肖梓穎 王一帆 梁雪茹 黃郁蔥

摘要 [目的] 獲得卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）HSP30基因并探討其組織表達。 [方法]采用RACE的方法從卵形鯧鲹脾組織克隆HSP30基因的cDNA 全序列，并用熒光定量PCR分析在健康魚及哈維氏弧菌感染后HSP30基因的組織表達。[結(jié)果]HSP30基因cDNA序列全長913 bp，包含5′非編碼區(qū)（5′UTR）89 bp、3′非編碼區(qū)（3′UTR）188 bp，開放閱讀框（ORF）636 bp，編碼211個氨基酸。預(yù)測其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子質(zhì)量為24.1 kD，理論等電點為5.62。HSP30包括N-末端序列（NTS）、α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD）、C-末端序列（CTS）和C-末端延伸（CTE）。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示卵形鯧鲹HSP30與高體鰤（Seriola dumerili）HSP30聚為一支。卵形鯧鲹HSP30基因在各組織中均有不同程度的表達，其中肝組織中表達量最高，其次為皮膚、肌肉、脾、心、腎，其他組織的表達量較低。哈維弧菌侵染卵形鯧鲹后，肝、脾和腎組織中HSP30基因mRNA 表達量均升高，肝組織中變化最顯著。[結(jié)論]成功克隆了卵形鯧鲹HSP30基因，為進一步揭示卵形鯧鲹HSP30的抗菌免疫應(yīng)答機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 卵形鯧鲹;熱休克蛋白;HSP30;基因克隆;組織表達

中圖分類號 S917.4文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）02-0081-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Cloning and Tissue Expression of HSP30 Gene from Trachinotus ovatus

XIAO Ziying，WANG Yifan，LIANG Xueru et al （Fisheries College of Guangdong Ocean University/Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals of Guangdong&Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institute，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective]To obtain the HSP30 gene of Trachinotus ovatus and to study its tissue expression.[Method]The full length cDNA sequence of the HSP30 gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends （RACE） from the spleen of T.ovatus，and its expression profiles in tissues of the health fish and the fish infected with Vbirio harveyi were also analyzed by quantitative real time PCR （qRTPCR）.[Result]The total cDNA sequence of T.ovatus HSP30 was 913 bp，including 5′ UTR of 89 bp，3′UTR of 188 bp，and an open reading frame （ORF） of 636 bp encoding 211 amino acids with molecule mass of 24.1 kD and PI of 5.62.The predicted HSP30 protein included an Nterminal sequence （NTS），an αcrystallin domain （ACD），a Cterminal sequence （CTS） and a Cterminal extension （CTE） in structure.Phylogenetic analysis showed that T.ovatus was clustered closely with Seriola dumerili.The qRTPCR analysis showed that T.ovatus HSP30 gene expressed in all examined tissues with the highest levels in liver，moderate levels in skin，muscle，spleen，heart，kidney，low levels in other tissues.The mRNA expression levels of HSP30 were significantly upregulated in the liver，spleen and kidney issues，especially in the liver.[Conclusion]The HSP30 gene of T.ovatus was successfully cloned，which will provide a theoretical basis for further elucidating the mechanism of antibacterial immune response of T.ovatus HSP30.

Key words Trachinotus ovatus;Heat shock protein;HSP30;Gene cloning;Tissue expression

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs） 是一類結(jié)構(gòu)高度保守的應(yīng)激反應(yīng)伴侶蛋白，可響應(yīng)各種應(yīng)激而合成，參與各種細(xì)胞過程，如蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)運輸以及蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝/拆卸和降解，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[1]。很多研究都表明HSP還參與炎癥、免疫、細(xì)胞分化、抗氧化、抗輻射以及抗癌細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能[2-3]。根據(jù)HSP分子、結(jié)構(gòu)和功能，分為6個家族，包括小分子HSP（sHSP）、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90和大分子HSP[2]。 HSP分子量大小為10～110 kD。此外，它們的特定部位和生理作用會根據(jù)其大小在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生變化。HSP30為sHSP家族的重要成員，其蛋白結(jié)構(gòu)包括N-末端序列（N-terminal sequences，NTS）、α-晶狀蛋白結(jié)構(gòu)域（α-crystallin domain，ACD）、C-末端序列（C-terminal sequences，CTS）和C-末端延伸（C-terminal extension，CTE），在目前已發(fā)現(xiàn)的非哺乳動物和原核生物中具有高度的保守性。HSP30具有sHSP家族的類似功能，通過形成寡聚體（分子量100～800 kD）發(fā)揮其分子伴侶作用，防止錯誤折疊并加快蛋白質(zhì)的重新折疊和復(fù)性[4]。

目前已有兩棲動物[5]和鳥類[6]中HSP30的研究報道，尤其是非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）HSP30的研究較為深入，而魚類HSP30的研究相對較少，目前中華鱘（Acipenser sinensis）[7]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[8]、金魚（Carassius auratus）[9]和斑馬魚（Danio rerio）[10]的HSP30基因已得到克隆鑒定，研究表明魚類的HSP30在熱應(yīng)激和刺激下，參與應(yīng)激反應(yīng)和保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡[11-12]。卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）是我國南方沿海地區(qū)近岸和深遠海養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚種，然而集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，各種病害頻繁暴發(fā)[13-14]，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失，成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大的瓶頸。最近研究發(fā)現(xiàn)，HSP30還參與抗病毒免疫反應(yīng)[15]。目前鮮見卵形鯧鲹HSP30基因的研究報道。該研究運用RACE方法克隆卵形鯧鲹HSP30基因cDNA 全長序列，應(yīng)用實時熒光定量PCR（quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）檢測HSP30基因在健康卵形鯧鲹及哈維弧菌（Vibrio harveyi）感染后卵形鯧鲹組織中的誘導(dǎo)表達，以期為進一步研究該基因在先天免疫中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用健康卵形鯧鲹（平均體重約100 g）購自湛江某深海養(yǎng)殖網(wǎng)箱，哈維氏弧菌強毒株TOZJ1705由實驗室分離自患病卵形鯧鲹并凍干保存?？俁NA抽提試劑盒（EasyPureRNA Kit）、組織基因組提取試劑盒（EasyPureMarine Animal Genomic DNA Kit）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScriptOneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購自北京全式金公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒（GeneJET）購自Thermo 公司;SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 等購自TaKaRa 公司;實時熒光定量試劑盒（SYBRSelect Master Mix）購自ABI公司。

1.2 哈維氏弧菌感染及樣品采集

將哈維氏弧菌強毒株TOZJ1705接種于TSB（1.5%NaCl）培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)10 h，用平板計數(shù)法計數(shù)菌液濃度，將哈維氏弧菌菌液用生理鹽水調(diào)整其濃度為1.2×108 CFU/mL。將試驗魚分成2組，感染組每尾魚腹腔注射哈維氏弧菌菌液0.1 mL，對照組注射等量無菌生理鹽水，于感染后的0、3、6、12、24、48和72 h分別采集肝、脾和肌肉組織，每個時間點采集5尾卵形鯧鲹，組織用液氮固定后保存于-80 ℃。收集的組織主要用于qRT-PCR分析。同時取5尾健康魚的鰓、肝、脾、腎、腸、肌肉和皮膚等組織立即置于液氮中，用于cDNA全長克隆和組織分布分析。

1.3 總RNA提取和cDNA一鏈合成

參考說明書分別提取卵形鯧鲹各組織總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光光度法檢測其純度和濃度。參考說明書合成cDNA第一鏈，置于-40℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣「?、脾組織的總RNA，按SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit說明書分別合成用于3′與5′ RACE的cDNA，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參考說明書分別提取卵形鯧鲹組織DNA。

1.4 3′RACE、5′RACE和基因擴增

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的HSP30基因部分mRNA設(shè)計HSP30全長cDNA的3′RACE和5′RACE特異引物（表1）。3′HSP30F1、5′HSP30R1分別與引物UPM Mix進行3′與5′ RACE第一輪touch-down PCR擴增。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，5個循環(huán);94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5個循環(huán);94 ℃ 30 s ，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)，72 ℃延伸6 min，16 ℃保存。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍為第二輪PCR的模板，分別將3′HSP30F2、5′HSP30R2與引物NUP進行第二輪PCR擴增，反應(yīng)條件為94℃ 4 min，94℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72℃ 1 min 35個循環(huán)，72℃延伸6 min，16 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，回收產(chǎn)物與pMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。根據(jù)獲得cDNA全序列，設(shè)計1對基因特異引物HSP30-F/HSP30-R，以基因組DNA為模板，擴增HSP30全長基因序列，方法與3′RACE第二輪PCR擴增、產(chǎn)物回收及克隆測序相同。

1.5 生物學(xué)信息分析

使用在線Blast程序進行序列同源性比對和相似性分析;使用Genetyx 6.0和Protparam推導(dǎo)開放閱讀框（open reading frame，ORF）、分子量（Mw）和理論等電點（pI）等;SignalP 4.0 Server和TMHMM Server 2.0分別預(yù)測信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域;PSITE預(yù)測氨基酸的功能位點分布;運用SMART分析蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域;采用SOPMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu);采用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu);使用ClustalX 2.1及MEGA 10.0 軟件以鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自檢數(shù)為1 000。

1.6 qRT-PCR和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 根據(jù)HSP30基因ORF設(shè)計特異引物reHSP30F和reHSP30R（表1），以β-actin為內(nèi)參基因，利用ABI7300實時熒光定量PCR儀對卵形鯧鲹HSP30基因的表達量進行分析，每個樣本設(shè)3個重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 20 s，60℃ 20 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算卵形鯧鲹HSP30 cDNA的相對表達量[16]，應(yīng)用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA單因素方差分析和Tukey HSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA克隆與氨基酸序列分析 卵形鯧鲹HSP30基因cDNA序列全長913 bp（圖1），包含89 bp 5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），188 bp 3′ UTR，636 bp ORF，推導(dǎo)編碼211個氨基酸，預(yù)測其理論分子量為24.1 kD，等電點為5.62。SignalP 4.0 Server分析顯示HSP30蛋白氨基酸序列不含信號肽，TMHMM Server 2.0預(yù)測顯示該蛋白氨基酸序列不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。該蛋白氨基酸序列含有一個典型的HSP家族所有的特征基序，PSITE蛋白氨基酸序列含有1個N-糖基化位點，5個蛋白激酶C磷酸化位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，1個酰胺化位點，1個CAAX box，2個微體C-末端定位信號序列，1個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。PSORT Ⅱ預(yù)測結(jié)果顯示在細(xì)胞中細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞骨架分布的概率分別為60.9%、21.7%、13.0%和4.3%。根據(jù)獲得的HSP30全長cDNA序列，設(shè)計一對基因特異性引物HSP30F和HSP30R，以卵形鯧鲹基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠及測序鑒定，所得序列與在cDNA模板中擴增的結(jié)果完全一致，表明卵形鯧鲹HSP30基因無內(nèi)含子。

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析 卵形鯧鲹HSP30基因cDNA 編碼211個氨基酸殘基中，有24個堿性氨基酸（K，R），占氨基酸總數(shù)的11.37%;32個酸性氨基酸（D，E），占氨基酸總數(shù)的15.2%。親疏水性的平均值為-0.738，表明該蛋白為親水性蛋白。應(yīng)用SOPMA在線軟件對HSP30蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，HSP30 蛋白分子二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋占34.12%，β-轉(zhuǎn)角占4.74%，無規(guī)卷曲占46.92%，延伸鏈占14.22%（圖2）。將卵形鯧鲹HSP30氨基酸序列提交至SWISS-MODEL程序，自動搜索同源蛋白4yl9.1.A作模板，得到HSP30三級結(jié)構(gòu)模型（圖3），結(jié)果顯示卵形鯧鲹HSP30空間結(jié)構(gòu)包括5個α-螺旋，16個β-折疊。

2.3 氨基酸同源性比較及系統(tǒng)進化分析

利用NCBI的Blastp軟件將卵形鯧鲹HSP30蛋白氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他物種的HSP30蛋白氨基酸序列進行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵形鯧鲹HSP30蛋白與高體鰤（Seriola dumerili）同源率為93.33%，與斑馬魚、短吻鱷（Alligator mississippiensis）、椋鳥（Sturnus vulgaris）、原雞（Gallus gallus）、中華鱘和爪蟾HSP30蛋白分子的同源性較低，分別為57.30%、37.67%、32.50%、31.29%、30.86%和30.69%。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，魚類、兩棲類、爬行類和鳥類的HSP30蛋白分子均由N-末端序列（NTS）、α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD）、C-末端序列（CTS）和C-末端延伸（CTE）組成，其中ACD較為保守（圖4）。ACD 中的絲氨酸磷酸化位點在卵形鯧鲹、斑馬魚、中華鱘、爪蟾和短吻鱷氨基酸序列中均存在，而在原雞、椋鳥氨基

酸序列中未發(fā)現(xiàn)此位點。CTS中的I-X-I基序存在于非洲爪蟾、斑馬魚和短吻鱷氨基酸序列中，中華鱘序列中為V-P-I，在卵形鯧鲹和原雞中均未發(fā)現(xiàn)此基序。利用MEGA 10.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建的HSP30蛋白分子系統(tǒng)進化樹顯示（圖5），卵形鯧鲹與同屬鱸形目的高體鰤聚成一簇，然后再與其他魚類聚成一個大的分支，兩棲類和爬行類及鳥類形成獨立的進化分支，與Blastp結(jié)果相一致。

2.4 HSP30 mRNA組織表達分布 應(yīng)用qRT-PCR檢測了HSP30基因mRNA在卵形鯧鲹各組織中的分布，以腦組織的mRNA表達量為基準(zhǔn)，結(jié)果顯示在脾、腎、腸、鰓、肝、心、肌肉和皮膚組織中均有不同程度的表達，其中肝組織中表達量最高，其次為皮膚、肌肉、腎、心，其他組織中的表達量較低（圖6）。

2.5 哈維氏弧菌感染后HSP30 mRNA的表達分析

應(yīng)用qRT-PCR檢測了哈維氏弧菌感染卵形鯧鲹0、3、6、12、24、48和72 h后HSP30 mRNA在卵形鯧鲹肝、脾和腎組織中的表達變化。如圖7所示，肝、脾和腎組織中HSP30 mRNA的表達量分別在3、3和6 h達到最高，顯著高于對照組（P<0.01），然后開始下降，于感染后48 h再次上升到較高水平（P<0.01），然后緩慢降低，72 h仍高于對照組。

3 討論

該研究成功克隆了卵形鯧鲹HSP30基因cDNA全序列，發(fā)現(xiàn)基因序列中不含內(nèi)含子，與爪蟾[4]、美洲牛蛙（Rana catesbeiana）[17]、中華鱘[7]、斑馬魚[10]的研究結(jié)果相一致，而且在許多不同的HSP基因中均已存在[4]。這種不存在內(nèi)含子的初級轉(zhuǎn)錄本不必經(jīng)過剪接即可產(chǎn)生成熟的mRNA進行翻譯，使它們能夠有效表達小分子熱激蛋白，從而保證了小分子熱休克蛋白對應(yīng)激源的快速響應(yīng);而在含有內(nèi)含子的熱休克蛋白（如HSP90）中，由于高溫的極端壓力可以使剪接機器失活從而抑制了熱休克蛋白的表達[18]。HSP30蛋白氨基酸序列分析結(jié)果表明HSP30分子含有保守的CTS和ACD，而NTS和CTE保守性較差[19]。HSP30中的NTS、ACD 和CTS結(jié)構(gòu)域可能以底物特異性方式參與靶蛋白結(jié)合[20]。小分子熱休克蛋白基因的ACD中的絲氨酸是潛在的MAPKAPK-2 磷酸化位點[16]，在兩棲類、爬行類、魚類中均存在，而在鳥類中不存在。在大多數(shù)非哺乳動物脊椎動物CTS中都存在I-X-I基序，與二聚體或更大的寡聚復(fù)合物締合的相鄰單體的ACD中β4-和β8-鏈之間形成的疏水溝結(jié)合[6]。在青蛙、斑馬魚和鱷魚HSP30中為I-P-1，而在中華鱘和椋鳥HSP30中為V-P-I，其中V為保守氨基酸取代，而該研究中卵形鯧鲹缺失了此基序。椋鳥ACD中絲氨酸磷酸化位點以及卵形鯧鲹I-X-I 基序的缺失表明HSP30在不同物種間可能具有不同的功能，需要進一步研究加以闡明。

非洲爪蟾的HSP30 mRNA在腎中表達量最高，在肝、腸和肺組織中表達量較低[21]。中華鱘HSP30基因在皮膚中的表達水平明顯高于其他組織[7]，卵形鯧鲹中各組織均有不同程度的表達，肝組織中表達量最高，表明HSP30基因在不同物種中組織表達分布存在差異。

當(dāng)機體受到環(huán)境中各種物理、化學(xué)和生物等因素刺激時產(chǎn)生應(yīng)激反饋，mRNA轉(zhuǎn)錄合成熱休克蛋白，幫助機體應(yīng)對外界刺激對機體的傷害[4]。據(jù)報道，虹鱒從10 ℃轉(zhuǎn)移到25 ℃水環(huán)境中并保持3 h，發(fā)現(xiàn)HSP30 mRNA有不同程度的上調(diào)表達[8]。另外，大西洋鮭魚（Salmo salar）從15 ℃轉(zhuǎn)移到26 ℃水環(huán)境30 min后鰓組織可檢測到HSP30 mRNA的積累[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和病毒感染會增加魚HSP30 mRNA的表達。斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）感染柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）后，鰓組織中的HSP30 mRNA表達量升高[22]。最近，有研究表明，神經(jīng)壞死病毒（NNV）感染尖吻鱸上皮細(xì)胞后，HSP30mRNA的相對表達量增加了1 000 倍以上[15]。該研究中，在感染的最初幾個小時內(nèi)肝臟、腎臟和脾臟中的HSP30mRNA上調(diào)表達，隨后恢復(fù)到基礎(chǔ)表達水平，2 d后表達量再次升高，與嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染了露斯塔野鯪（Labeo rohita）的研究結(jié)果較為相似[23]。究其原因，可能是在細(xì)菌或病毒感染期間，未折疊的細(xì)菌、病毒或宿主蛋白可能會增加，這可能會觸發(fā)HSF1途徑，導(dǎo)致HSP30和其他應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP積累[4]，仍需要更多的研究加以證實。

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