陳其煌

摘 要：建立QuEChERS結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中氯霉素方法。樣品經(jīng)水相分散后用乙腈提取，經(jīng)QuEChERS方法凈化后，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量。以超純水和甲醇作為流動(dòng)相，用Hypersil GOLD C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI-）、負(fù)離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明：氯霉素在5.0～200.0 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9992）。在10.0、20.0、50.0 μg·kg-1添加水平下的回收率為84.2%～89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為6.5%～8.8%，檢出限（以信噪比>3計(jì)）為0.2 μg·kg-1，定量限（以信噪比>10計(jì)）為0.6 μg·kg-1。該方法精密度好，靈敏度高，能簡(jiǎn)便地準(zhǔn)確測(cè)定飼料中的氯霉素。

關(guān)鍵詞：QuEChERS;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法;氯霉素;飼料

中圖分類號(hào)：S 816.17 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）03-0046-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.03.010

Abstract： This study aimed to establish a method for the determination of chloramphenicol in feed by using QuEChERS combined with the high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method. After water dispersion， the samples were extracted with acetonitrile. And then after the purification by QuEChERS method， the samples were determined by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry and quantified by external standard method. By using the ultrapure water and methyl alcohol as mobile phases， the gradient elution was carried out by Hypersil GOLD C18 column （1.9 μm， 2.1 mm×100 mm）. And then the qualitative and quantitative analysis was carried out by using the electrospray ionization （ESI-） and anion scanning multiple reaction monitoring （MRM） modes. The results showed that the linear relation of chloramphenicol was good in the range of 5.0-200.0 ng·mL-1 （r=0.9992）. The recoveries at the adding levels of 10.0， 20.0 and 50.0 μg·kg-1 ranged from 84.2% to 89.7%， the relative standard deviations （n=6） were 6.5%-8.8%， the limits of detection （based on S/N>3） were 0.2 μg·kg-1， and the limits of quantitation （based on S/N>10） were 0.6 μg·kg-1. The method had good precision， high sensitivity and could be used to determine the chloramphenicol in feed simply and accurately.

Key words： QuEChERS;High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry;Chloramphenicol;Feed

氯霉素（Chloramphenicol，分子式：C11H12Cl2N2O5，分子量：323.14，CAS：56757）屬于酰胺醇類抗生素，是一種廣譜抑菌性抗生素，對(duì)多種病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖上。氯霉素會(huì)抑制骨髓細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，對(duì)人類和動(dòng)物的骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞具有毒性作用，不僅可引起細(xì)胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、二重感染等，對(duì)人體產(chǎn)生毒性[1-2]。為進(jìn)一步規(guī)范養(yǎng)殖用藥行為，保障動(dòng)物源性食品安全，2019年12月27日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第250號(hào)公告，將氯霉素列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單。因此，加強(qiáng)對(duì)飼料中氯霉素殘留的檢測(cè)具有非常重要意義。

目前，飼料中氯霉素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）[3-5]、氣相色譜法[6]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、高效液相色譜法（HPLC）[9-10]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）[11-19]，大多采用固相萃取或液液分配萃取凈化，前處理操作比較復(fù)雜煩瑣，溶劑消耗量大。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法是由Anastassiades等于2003年提出[20]，該方法在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留及非法添加物測(cè)定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并在應(yīng)用中不斷改善，已成為農(nóng)藥獸藥等殘留定性定量的方法之一[21-26]。采用QuEChERS方法測(cè)定飼料中氯霉素尚未見(jiàn)研究報(bào)道，本研究建立的QuEChERS結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中氯霉素的方法，操作快捷、簡(jiǎn)便、實(shí)用，靈敏、準(zhǔn)確可靠，可為檢測(cè)飼料中是否非法添加氯霉素提供可靠手段，滿足飼料中氯霉素的快速測(cè)定要求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

SHIMADZU 30A（CBM30ACTO30ALC30ADSIL30ACDGU20A5R，日本Shimadzu公司）;Triple Quad 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）;KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;MilliQ去離子水發(fā)生器（美國(guó)MILLIPORE公司）;CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）; PL602S電子天平[梅特勒托利多（上海）有限公司];VORTEX GENIUS 3 旋渦混合器（德國(guó)IKA公司）;VXⅢ多管渦旋振蕩器[安簡(jiǎn)（北京）科技有限公司]。

1.2 試驗(yàn)試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（Chloramphenicol）（德國(guó) Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，純度99.9%）;甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭绹?guó)TEDIA公司）;甲酸為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;氯化鈉為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;實(shí)驗(yàn)室用水為MilliQ高純水;QuEChERS萃取鹽包（Part No.59827555，內(nèi)含1.5 g NaCl、6.0 g MgSO4，美國(guó)Agilent公司）;QuEChERS凈化管A（Part No.5982

5421CH，2 mL，內(nèi)含50 mg PSA、50 mg C18EC、150 mg MgSO4，美國(guó)Agilent公司）;QuEChERS凈化管B（Part No.59825421CH，2 mL，內(nèi)含50 mg PSA、50 mg C18EC、50 mg GCB、150 mg MgSO4，美國(guó)Agilent公司）;有機(jī)相針式濾器（尼龍，13 mm，0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 （1）樣品制備。按照GB/T 14699.1-2005/ISO 6497：2002進(jìn)行采樣[27]，按GB/T 20195-2006/ISO 6498：1998[28]要求對(duì)樣品進(jìn)行制樣處理，飼料樣品粉碎后過(guò)1 mm 孔徑的分析篩，混勻后裝入密閉封口塑料袋中，避光冷藏保存，備用。（2）提取與凈化。準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）飼料樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入超純水4 mL，浸泡渦旋充分混勻，再準(zhǔn)確加入乙腈4.0 mL和4 g氯化鈉，渦旋混勻并振蕩5 min后，8000 r·min-1離心10 min，取出上層有機(jī)相1 mL至QuEChERS凈化管A內(nèi)，渦旋混勻并振蕩2 min，于15000 r·min-1高速離心10 min，取上清液適量過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。同步做空白提取液和空白添加試樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即含氯霉素100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光保存?zhèn)溆茫行?個(gè)月。量取儲(chǔ)備液用甲醇稀釋到1 μg·mL-1，作為氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-18℃避光保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月。精密稱取適量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液用同類基質(zhì)空白樣品提取液配制，制得5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1對(duì)照溶液，供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3 提取溶劑和提取方式選擇 分別采用乙腈、0.1%甲酸乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈溶液、0.5%甲酸乙腈溶液、1.0%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑，其余步驟均按1.3.1

（2）提取與凈化進(jìn)行，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行提取回收率試驗(yàn)，確定最佳提取溶劑。

取陰性飼料樣品添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液后，在加入水和乙腈后，分別同步采用渦旋振蕩和超聲2種方式進(jìn)行提取，其余步驟均按1.3.1（2）提取與凈化進(jìn)行，比較考察2種提取方式的回收率情況。

1.3.4 凈化條件優(yōu)化 試驗(yàn)進(jìn)行QuEChERS凈化管A和QuEChERS凈化管B兩種凈化管的加標(biāo)回收率和凈化效果對(duì)比試驗(yàn)，分別采用A、B兩種凈化管凈化樣品提取液，其他步驟均按1.3.1（2）操作進(jìn)行。

1.3.5基質(zhì)效應(yīng) 取陰性飼料樣品按1.3.1（2）提取與凈化制備空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行上機(jī)分析，比較考察氯霉素的響應(yīng)強(qiáng)度。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）;流動(dòng)相：A相為超純水，B相為甲醇;流速：0.30 mL·min-1;洗脫程序：0～0.5 min維持10% B，0.5～4 min線性變化至95% B，4～7 min維持95% B，7.0～7.1 min線性變化至10% B，并維持到10 min。柱溫30℃。進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI-），負(fù)離子掃描模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;電噴霧電壓（IS）為-4500 V，輔助氣溫度（TEM）550℃，霧化氣（GS1）壓力50 psi，輔助氣（GS2）壓力50 psi，氣簾氣（CUR）壓力35 psi。

1.5 定性與定量分析

在相同試驗(yàn)條件下，檢出物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，并且樣品譜圖中定性離子的相對(duì)豐度與同等條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，允許偏差符合歐盟2002/657/EC《質(zhì)譜分析方法鑒定點(diǎn)數(shù)》中的規(guī)定，則可判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入儀器檢測(cè)，獲得質(zhì)量濃度與響應(yīng)值（色譜峰面積）線性相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

甲醇和乙腈常被用于反相液相色譜的流動(dòng)相，本試驗(yàn)分別以乙腈和甲醇作為液相洗脫流動(dòng)相考察氯霉素的分離度和靈敏度。結(jié)果表明以乙腈和甲醇2種有機(jī)試劑作為流動(dòng)相都能達(dá)到分離度要求，靈敏度差別不大。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，本研究選擇甲醇作為洗脫流動(dòng)相。以甲醇和超純水為流動(dòng)相，優(yōu)化梯度洗脫方法，縮短分析時(shí)間，確保保留時(shí)間穩(wěn)定，獲得理想的峰形和靈敏度。圖1為5.0 ng·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

氯霉素由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中羥基、酰胺鍵的存在，具有很強(qiáng)的極性，在負(fù)離子模式下有較高的響應(yīng)[14]。 在電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-）下進(jìn)行全掃描，采用質(zhì)量濃度1.0 μg·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以10.0 μL·min-1的流速針泵連續(xù)注入質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描，獲得[MH]的準(zhǔn)分子離子峰，以其作為母離子進(jìn)行轟擊，獲得碎片子離子，選擇信號(hào)較強(qiáng)的兩個(gè)碎片子離子和母離子組成兩對(duì)監(jiān)測(cè)離子對(duì)，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）、入口電壓（EP）和碰撞室出口電壓（CXP）等參數(shù)。優(yōu)化獲得的MRM離子對(duì)及質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2.3 提取溶劑和提取方法的確立

飼料基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的干擾物，會(huì)干擾目標(biāo)化合物的分析，這就要求前處理必須能夠凈化飼料復(fù)雜基質(zhì)， 同時(shí)又要能夠提取出目標(biāo)化合物。氯霉素易溶于乙腈、甲醇和乙酸乙酯，考慮到甲醇和乙酸乙酯的鹽析效果較差，不利于分層，因此選用乙腈作為主提取溶劑做進(jìn)一步考察優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，用乙腈、0.1%甲酸乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈溶液、0.5%甲酸乙腈溶液、1.0%甲酸乙腈溶液提取的添標(biāo)回收率分別為83.5%～89.4%、82.1%～86.3%、81.3%～90.2%、68.7%～76.6%、65.3%～75.2%，前三者差別不大，均比用后二者提取的回收率高。綜合考慮選擇乙腈作為提取溶劑。

試驗(yàn)還考察比較渦旋振蕩和超聲2種提取方式對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，渦旋振蕩和超聲2種提取方式的回收率分別為84.6%～87.2%、83.8%～85.6%，綜合考慮操作簡(jiǎn)便和時(shí)耗等因素，最終確定選用渦旋振蕩提取方式。

2.4 凈化條件優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，凈化管A凈化后的樣品加標(biāo)回收率在80%～110%，而凈化管B凈化后的樣品加標(biāo)回收率在65%～80%，兩種凈化管凈化后的樣品色譜圖雜峰不多，均有較好的凈化效果，因此選擇凈化管A作為前處理凈化管。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)分析

取陰性飼料樣品按1.3.1（2）提取與凈化制備空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同儀器條件下，相同濃度的氯霉素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜響應(yīng)值均比溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值高，表明氯霉素在飼料基質(zhì)中有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，提高準(zhǔn)確性，本方法采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 方法的線性范圍 采用本研究建立的方法獲得的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，在5.0～200.0 ng·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，氯霉素質(zhì)量濃度X與其峰面積Y的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=5.43×103X+8.43×103，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9992。圖2為氯霉素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

2.6.2 方法的靈敏度 以空白樣品低水平加標(biāo)測(cè)試方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的濃度為方法的檢出限，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為方法的定量限。通過(guò)計(jì)算，該方法檢出限為0.2 μg·kg-1，定量限為0.6 μg·kg-1。參考GB/T 21108-2007《飼料中氯霉素的測(cè)定 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》中氯霉素的方法最低檢出限為5 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1[11]，農(nóng)業(yè)部2483號(hào)公告-8-2016《飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》中氯霉素的方法檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1 μg·kg-1[19]，本方法的靈敏度能夠滿足檢測(cè)要求。

2.6.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度 分別添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液至空白飼料樣品中，制得10.0、20.0、50.0 μg·kg-1 3種添加水平的樣品各6個(gè)，按照建立的方法處理樣品并進(jìn)行HPLCMS/MS分析測(cè)定，圖3～4為空白飼料樣品和加標(biāo)水平為50.0 μg·kg-1的飼料樣品MRM色譜圖。結(jié)果（表2）表明，氯霉素的回收率為84.2%～89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為6.5%～8.8%，本方法具有良好的準(zhǔn)確性，能夠滿足獸藥殘留的分析要求。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

用本方法對(duì)12份來(lái)自飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，所測(cè)樣品均未檢出氯霉素殘留。樣品譜圖本底干凈沒(méi)有干擾峰，質(zhì)控樣品添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率為85.7%，符合GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的相關(guān)規(guī)定[29]。

3 結(jié)論與討論

本研究采用QuEChERS方法前處理用于飼料中氯霉素的測(cè)定，結(jié)果表明，氯霉素在5.0～200.0 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9992）。在10.0、20.0、50.0? μg·kg-1添加水平下的回收率為84.2%～89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為6.5%～8.8%，檢出限（以信噪比>3計(jì)）為0.2 μg·kg-1，定量限（以信噪比>10計(jì)）為0.6 μg·kg-1。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，石墨化碳黑（GCB）對(duì)色素有較強(qiáng)的吸附作用，在用含有GCB的凈化管凈化后，樣品顏色較淺，但氯霉素添標(biāo)回收率降低，表明GCB對(duì)樣品中的氯霉素有吸附損失，本試驗(yàn)進(jìn)樣量較少，因此綜合考慮選擇不添加GCB。如遇樣品色素較深且需要大體積進(jìn)樣時(shí)，建議在確?；厥章实耐瑫r(shí)，優(yōu)化適量添加GCB。本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中氯霉素的方法，樣品經(jīng)水相分散后，用乙腈提取QuEChERS方法凈化，以基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。樣品前處理簡(jiǎn)單，消耗有機(jī)溶劑較少，線性范圍寬，方法的定量限低，精密度和準(zhǔn)確度高，符合方法學(xué)要求。該方法適合于批量實(shí)際樣品的快速檢測(cè)，能夠滿足藥物殘留分析要求，可用于飼料中氯霉素非法添加的檢測(cè)監(jiān)控。由于條件等限制，本試驗(yàn)未將同屬于酰胺醇類抗生素的甲砜霉素和氟甲砜霉素同時(shí)進(jìn)行考察試驗(yàn)，下一步將進(jìn)行深入考察探究，以滿足樣品多項(xiàng)目同時(shí)測(cè)定的需要。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）