Ferruginibacter)(相對豐度為3.51%)、紅細菌屬(Rhodobacter)(相對豐度為0.93%)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)(相對豐度為0.71%)。間歇流下投加S2-前DNRA功能菌屬的總相對豐度為52.90%。投加S2-后，樣本中的主要DNRA菌屬發(fā)生了明顯變化。叢毛單孢菌屬(Comamonas)的相對豐度降至16.82%，厭氧醋菌屬(Acetoanaerobium)增至14.52%，索氏菌屬(Thauera)增至6.78%，鐵桿菌屬(Ferruginibacter)增至5.06%，紅細菌屬(Rhodobacter)增至1.35%，氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)增至0.74%。樣本中新增變形菌屬(Proteocatella)(相對豐度為5.58%)和不動桿菌屬(Acinetobacter)(相對豐度為1.02%)。投加S2-后DNRA功能菌屬的總豐度為51.87%，與投加前相差不大。說明在間歇流條件下活性污泥系統(tǒng)中，投加一定質(zhì)量濃度的S2-可以引起系統(tǒng)中DNRA功能菌菌群結(jié)構(gòu)變化，但對DNRA功能菌的總相對豐度影響不大。

圖3 間歇流下投加S2-前后的DNRA細菌群落組成

2.2.2 連續(xù)流下投加S2-前后的DNRA細菌群落組成連續(xù)流下投加S2-前的樣本中主要DNRA菌屬(見圖4)為：紅細菌屬(Rhodobacter)(相對豐度最大，為16.02%)、叢毛單孢菌屬(Comamonas)(相對豐度為8.78%)、脫氮單孢菌屬(Dechloromonas)(相對豐度為2.37%)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)(相對豐度為2.00%)、索氏菌屬(Thauera)(相對豐度為1.38%)，這些優(yōu)勢菌屬大多具有脫氮除磷功能，生長周期短，生長速率遠大于自養(yǎng)菌，環(huán)境適應性強[26]。連續(xù)流下投加S2-前DNRA功能菌屬的總相對豐度為30.55%。投加S2-后索氏菌屬(Thauera)的相對豐度增加至42.61%，紅細菌屬(Rhodobacter)降至5.51%，叢毛單孢菌屬(Comamonas)降至2.49%，氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)降至0.98%，樣本中新增假單胞菌屬(Pseudomonas)(相對豐度為0.82%)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(相對豐度為0.47%)和鐵桿菌屬(Ferruginibacter)(相對豐度為0.32%)。投加S2-后DNRA功能菌屬的總豐度為53.20%，比投加前增加了22.65%。說明在連續(xù)流活性污泥系統(tǒng)中，投加一定質(zhì)量濃度的S2-可顯著改變DNRA菌群結(jié)構(gòu)和提高DNRA氨化菌的相對豐度，且這種促進作用對于連續(xù)流馴化的活性污泥更為顯著。

圖4 連續(xù)流下投加S2-前后的DNRA細菌群落組成

比較圖3和圖4可知：間歇流和連續(xù)流條件下活性污泥系統(tǒng)中，DNRA氨化菌菌種和菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。連續(xù)流緩慢但不間斷地提供基質(zhì)，細菌處于饑餓狀態(tài)的較少，而間歇流一次性提供充足的基質(zhì)，其余時間細菌均處于饑餓狀態(tài)，因此部分細菌無法適應而死亡，繼而產(chǎn)生新的菌群種類[27]，如變形菌屬和不動桿菌屬等。投加一定質(zhì)量濃度的S2-后，較高的硫化物條件促進了硫化細菌(脫硫球菌科、酸鐵菌科、黃單胞菌科)和硫酸鹽還原菌(脫硫單胞菌科、脫硫桿菌科)的活性及種群數(shù)量[20]，顯著提高了菌種的多樣性。

2.2.3 細菌α-多樣性指數(shù)分析

本研究選取豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))對菌群的α-多樣性進行分析，結(jié)果見表1。由表1可得：4個樣本的覆蓋率均達到90%以上，說明此測序結(jié)果反映了樣本的真實情況。連續(xù)流樣本的Chao1指數(shù)小于間歇流，且投加S2-后的樣本Chao1指數(shù)高于投加前，說明連續(xù)流系統(tǒng)下種群的豐富度低于間歇流，投加S2-能夠增加樣本的豐富度。連續(xù)流樣本Shannon指數(shù)低于間歇流，投加S2-后的樣本Shannon指數(shù)高于投加前。說明連續(xù)流下種群的多樣性低于間歇流，多樣性高說明系統(tǒng)更穩(wěn)定，但是對于富集DNRA氨化菌的系統(tǒng)，多樣性高意味著富集效果較差，且連續(xù)流DNRA氨化菌富集數(shù)量(53.20%)高于間歇流(51.87%)，因此連續(xù)流富集效果優(yōu)于間歇流，這與前面的試驗結(jié)果一致。綜上，連續(xù)流序批式反應器(sequencing batch reactor, SBR)富集效果優(yōu)于間歇流，但間歇流的種群豐富度和多樣性更高。S2-的投加增加了樣本微生物豐度及多樣性。

3 結(jié)論

(1)延長HRT對不同流態(tài)下活性污泥中DNRA氨化速率均具有明顯促進作用。

(2)投加S2-對不同流態(tài)下活性污泥中DNRA氨化速率均具有促進作用，且這種促進作用在連續(xù)流下比間歇流下的效果更為明顯。投加S2-后，連續(xù)流下DNRA細菌豐度增加了約22.65%。

(3)連續(xù)流系統(tǒng)比間歇流系統(tǒng)更適合DNRA細菌的生長繁殖。兩種流態(tài)下DNRA優(yōu)勢菌略有不同。在間歇流樣本中DNRA氨化優(yōu)勢菌是叢毛單孢菌屬(Comamonas)，在連續(xù)流樣本中優(yōu)勢菌是紅細菌屬(Rhodobacter)和索氏菌屬(Thauera)。