劉友強(qiáng),王貴英,2*,胡冀陶,韓佳旭,席金川,李保坤

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科,石家莊 050011; 2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,石家莊 050000)

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi),結(jié)直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第三位,死亡率居第四位[1]。 在我國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì),最新數(shù)據(jù)顯示,2015 年中國(guó)CRC發(fā)病人數(shù)為37.63 萬(wàn)例,死亡人數(shù)為19.1 萬(wàn)例。 在我國(guó)男性第五位、女性第四位高發(fā)性惡性腫瘤,位居我國(guó)惡性腫瘤死因的第五位[2]。 結(jié)直腸癌治療方式為以手術(shù)為主,放化療為輔的綜合治療。 雖然近年來(lái)針對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)防及臨床治療手段均有明顯改善,但其發(fā)病率和死亡率仍沒(méi)有顯著降低趨勢(shì),尤其是Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的生存率并未見(jiàn)明顯的提升,治療效果仍然不能令人滿(mǎn)意。 晚期結(jié)直腸癌嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生存期。

此外,結(jié)直腸癌是一種慢性、多基因和非可控性炎癥驅(qū)使的惡性腫瘤[3],發(fā)生和發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜。 因結(jié)直腸癌惡性程度較高,腫瘤異質(zhì)性明顯,對(duì)放化療缺乏特異性等特點(diǎn),導(dǎo)致CRC 對(duì)放化療易產(chǎn)生耐受[4]。 因此,尋找新的有效治療靶點(diǎn),探索新的治療模式,是結(jié)腸癌亟待解決的問(wèn)題。

洛鉑(化學(xué)式:C9H18N2O3Pt)是第三代抗腫瘤鉑類(lèi)制劑,其抗腫瘤活性與DNA 烷基化和干擾cmyc基因相關(guān)[5],具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用,且副作用更少。 臨床前研究表明,洛鉑可打破某些腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑或卡鉑的耐藥性[6-7]。 大量臨床試驗(yàn)已證明洛鉑在多種癌癥中具有抗腫瘤作用,洛鉑能顯著抑制乳腺癌、胃癌、黑色素瘤等癌癥[7-10]的侵襲轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,殺傷對(duì)腫瘤細(xì)胞。

但洛鉑在結(jié)腸癌中的作用和分子機(jī)制很少被研究,其作用及機(jī)制尚不明確。 在本研究中,初步探討洛鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用,分析洛鉑誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞死亡的類(lèi)型,并對(duì)其作用機(jī)制-凋亡相關(guān)基因BAD 和BCL-2 表達(dá)-進(jìn)行了探索,為洛鉑在結(jié)腸癌患者中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 因此,本研究的目的是探索洛鉑在結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞中的抗腫瘤活性,闡明潛在分子機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心所提供。

1.2 主要試劑與儀器

10%新生胎牛血清(杭州四季清公司);RPM-1640 干粉培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO 公司)。 胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙錠均為山東茂軍化工科技有限公司;GAPDH、BAD、BCL-2、p-BAD、p-AKT、CASPASE-3 抗體及熒光二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司; MK - 206 和 SC79 購(gòu) 買(mǎi)自美 國(guó)Selleckchem 公司;洛鉑購(gòu)自益佰制藥有限公司。MTT 檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Abcam 中國(guó);流式細(xì)胞儀(美國(guó) Attune NxT 公司);檢測(cè)細(xì)胞凋亡所需的Annexin-V 和 7 -AAD(PI) 購(gòu)買(mǎi)自百奧萊博;Transwell 小室及克隆形成實(shí)驗(yàn)耗材購(gòu)自美國(guó)Corning 科技。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的RPM1640,100 μg/mL 鏈霉素和每毫升100 單位青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)定為37℃、5%CO2,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),傳代培養(yǎng),每3 d 傳代 1 次。

1.3.2 MTT(四唑鹽)比色法

采用MTT 實(shí)檢測(cè)洛鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。 將SW480 細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜,然后用不同濃度梯度的洛鉑(0,8,16 和24 μg/mL)與結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h,采用OD490nm測(cè)量各孔的吸光值。 生成細(xì)胞活力曲線(xiàn)。

1.3.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)洛鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。 將SW480 細(xì)胞在6 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)孵化一夜。 將結(jié)腸癌細(xì)胞與不同濃度梯度的洛鉑(0,8,16 和 24 μg/mL)共培養(yǎng) 48 h,然后用新鮮的RPMI 1640 培養(yǎng)基替代含有洛鉑的培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)2 周之后,通過(guò)固定和染色后,采用光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)(超過(guò)50 個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行分析。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

采用細(xì)胞取對(duì)數(shù)期結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞,加入濃度梯度為 0、8、16、24 μg/mL 的洛鉑,培養(yǎng) 48 h 后,用不含EDTA 的胰酶消化后,收集細(xì)胞。 用預(yù)冷1×PBS(4℃)洗滌細(xì)胞,加入 100 Ml 1×BindingBuffer重懸細(xì)胞。 AnnexinV-FITC 標(biāo)記細(xì)胞后,避光,室溫孵育15 min,上機(jī)前5 min 再加入5 μL 的PI 染色進(jìn)行PI 標(biāo)記,檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白

將結(jié)腸癌細(xì)胞與不同濃度梯度的洛鉑(0、8、16、24 μg/mL)共培養(yǎng) 48 h,收集細(xì)胞,用 PBS 洗滌,裂解提取蛋白,將50 μg 蛋白加入SDS 凝膠中,電泳將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至PVDF 膜上用含有5%脫脂牛奶的TBST 封閉。 一抗 CASPASE-3,BAD,BCL-2,GAPDH(1 ∶1000 稀釋)4℃ 過(guò)夜,二抗(1 ∶10000)在 37℃ 下孵育2 h,成像顯影。

1.3.6 探索洛鉑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

MK-206 是一種AKT 抑制劑,SC79 一種新型的AKT 小分子激動(dòng)劑。 將結(jié)腸癌細(xì)胞分為4 組,洛鉑0 μg/mL 組,洛鉑 24 μg/mL 組,洛鉑 0 μg/mL+ MK-206 組,洛鉑 24 μg/mL+ SC79 組,共培養(yǎng) 48 h,收集細(xì)胞,用PBS 洗滌,裂解提取蛋白,將50 μg 蛋白加入SDS 凝膠中,電泳將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至PVDF 膜上,用含有5%脫脂牛奶的 TBST 封閉。 一抗 pAKT、AKT、p-BAD、BAD、BCL-2、CASPASE-3、GAPDH(1 ∶1000 稀釋)4℃ 過(guò)夜,二抗(1 ∶10000)在 37℃下孵育2 h,成像并分析各組蛋白的表達(dá)情況,探索洛鉑促凋亡機(jī)制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 洛鉑抑制結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖

采用MTT 實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)洛鉑對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞的抑制作用。 為探索洛鉑對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制作用。 本研究采用不同梯度(0,8,16 和 24 μg/mL)的洛鉑作用 SW480 細(xì)胞 24 h、48 h和72 h,之后進(jìn)行 MTT 分析。 結(jié)果表明洛鉑對(duì)SW480 細(xì)胞增殖活性具有明顯抑制作用,且表現(xiàn)出事件和劑量依賴(lài)型。 隨藥物濃度的增加,洛鉑的抑制作用逐漸增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 隨著作用時(shí)間的增加,洛鉑的抑制作用也逐漸增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 其抑制率呈時(shí)間-劑量依賴(lài)關(guān)系。 見(jiàn)表1。

細(xì)胞克隆形成結(jié)果顯示,洛鉑能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成,抑制細(xì)胞增殖,且呈現(xiàn)為劑量依賴(lài)型,隨著洛鉑濃度的增加,抑制作用越明顯,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 當(dāng)洛鉑的藥物濃度為 24 μg/mL時(shí),顯著抑制細(xì)胞克隆形成。 見(jiàn)圖1。

2.2 洛鉑誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞凋亡

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)洛鉑對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞凋亡的影響。 洛鉑作用人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞48 h 后,研究發(fā)現(xiàn)洛鉑可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡,且隨洛鉑濃度的增加,細(xì)胞凋亡率明顯增加。 組間比較結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 洛鉑調(diào)節(jié)關(guān)鍵凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

本研究采用Western blot 法檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白CASPASE-3、BAD 與BCL-2 在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中的表達(dá)情況。 結(jié)果顯示,洛鉑作用于結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞24 h 后,與對(duì)照組相比,隨洛鉑的濃度增加,CASPASE-3 的表達(dá)量逐漸上升。 隨洛鉑的濃度增加,BAD 蛋白表達(dá)增加,BCL-2 蛋白表達(dá)下降,各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),結(jié)果見(jiàn)圖3A。 BAD 與BCL-2 的比率顯著提高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見(jiàn)圖 3B、3C。

表1 洛鉑對(duì)SW480 細(xì)胞株的增殖抑制作用( )Table 1 The inhibitory effect of lobaplatin on the proliferation of SW480 cell line

表1 洛鉑對(duì)SW480 細(xì)胞株的增殖抑制作用( )Table 1 The inhibitory effect of lobaplatin on the proliferation of SW480 cell line

注:相同洛鉑濃度在不同作用時(shí)間及在相同作用時(shí)間不同洛鉑濃度對(duì)細(xì)胞增殖的對(duì)比。 與24 h 組和48 h 組相比,*P＜0.05。 下同。Note. Compared among different time at same lobaplatin concentration and different lobaplatin concentration at the same time on cell proliferation.Compared with 24 h and 48 h group,*P＜0.05. The same as below.

濃度(μg/mL)Concentration 24 h 48 h 72 h OD570 nm OD570 nm OD570 nm Control 0.857±0.034 1.310±0.045 1.454±0.051 0.611±0.054* 0.561±0.044* 0.612±0.008*16 0.520±0.34* 0.524±0.022* 0.559±0.031*24 0.464±0.009* 0.479±0.052* 0.504±0.053*8

2.4 洛鉑調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路

本研究采用AKT 的抑制劑MK-2206 及激動(dòng)劑SC97 探討洛鉑調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)未采用洛鉑處理的結(jié)腸癌細(xì)胞pAKT 高表達(dá), 抑 凋 亡 基 因p-BAD、 BCL-2 蛋 白 高 表 達(dá),CASPASE3 蛋白未明顯表達(dá),當(dāng)加入AKT 的抑制劑MK-2206 后,pAKT、p-BAD 和 BCL-2 蛋白表達(dá)下調(diào),CASPASE3 蛋白表達(dá)升高,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

圖1 洛鉑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成Figure 1 lobaplatin inhibits colon cancer cell clone formation

圖2 不同濃度洛鉑對(duì)SW480 細(xì)胞凋亡影響Figure 2 Effect of lobaplatin on apoptosis of SW480 cells

采用 24 μg/mL 洛鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后,p-BAD、BCL-2 低表達(dá),CASPASE3 蛋白高表達(dá),當(dāng)聯(lián)合 AKT 激動(dòng)劑 SC97 處理后,pAKT、p-BAD 和 BCL-2 蛋白表達(dá)上調(diào),CASPASE3 蛋白表達(dá)下調(diào),抑制了細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖4)。

3 討論

鉑類(lèi)藥物被廣泛用于多種惡性腫瘤的治療中,然而,其嚴(yán)重毒副作用限制了其臨床應(yīng)用[11]。 順鉑是第一代鉑類(lèi)藥物,對(duì)多種實(shí)體腫瘤均能產(chǎn)生抗腫瘤療效。 然而,順鉑藥物常伴有劑量限制性腎毒性,胃腸毒性、耳毒性和神經(jīng)毒性,阻礙了順鉑在臨床應(yīng)用。 卡鉑是第二代鉑化合物由于其嚴(yán)重的神經(jīng)毒性和耳毒性,骨髓抑制,特別是血小板減少,同樣影響了卡鉑的應(yīng)用。 洛鉑(lobaplatin)是第三代鉑類(lèi)衍生物,該復(fù)合物中1,2-二氨甲基-環(huán)丁烷為穩(wěn)定配基,乳酸為離去基團(tuán)。 與前兩代鉑類(lèi)藥物相比具有明顯優(yōu)勢(shì),穩(wěn)定性好,抗腫瘤活性強(qiáng),腎毒性輕,胃腸道反應(yīng)輕,未表現(xiàn)出順鉑的交叉耐藥性[12]。

圖3 洛鉑調(diào)節(jié)關(guān)鍵凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 3 Lobaplatin regulates the expression of key apoptosis related proteins

圖4 洛鉑調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡Figure 4 Lobaplatin regulating apoptosis of colon cancer cells

BAD 蛋白是BCL-2 基因家族的促凋亡成員,其參與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。 其不包含外部線(xiàn)粒體膜和核膜靶向的結(jié)構(gòu)域。 當(dāng)BAD 被AKT 磷酸化時(shí),它形成 BAD-14-3 蛋白異二聚體,抑制細(xì)胞凋亡。BAD 蛋白可通過(guò)在線(xiàn)粒體外膜上打孔,允許細(xì)胞色素c 逃逸到細(xì)胞質(zhì)中并激活促凋亡的CASPASE 級(jí)聯(lián),來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[13]。 抗凋亡BCL-2 蛋白可抑制細(xì)胞色素c 通過(guò)線(xiàn)粒體孔釋放,并且抑制細(xì)胞質(zhì)CASPASE 級(jí)聯(lián)的活化。 既往研究表明活化的AKT可以使BAD 磷酸化,促進(jìn)細(xì)胞存活,否則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。

近期臨床前發(fā)現(xiàn)了洛鉑在大多數(shù)惡性腫瘤的潛在抗腫瘤機(jī)制。 洛鉑可阻止細(xì)胞周期進(jìn)程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,改變蛋白質(zhì)組,抑制腫瘤的遷移和侵襲,下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1,CDK4, CDK6,MMP-2,MMP-9 和 BCL-2 的表達(dá),上調(diào)p53,BAX,PARP,CASPASE-3,-8,-9 等基因的表達(dá)[15-17]。 但在結(jié)腸癌中的作用尚不明確,本研究以人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞為模型,探討其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示洛鉑對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,表現(xiàn)為時(shí)間-劑量依賴(lài)型。 同時(shí)洛鉑可誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞凋亡,隨著洛鉑濃度的提高,洛鉑促細(xì)胞凋亡的強(qiáng)度表現(xiàn)為增強(qiáng)的趨勢(shì),呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)型。 CASPASE 家族蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。 本研究結(jié)果表明,洛鉑作用人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞后,可提高結(jié)腸癌細(xì)胞中CASPASE-3 的表達(dá)量, 促進(jìn)細(xì)胞的凋亡, 表明洛鉑可通過(guò)CASPASE 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 BCL 家族蛋白在調(diào)節(jié)CASPASE 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 BAX 和BCL-2 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要分子[19-20]。 BAX 可以激活 BCL-xl 和 BAD,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而B(niǎo)CL-2 可以抑制BAX 的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡。 BAD/BCL-2 比值在細(xì)胞凋亡中一個(gè)重要的決定因素[21-22]。 本研究結(jié)果顯示,不同濃度梯度的洛鉑作用人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞后BCL-2 蛋白表達(dá)下調(diào),而 BAD 蛋白表達(dá)上升,BCL-2/BAD 比值下降,表明BCL 家族蛋白在洛鉑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用。

AKT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及廣泛的細(xì)胞功能,包括細(xì)胞存活、增殖、血管生成、細(xì)胞代謝和細(xì)胞遷移。AKT 的激活導(dǎo)致BCL 家族BCL-2 的抗凋亡蛋白的增加。 BCL-2 是一種抗凋亡蛋白,為位于線(xiàn)粒體外膜,通過(guò)阻止線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素c,抑制細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞色素 c 從線(xiàn)粒體向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移是CASPASE-3 活化和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的關(guān)鍵步驟[23]。本研究中發(fā)現(xiàn),AKT 抑制劑能顯著抑制BCL-2 蛋白表達(dá),促進(jìn)BAD 和CASPASE-3 蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 AKT 激動(dòng)劑能顯著抑制BAD 和CASPASE-3蛋白表達(dá),促進(jìn)BCL-2 蛋白表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡。本文研究顯示,洛鉑可能通過(guò)AKT/BCL-2/BAD 信號(hào)通路發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用。 洛鉑可顯著抑制結(jié)腸癌的SW480 細(xì)胞的增殖,具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。 洛鉑可能通過(guò)AKT/BCL-2/BAD 信號(hào)通路發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用。 因此,洛鉑可能是一種有效的抗結(jié)腸癌藥物,但尚需要進(jìn)一步的研究和臨床評(píng)價(jià)。