常振宇，李家奎，2，董海龍，張笑冰，吳慶俠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

銅元素是動(dòng)物生命活動(dòng)中必不可少的金屬元素之一，與機(jī)體的生長(zhǎng)、繁殖、免疫、新陳代謝、造血、器官正常運(yùn)行等生命活動(dòng)有緊密的聯(lián)系[1-3]。納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代末提出并快速發(fā)展起來(lái)的一種科學(xué)技術(shù)，納米微粒是指粒徑為1～100 nm的細(xì)小物質(zhì)微粒[4]。納米微量元素添加劑由于其比表面積大，所以其催化效率和表面反應(yīng)活性較高，吸附能力更強(qiáng)，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注[5-6]。銅作為畜禽生長(zhǎng)所必需的微量元素，是飼料添加劑中必不可少的原料，但高銅飼料的濫用，不僅對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成肝臟和腎臟等器官的直接損害，經(jīng)家禽糞便排出的銅還對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大污染。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于納米氧化銅(nano-CuO)對(duì)動(dòng)物機(jī)制研究還不成熟，迄今為止，納米飼料添加劑在藏雞體內(nèi)的吸收、代謝和生物學(xué)作用的研究報(bào)道較少。肝纖維化是由于多種致病因子所導(dǎo)致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過(guò)程中都有肝纖維化的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1( transforming growth factor-β1，TGF-β1) 在肝纖維化的啟動(dòng)、進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與肝星形細(xì)胞向肌成纖維化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有著密切聯(lián)系[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)nano-CuO有利于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[10]，但詳細(xì)的添加劑量還有待探討。本研究通過(guò)對(duì)比分析不同濃度梯度的nano-CuO對(duì)藏雞肝臟TGF-β1 mRNA、蛋白表達(dá)水平的影響以及肝臟的病理學(xué)變化，探討nano-CuO作為飼料添加劑在藏雞飼養(yǎng)中的安全添加劑量，為藏雞養(yǎng)殖中實(shí)際應(yīng)用nano-CuO飼料添加劑提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組選取西藏農(nóng)牧學(xué)院畜牧場(chǎng)的健康藏雞120羽，隨機(jī)分成4組，每組30羽，空白對(duì)照組藏雞飼喂無(wú)任何銅添加劑飼料，低、中、高劑量nano-CuO組藏雞分別飼喂5,50,100 mg/kg nano-CuO飼料，藏雞自由采食，于14日齡開(kāi)始，連續(xù)飼喂不同劑量的nano-CuO，試驗(yàn)期2周，于28日齡心臟采血 10 mL，1 000 r/min離心20 min，取上清液，-20℃保存，用于生化指標(biāo)的檢測(cè)。采用空氣靜脈注射法處死藏雞，宰殺取肝臟組織，保存于液氮中?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 藏雞基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平 %

1.2 主要儀器與試劑高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)為3K15，Sigma)；萊卡組織切片機(jī)(型號(hào)為RM-2245)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)為CX41)；原子吸收分光光度計(jì)(型號(hào)為AA-6630C)；TGFβ抗體(武漢谷歌生物公司)；TBS濃縮緩沖液、中性樹(shù)膠、水楊酸甲酯、二甲苯、福爾馬林、PVDF 膜、顯影定影試劑、轉(zhuǎn)移緩沖液、電泳緩沖液等。

1.3 微量元素的測(cè)定稱取一定量的藏雞腎臟和肝臟樣品，65℃烘干，粉碎再次稱取1.0～2.0 g，烘干樣品置于馬弗爐中，250℃碳化至無(wú)煙后，650℃灼燒3 h，冷卻后加10 mL鹽酸和0.3 mL硝酸煮沸溶解，定容至50 mL容量瓶，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定組織中銅、鐵、鋅的含量。

1.4 組織切片HE染色固定組織修整與水洗，分別將組織置于梯度酒精中進(jìn)行脫水；將脫水后的組織浸在水楊酸甲酯中過(guò)夜處理；提前將蠟塊反復(fù)凍融后放置在65℃溫箱內(nèi)依次浸蠟，組織包埋，RM-2245組織切片機(jī)切片；將毛筆上的組織片用鑷子輕輕拉起，然后輕拖著鋪于40%酒精上預(yù)展，組織片基本無(wú)皺褶后用1個(gè)玻璃片輕輕撈起放入溫水中使其完全展開(kāi)；用載玻片輕輕將組織片撈起，將載玻片45°傾斜放置，于烘片機(jī)上烘2 h；二甲苯、梯度酒精進(jìn)行脫蠟，蘇木素、伊紅染液染色，脫水透明，中性樹(shù)膠滴在脫水好的載玻片組織上封片。將封好的切片用 Olympus 光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，記錄結(jié)果。

1.5 免疫組化檢測(cè)TGF-β1藏雞肺動(dòng)脈平滑肌組織經(jīng)包埋切片后，3% H2O2溶液避光室溫條件下作用30 min；修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% TBST 封閉，分別滴加兔抗鼠TGF-β 抗體(1∶100)、山羊抗兔 HRP- IgG為二抗，孵育，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺法顯色操作；蘇木素染液復(fù)染2 min，梯度酒精脫水、透明和封片(用 PBS緩沖液替代一抗作陰性對(duì)照)，應(yīng)用Olympus光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA水平表達(dá)提取藏雞肝組織 RNA，用核酸定量?jī)x檢測(cè) RNA的濃度和純度，所得 RNA 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，-20℃保存。以 β-actin 為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表2，檢測(cè) TGF-β1 mRNA 表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)體系 25 μL:2×qPCR Mix 12.5 μL，2.5 μm 內(nèi)標(biāo)引物 2.0 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:95℃ 1 min;95℃ 5 s，72℃ 20 s，72℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)。用 LightCycler 96 進(jìn)行熒光檢測(cè)，并用 2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表2 引物信息

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的nano-CuO對(duì)藏雞金屬沉積的影響由表3可知，在藏雞肝組織中銅含量隨著nano-CuO添加劑量的增加呈上升趨勢(shì)，其中100 mg/kg nano-CuO組增加最多，并顯著高于其他各組(P<0.01)，5,50 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；肝組織中鐵含量隨著銅添加劑量的增加呈減少趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；肝組織中鋅含量受飼料中銅含量的影響較小，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。在腎臟組織中銅含量隨著飼料中銅添加劑量的增加呈增加趨勢(shì)，5 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，50 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，100 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組之間差異極顯著(P<0.01)；腎臟組織中鐵含量隨著銅添加劑量的增加呈減少趨勢(shì)，除5 mg/kg nano-CuO組之外，其他兩組與對(duì)照組之間差異極顯著(P<0.01)；50 mg/kg nano-CuO組相對(duì)對(duì)照組降低較少(P<0.05)。腎臟組織中鋅含量受飼料中銅含量影響不大，各組與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同劑量的銅對(duì)藏雞肝臟、腎臟中銅、鐵、鋅活性的影響 mg/kg

2.2 不同劑量的nano-CuO對(duì)藏雞血清中銅、鐵、鋅含量的影響由表4可知，藏雞血清中銅含量隨著銅添加劑量的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其中100 mg/kg nano-CuO組比對(duì)照組有顯著的增加(P<0.01)，但是除100 mg/kg nano-CuO組外，其余各組與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；血清中鐵含量隨著銅添加劑量的增加也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，5 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，50 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，100 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；血清中鋅含量隨著銅添加劑量的增加逐漸減少，5，50 mg/kg nano-CuO組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，100 mg/kg nano-CuO組比對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

表4 不同形式和劑量的銅對(duì)藏雞血清中銅、鐵、鋅含量的影響 mg/L

2.3 HE染色組織觀察結(jié)果通過(guò)HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組藏雞肝臟(圖1A)相比，5 mg/kg nano-CuO組藏雞肝臟肝小葉輪廓清晰，無(wú)病變出現(xiàn)(圖1B)；50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝細(xì)胞有輕微水泡變性和顆粒變性，并有血細(xì)胞滲出(圖1C)；100 mg/kg nano-CuO組以顆粒變性為主，水泡變性較50 mg/kg nano-CuO組更嚴(yán)重，中央靜脈擴(kuò)張(圖1D)。

A.對(duì)照組肝臟;B.5 mg/kg nano-CuO組肝小葉輪廓清晰;C.50 mg/kg nano-CuO組肝細(xì)胞輕微水泡變性;D.100 mg/kg nano-CuO組顆粒變性為主，水泡變性更加嚴(yán)重,中央靜脈擴(kuò)張。①輕微水泡變性;②中央靜脈擴(kuò)張;③顆粒變性;④水泡變性

2.4 TGF-β1免疫組化結(jié)果免疫組化結(jié)果表明，100 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織表現(xiàn)出明顯的棕黃色、黃色，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)烈(圖2A)，空白對(duì)照組和5,50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織有弱陽(yáng)性反應(yīng)，顏色較淺(圖2B～D)。陰性對(duì)照組(不加一抗)，則無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)顯色(圖2E)。

A.100 mg/kg nano-CuO組；B.空白對(duì)照組；C.5 mg/kg nano-CuO組；D.50 mg/kg nano-CuO組；E.陰性對(duì)照組

2.5 RT-qPCR方法檢測(cè)肝組織 TGF-β1 mRNA水平由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，5，50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝臟 TGF-β1 mRNA 水平未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，100 mg/kg nano-CuO組藏雞肝臟 TGF-β1 mRNA 水平顯著升高(P<0.01)。

圖3 藏雞肝臟組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肝臟、腎臟及血清中銅、鐵、鋅含量發(fā)現(xiàn)，nano-CuO組隨著銅添加劑量的增加，肝臟、腎臟和血清組織中銅的含量逐漸增加，結(jié)果與有關(guān)報(bào)道相一致[11-14]。何欣等[15]發(fā)現(xiàn)肝臟作為動(dòng)物體內(nèi)重要的儲(chǔ)銅庫(kù)，肝臟中銅含量的水平直接受到日糧銅水平的影響。同時(shí)張?zhí)K江等[16]發(fā)現(xiàn)肝臟中銅含量的變化與血清中銅濃度的變化呈正比。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，5 mg/kg nano-CuO組中腎臟的銅含量變化不明顯。另外，大多數(shù)組織中銅含量與鐵、鋅含量呈負(fù)相關(guān)，肝臟中表現(xiàn)最為明顯。出現(xiàn)這種情況的原因是：動(dòng)物體內(nèi)銅、鐵、鋅的代謝具有密切的關(guān)系，吸收的銅主要以銅藍(lán)蛋白的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到各組織器官，試驗(yàn)中隨日糧銅濃度增加，血中鐵的濃度增加，由于銅藍(lán)蛋白能提高鐵的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，血中銅藍(lán)蛋白濃度的增加使血鐵的含量也增加。同時(shí)，由于銅、鐵、鋅元素之間存在一定的拮抗作用，高銅飼糧對(duì)組織中鐵、鋅含量有一定的影響。銅阻礙了鐵、鋅在動(dòng)物體內(nèi)的吸收和存積，導(dǎo)致組織中鐵含量的降低，其拮抗機(jī)制有研究表明[17-19]，銅只有與其轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白質(zhì)相結(jié)合后才能被吸收，而銅離子有相同或相似的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，由于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系從而導(dǎo)致銅的吸收與鐵、鋅的吸收呈負(fù)相關(guān)。

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加50 mg/kg的nano-CuO時(shí)，肝組織出現(xiàn)有輕微的水泡變性和顆粒變性，但組織結(jié)構(gòu)清晰。隨著日糧中銅添加水平的增加，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的顆粒或水泡變性，當(dāng)飼料中nano-CuO含量達(dá)到100 mg/kg時(shí)，可導(dǎo)致藏雞肝組織發(fā)生明顯的病理學(xué)變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)開(kāi)始消失，特別是在100 mg/kg nano-CuO組肝小葉的中央靜脈已經(jīng)發(fā)生了擴(kuò)張。出現(xiàn)這種情況，說(shuō)明nano-CuO更容易進(jìn)入肝組織形成沉積，從而導(dǎo)致其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

研究表明，TGF-β1 屬于TGF-β超家族，是目前公認(rèn)的致纖維化的最強(qiáng)細(xì)胞因子，細(xì)胞的免疫功能、分化和生長(zhǎng)都與之調(diào)節(jié)有關(guān)[20]。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞以及壞死的肝細(xì)胞等通過(guò)旁分泌或自分泌方式生成TGF-β1。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5,50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織 TGF-β1含量無(wú)明顯變化，100 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織TGF-β1表達(dá)顯著升高。由此說(shuō)明，當(dāng)飼料中nano-CuO劑量超過(guò)100 mg/kg時(shí)，會(huì)對(duì)藏雞機(jī)體造成直接損害，飼料中nano-CuO添加劑質(zhì)量濃度應(yīng)控制在5～50 mg/kg。