ATP參與缺氮誘導(dǎo)水稻主根伸長的研究分析

夏子怡，梁晶晶，徐曉蕊，秦 誠

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物RNA信號傳導(dǎo)中心，浙江 杭州 311121)

線粒體是真核生物細胞中的“能量工廠”，主要合成腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，用于真核生物的細胞生長和生命維持[1].植物線粒體中含有320多種蛋白質(zhì)，大多數(shù)蛋白質(zhì)由細胞核基因組編碼，并在細胞質(zhì)中合成和修飾后轉(zhuǎn)運到線粒體[2].然而，線粒體也有自己的基因組并可以合成蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用[3].

在蛋白質(zhì)合成過程中，有20個氨基?；霓D(zhuǎn)移RNA(aminoacylated transfer-RNA，aa-tRNA)參與蛋白質(zhì)合成.大多數(shù)aa-tRNA是由aa-tRNA合成酶以直接途徑形成的，該酶將每個tRNA和其關(guān)聯(lián)的氨基酸?；?但是，有4個aa-tRNA可以通過間接途徑形成，其中之一是線粒體Glutamyl-tRNAGln(Gln-tRNAGln)[4].在間接途徑中，需要tRNA依賴性酰胺轉(zhuǎn)移酶(tRNA-dependent amidotransferase，AdT)將錯誤?；腉lu-tRNAGln轉(zhuǎn)化為Gln-tRNAGln.

作為tRNA依賴性酰胺轉(zhuǎn)移酶(AdT)的一個亞基，GatB(Glutamyl-tRNAGlnamidotransferase B)位于線粒體并參與Gln-tRNAGln的合成，進而影響線粒體中的蛋白質(zhì)翻譯，并參與線粒體的結(jié)構(gòu)功能.水稻OsGatB(LOC_Os11g34210)編碼水稻線粒體AdT亞基GatB的基因，主要在水稻根中表達.本課題組在前期的研究[5]中，通過甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)誘變獲得了一個水稻Osgatb突變體，該突變體主要表現(xiàn)為主根變短.進一步研究發(fā)現(xiàn)，Osgatb突變體根細胞中的線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，尤其是細胞中ATP含量下降，從而影響主根的生長，造成短根.但是Osgatb突變體中地上部長度和不定根數(shù)與野生型相比沒有明顯差異.

氮素是植物生長發(fā)育所需的一種極為重要且需求量最大的營養(yǎng)元素，它不僅是植物結(jié)構(gòu)的組成元素，也是植物中代謝物質(zhì)酶的主要成分之一，對植物的許多生理活動，如水分吸收、光合作用、組織生長等都起到非常重要的作用.植物吸收氮素有很多途徑，但最主要的途徑是通過根吸收土壤中的銨鹽和硝酸鹽.由于外部環(huán)境、氮的有效性以及植物自身碳氮平衡狀態(tài)的不同，不同的植物對銨鹽和硝酸鹽吸收有所偏好，但大部分植物在一定比例的銨鹽和硝酸鹽的條件下生長最好.而當外界環(huán)境中氮素缺乏時，植物為了吸收足夠的營養(yǎng)會誘導(dǎo)根系伸長[6].

雖然關(guān)于缺氮誘導(dǎo)植物主根伸長的研究有很多，但其作用機制尚不完全清楚.本研究發(fā)現(xiàn)，短根突變體Osgatb和野生型(wide-type，WT)相反，缺氮處理后主根變短，但地上部長度沒有明顯差異.進一步研究發(fā)現(xiàn)，缺氮后野生型和Osgatb突變體根中ATP含量均下降，表明ATP可能參與缺氮誘導(dǎo)植物根伸長.這一結(jié)果為揭示缺氮誘導(dǎo)水稻根長的機制提供新的研究方向，為指導(dǎo)育種實踐奠定重要的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究使用的水稻材料為石狩白毛(SSBM)和短根突變體Osgatb，其中Osgatb由水稻品種石狩白毛經(jīng)EMS誘變的群體中分離而得.

1.2 實驗方法

1.2.1 生長條件

種子浸種置于30 ℃恒溫箱中，3～4 d后將發(fā)芽的水稻種子播種于人工氣候室中.人工氣候室條件為：晝/夜溫度為30/22 ℃，相對濕度為60%～70%，光照/黑暗時間為12 h/12 h，光照強度約為200 μmol·m-2·s-1.

本實驗采用水培培養(yǎng)系統(tǒng)，營養(yǎng)液配方如Yoshida等[7]所述，并略加修改，配制的兩種營養(yǎng)液分別為正常營養(yǎng)液(氮濃度為2.28 mol/L)和缺氮培養(yǎng)液(氮濃度為0 mol/L).

1.2.2 缺氮處理

參考前人的研究[8-9]，缺氮處理方法如下：野生型和突變體Osgatb的水稻種子先進行消毒，再挑選大小一致的種子用去離子水在30 ℃恒溫箱中催芽，3～4 d后將發(fā)芽的水稻種子各均分成兩組，分別轉(zhuǎn)入正常營養(yǎng)條件和缺氮營養(yǎng)條件中生長.每天測定和調(diào)整營養(yǎng)液的pH，使其維持在5.5左右，培養(yǎng)期間每周換一次培養(yǎng)液.

1.2.3 根系長度測定

初識國威，了解其產(chǎn)品主要為切紙機，應(yīng)用范圍覆蓋紙張、塑料薄片、金屬箔片、皮革、包裝布等材料，除在國內(nèi)占有一定市場份額外，還銷售到法國、意大利、美國、西班牙等70余個國家；深入了解國威，發(fā)現(xiàn)其主攻切紙機，成立25年來從未“移情別戀”, 只是隨時代發(fā)展以“切紙機”為主題不斷衍生出程控切紙機、液壓切紙機等產(chǎn)品，可謂“真愛”。

當水稻生長到第10天和第30天時，分別測量各株地上部長度和地下部的根長.每種樣品分別取10株苗進行測量.

1.2.4 ATP水平測定

水稻根系用蒸餾水洗凈，吸水紙吸干水分，稱量得到每株的根鮮質(zhì)量.將根樣品研磨后與三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)混合，使用生物發(fā)光測定試劑盒(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)測定樣品中的ATP含量.

1.2.5 統(tǒng)計分析

每個實驗至少進行3次生物學(xué)重復(fù).各數(shù)據(jù)的處理與作圖采用Microsoft Excel和SigmaPlot等軟件.數(shù)據(jù)差異采用Microsoft Excel中的T-test檢測，p<0.05時表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型和Osgatb突變體缺氮處理

A：缺氮處理10 d后的野生型和Osgatb突變體表型；B：缺氮處理10 d后主根長度；C：缺氮處理10 d后地上部長度.誤差線表示標準偏差，星號表示顯著差異(p<0.05)，ns表示無統(tǒng)計學(xué)意義.

當缺氮處理30 d后，野生型水稻在缺氮營養(yǎng)條件下的主根長是正常營養(yǎng)條件下主根長的92%，而Osgatb突變體在缺氮營養(yǎng)條件下的根長是正常營養(yǎng)條件下根長的70%左右(圖2A、2B)，且地上部長度也都有明顯的下降(圖2C).

A：缺氮處理30 d后的野生型和Osgatb突變體表型；B：缺氮處理30 d后主根長度；C：缺氮處理30 d后地上部長度.誤差線表示標準偏差，星號表示顯著差異(p<0.05).

2.2 缺氮影響水稻根中ATP的合成

OsGatB編碼線粒體AdT亞基GatB基因，該亞基參與Gln-tRNAGln的合成，從而影響線粒體中的蛋白質(zhì)翻譯.Osgatb突變體中根尖細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，影響根中ATP的合成[5].因此我們隨后對正常營養(yǎng)條件下和缺氮營養(yǎng)條件下的野生型和Osgatb突變體的ATP含量進行測定.

結(jié)果顯示，在正常營養(yǎng)條件下，Osgatb突變體的地下部ATP含量低于野生型(圖3A).進一步研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮處理后，野生型和Osgatb突變體地下部ATP含量均下降，其中野生型地下部ATP含量較正常營養(yǎng)條件下減少40%左右，而Osgatb突變體地下部ATP含量較正常營養(yǎng)條件下減少47%左右(圖3A).但不管在正常營養(yǎng)條件還是缺氮營養(yǎng)條件下，野生型和Osgatb突變體的地上部ATP含量均無明顯差異(圖3B).

A：野生型和Osgatb突變體的地下部ATP含量；B：地上部ATP含量.誤差線表示標準偏差，星號表示顯著差異(p<0.05).

3 討論

Osgatb是從水稻EMS誘變?nèi)后w中分離得到的短根突變體，其突變基因被鑒定為OsGatB，該基因編碼Gln-tRNAGln酰胺轉(zhuǎn)移酶B亞基蛋白[10].Gln-tRNAGln是合成蛋白質(zhì)所必需的，而Osgatb突變體植株中OsGatB的突變可能會影響根尖線粒體中蛋白質(zhì)的合成.線粒體自身基因組編碼線粒體蛋白質(zhì)，這些線粒體蛋白質(zhì)在維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用.線粒體作為真核細胞的“動力工廠”，產(chǎn)生的ATP占細胞ATP總含量的90%以上，在細胞分裂過程中起到至關(guān)重要的作用.研究表明，OsGatB定位于線粒體，主要在根尖等分裂旺盛的部位中表達.根尖細胞的分裂與生長需要大量ATP，但在Osgatb突變體的主根中，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，ATP的合成量大大降低.能量缺乏使得根尖細胞分裂速率降低，從而出現(xiàn)短根表型[5].

氮素作為植物生長過程中必需的大量元素，對植物的各項生理活動和能量代謝起到重要作用.植物需要的氮素營養(yǎng)主要來源于土壤中的硝酸鹽和銨鹽，根系的吸收對氮素供應(yīng)有適應(yīng)性反應(yīng)[11].大量研究顯示，植物在缺氮條件下，會通過誘導(dǎo)根系的伸長來吸收氮源以滿足基本生長需要[12].本研究結(jié)果與此一致，缺氮10 d的野生型水稻主根根長大于正常營養(yǎng)條件下的主根根長(圖1)，但缺氮30 d的野生型水稻根長短于正常營養(yǎng)條件下的根長(圖2).由此可見缺氮誘導(dǎo)野生型水稻主根伸長僅出現(xiàn)在誘導(dǎo)早期，隨著脅迫時間的延長，長期的缺氮環(huán)境可能影響植物體內(nèi)部分酶活性，如水稻在長期缺乏氮素的環(huán)境下，硝酸還原酶、谷氨酸合成酶活性會顯著下降，從而抑制水稻主根生長[13].與野生型水稻不同，早期缺氮處理誘導(dǎo)水稻根伸長的現(xiàn)象在突變體Osgatb中并沒有出現(xiàn)，10 d缺氮處理后突變體的根反而更短(圖1).

檢測野生型WT和突變體Osgatb水稻根中的ATP含量后發(fā)現(xiàn)，在正常營養(yǎng)條件下，Osgatb突變體的地下部ATP含量低于野生型(圖3A)，這與之前的研究結(jié)果[5]一致.但是當缺氮處理后，與在正常營養(yǎng)條件下生長的植株相比，野生型根中ATP含量下降了40%，而突變體Osgatb根中ATP含量下降了47%(圖3A).在外部環(huán)境氮缺乏條件下，植物為獲取足夠的氮素營養(yǎng)而刺激根伸長.根的伸長需要根尖細胞不斷地進行分裂，這個過程需要大量的能量輸出，即ATP的大量消耗[14].當外界環(huán)境的氮素營養(yǎng)不足時，由于野生型水稻的根尖細胞中線粒體完整，ATP合成能力正常，根尖細胞中ATP儲備充足，滿足根細胞短期內(nèi)快速分裂的需求，細胞中的ATP含量也可以及時得到補充，所以雖然ATP含量較正常生長條件下低，但還能進一步消耗ATP用于滿足植物主根生長的需要，短期缺氮能誘導(dǎo)水稻主根生長.而在突變體Osgatb中，線粒體受損，ATP合成受阻，根尖中的ATP含量無法滿足植物主根快速伸長的需要，缺氮反而使得ATP含量更加降低，因此突變體Osgatb中主根更短，減少因主根生長而消耗ATP，最終導(dǎo)致缺氮后野生型主根誘導(dǎo)伸長，而突變體Osgatb主根反而更短.

本研究表明，根細胞中的ATP水平在缺氮誘導(dǎo)植物根伸長中發(fā)揮著重要作用，這為揭示缺氮誘導(dǎo)水稻根伸長的機制提供了新的研究方向，為后期進一步研究植物適應(yīng)缺氮的機制奠定了基礎(chǔ).