王延 伍沙沙 徐婷 饒光玲 劉曉龍 李亞鋒 錢海兵

摘要 [目的]探討山臘梅葉揮發(fā)油對(duì)血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠認(rèn)知功能障礙的影響及其機(jī)制。[方法]將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、銀杏葉組、山臘梅葉揮發(fā)油高劑量和低劑量組，除假手術(shù)組外，皆采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法（2VO）復(fù)制VD模型。通過Morris水迷宮試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)定大鼠的認(rèn)知功能，HE染色觀察海馬CA1區(qū)病理變化，并檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。[結(jié)果]與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)（P<0.01）、平臺(tái)穿越次數(shù)減少（P<0.01）、垂直得分和水平得分下降（P<0.05）、SOD活性降低（P<0.01）、MDA含量增高（P<0.01）;與模型組比較，山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組大鼠逃避潛伏期縮短（P<0.05）、穿越原平臺(tái)次數(shù)增多（P<0.05）、垂直得分和水平得分增高（P<0.05），血清指標(biāo)SOD活性升高（P<0.05）、MDA含量下降（P<0.05）;HE染色結(jié)果顯示，山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞較完整，排列相對(duì)密集有序。[結(jié)論]山臘梅葉揮發(fā)油具有改善大鼠血管性癡呆認(rèn)知障礙的作用，其機(jī)制可能與糾正大鼠腦組織氧化/抗氧化失衡，保護(hù)腦組織免于氧化損傷，并減輕海馬區(qū)損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞 山臘梅葉;揮發(fā)油;血管性癡呆;認(rèn)知障礙;改善作用

中圖分類號(hào) R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）02-0170-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.046

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Improving Effect of Volatile Oil from Chimonanthus nitens Oliv.Leaves on Cognitive Disorder in Rats with Vascular Dementia

WANG Yan，WU Shasha，XU Ting et al （Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550025）

Abstract [Objective]To investigate the effect and mechanism of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv.leaves on cognitive disorder in rats with vascular dementia.[Method]SD rats were divided randomly into sham operation group，model group，ginkgo leaf group，high and low dose of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv.leaves groups.Except the sham operated group，all the other groups received twovessel occlusion （2VO） method to establish VD models.Morris water maze and open field test were used to determine the cognitive function of rats.HE staining was used to observe the pathological changes in the CA1 region of the hippocampus.Activity of superoxide dismutase （SOD） and malonaldehyde （MDA） content were detected to explore the mechanism of the essential oil from Chimonanthus nitens Oliv.on VD.[Result]Compared with sham operation group，the rats in model group had longer average escaping latency period （P<0.01），fewer number of crossplatform （P<0.01），fewer vertical and horizontal scores （P<0.05），higher MDA content （P<0.01） and lower SOD activity （P<0.01）.Compared with model group，the rats in high and low dose of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv.leaves groups had shorter average escaping latency period （P<0.05），more number of crossplatform （P<0.05），more vertical score and horizontal scores （P<0.05），higher SOD activity （P<0.05），lower MDA content （P<0.05）.HE staining results showed that the morphological structure of vertebral cells in hippocampal CA1 area were regular，orderly and normal，the structure of cells was intact.[Conclusion]The essential oil from Chimonanthus nitens Oliv.leaves can improve the cognitive disorder of vascular dementia in rats.The potential mechanism may be related to antioxidant and reduction of hippocampal injury.

Key words Chimonanthus nitens Oliv.leaves;Essential oil;Vascular dementia;Cognitive disorder;Improving effect

血管性癡呆（vascular dementia，VD） 是由各類腦血管疾病致使腦功能受損而引起的后天智力障礙綜合征。近年來VD的發(fā)病率逐年上升，是僅次于阿爾茲海默癥（Alzheimers disease，AD）的第二大常見癡呆類型[1-2]。 VD的認(rèn)知變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AD等其他疾病，主要為注意力、信息處理和執(zhí)行功能等缺陷，且抑郁和冷漠等癥狀在VD患者中表現(xiàn)尤為突出[3]。一系列認(rèn)知障礙及精神心理活動(dòng)的轉(zhuǎn)變嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。目前尚無食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的VD治療方案，臨床上的VD藥物主要為僅針對(duì)癥狀性治療的藥物，暫不能減緩VD的進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)VD的過程[4]，這也使從民族藥物中嘗試發(fā)現(xiàn)具有治療VD作用的藥物成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一。山蠟梅為貴州地區(qū)少數(shù)民族用藥，研究表明，山蠟梅葉不僅在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、解熱等方面有作用，也可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5-6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油成分對(duì)于認(rèn)知功能障礙具有一定的改善作用[7-10]，且李姝臻等[5]研究也發(fā)現(xiàn)臘梅葉具有改善癡呆小鼠學(xué)習(xí)能力的功能，基于此，該研究將基于氧化損傷探討山臘梅葉揮發(fā)油對(duì)大鼠血管性癡呆認(rèn)知功能障礙的改善作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。

成年雄性SD大鼠，體重（280±20）g，購(gòu)買于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后開始試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)藥物。

山臘梅葉在2019年7月采自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)，采回的藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉曉龍博士準(zhǔn)確鑒定為臘梅科臘梅屬山臘梅（Chimonanthus nitens Oliv.）。每次稱取粉碎后的山臘梅葉300 g置于3 000 mL燒瓶中，加1 000 mL去離子水，用揮發(fā)油提取器按水蒸氣蒸餾法提取5 h，所得的山臘梅葉揮發(fā)油為具有濃郁香味的淡黃色透明油狀物，用無水硫酸鈉脫水，密封避光保存?zhèn)溆茫涮崛÷蕿?.14%。銀杏葉片，規(guī)格0.21 g/粒，產(chǎn)品批號(hào)190102，廣州一力羅定制藥有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器。

MDA測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20181226）;SOD測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20181220）;HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào) 20180820）;DRT-TW電熱套（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;Morris水迷宮系統(tǒng)（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，DNS-2）;曠場(chǎng)試驗(yàn)系統(tǒng)（貴州中醫(yī)藥大學(xué)提供）;80-1醫(yī)用離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）;InfiniteM200酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司）;YZB/0009-2003組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;RM2265組織切片機(jī)（浙江省金華科迪儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與篩選。

采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法（2VO）[11-12]予大鼠復(fù)制VD模型，假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎血管外，其余操作同VD模型大鼠。在造模完成后第1天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以鑒定造模是否成功，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Longa等[13]制定的5級(jí)評(píng)分法改進(jìn)：0分，無神經(jīng)功能缺損，提尾懸空時(shí)，大鼠兩前肢可向地面伸直;1分，輕微神經(jīng)功能缺損，提尾懸空時(shí)，大鼠一側(cè)前肢不能充分伸展;2分，中度局灶性神經(jīng)功能缺損，大鼠向一側(cè)環(huán)行運(yùn)動(dòng);3分，重度局灶性神經(jīng)功能缺損，大鼠行走時(shí)向一側(cè)傾倒;4分，喪失行走能力。評(píng)分達(dá)到1～4分鑒定為造模成功[14-15]。

1.2.2 分組及給藥。

除假手術(shù)組外，符合1～4分的合格大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組（19.60、4.90 mg/kg，相當(dāng)于生藥量的14.0、3.5倍）和銀杏葉片組（6.72 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的7倍），無造模僅分離血管的為假手術(shù)組。每組8只。各組大鼠均灌胃給藥，灌胃體積為10 mL/kg，假手術(shù)組、模型組給予同等劑量的生理鹽水，每天1次，28 d后開始水迷宮試驗(yàn)，水迷宮和曠場(chǎng)試驗(yàn)期間持續(xù)給藥。

1.2.3 Morris水迷宮試驗(yàn)（Morris water maze，MWM）。

MWM系統(tǒng)由圓柱形水池、自動(dòng)錄像設(shè)備和分析系統(tǒng)構(gòu)成。水池直徑150 cm、深度50 cm，均分為4個(gè)象限且四周有視覺提示，池中設(shè)置一個(gè)直徑9.5 cm、高度28.0 cm的透明圓柱形站臺(tái)，并使其位于第三象限中間位置，其頂部沒于水下1 cm處，水溫（25±1）℃。給藥28 d后，將各組大鼠進(jìn)行MWM測(cè)試：第1～3天為訓(xùn)練期，每天進(jìn)行2次定位練習(xí)，不記錄成績(jī);第4天將各組大鼠隨機(jī)從第一象限的入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄其逃避潛伏期和游泳路徑;在第5天撤除站臺(tái)，記錄2 min 內(nèi)大鼠在池內(nèi)的游泳軌跡和跨越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)。

1.2.4 曠場(chǎng)試驗(yàn)（open field test，OFT）。

MWM結(jié)束后，提前2 h 將大鼠放在OFT實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境。取一個(gè)5×5方格的曠場(chǎng)，隨機(jī)將各組大鼠放入曠場(chǎng)方格內(nèi)固定點(diǎn)，在曠場(chǎng)上方安置攝像機(jī)，記錄大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況，測(cè)定大鼠的水平活動(dòng)得分和垂直活動(dòng)得分等指標(biāo)。每完成一次測(cè)試立即用75%乙醇擦拭敞箱，去除大鼠氣味影響，待敞箱干燥后再進(jìn)行下一次曠場(chǎng)試驗(yàn)。

1.2.5 大鼠血清SOD活性、MDA含量檢測(cè)。

OFT結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)大鼠在麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min使血液分層。3 000 r/min下離心10 min，分裝血清，按試劑盒說明書操作，在550 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量各孔OD值即吸光度，繪制酶標(biāo)曲線，計(jì)算樣本濃度。

1.2.6 大腦組織HE染色。

取血后，快速斷頭取出大鼠腦組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定48 h，按常規(guī)方法脫水包埋處理。將組織制作成5 μm厚度切片，常規(guī)HE染色，分別觀察各組大鼠大腦海馬組織CA1區(qū)病理改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 從表1可以看出，模型組、銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高劑量組和山臘梅葉揮發(fā)油低劑量組4組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示大鼠VD模型復(fù)制成功;4組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明以上4組分組均衡。綜上所述，各組大鼠均可用于該試驗(yàn)研究。

2.2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較

各組大鼠MWM逃避潛伏期軌跡圖見圖1。5組大鼠逃避潛伏期比較（圖2A），模型組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著延長(zhǎng)（P<0.01）;與模型組比較，銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高和低劑量組大鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏期明顯縮短（P<0.01）。5組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)比較（圖2B），模型組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯少于假手術(shù)組（P<0.01）;與模型組比較，銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高和低劑量組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯增多（P<0.05），其中，山臘梅葉揮發(fā)油高劑量組差異極顯著（P<0.01）。表明大鼠VD模型復(fù)制成功且山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組均能改善VD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知能力。

2.3 各組大鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果比較

5組大鼠曠場(chǎng)軌跡圖見圖3。對(duì)比各組垂直得分（圖4A），模型組大鼠垂直得分明顯低于假手術(shù)組（P<0.05）;與模型組比較，銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組大鼠垂直得分明顯增高（P<0.05），其中，山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組差異極顯著（P<0.01）。對(duì)比各組水平得分（圖4B），模型組大鼠水平得分明顯低于假手術(shù)組（P<0.01）;與模型組比較，銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組大鼠水平得分明顯增高（P<0.05），其中，山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組差異極顯著（P<0.01）。表明大鼠VD模型復(fù)制成功且山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組均能改善VD大鼠的探索運(yùn)動(dòng)能力。

2.4 各組大鼠血清SOD活性比較

從圖5A可以看出，模型組大鼠血清中SOD活性明顯低于假手術(shù)組（P<0.01），表明模型組大鼠氧自由基清除能力降低;與模型組比較，銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組大鼠血清中SOD活性明顯升高（P<0.05），表明山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組均能提高VD大鼠氧自由基清除能力。

2.5 各組大鼠血清MDA含量比較

從圖5B可以看出，模型組大鼠血清中MDA含量較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01）;銀杏葉片組、山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組大鼠血清中MDA含量則明顯低于模型組（P<0.05），表明山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組均能降低VD大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化程度。

2.6 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)病理切片比較

常規(guī)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察海馬CA1區(qū)，結(jié)果顯示（圖6），假手術(shù)組椎體細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞核圓形居中清晰可見;模型組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列稀疏錯(cuò)雜，細(xì)胞數(shù)目較其他組明顯減少，并且大部分細(xì)胞壞死，核仁模糊;銀杏葉片組和山臘梅葉揮發(fā)油高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞較完整，排列較密集規(guī)整，細(xì)胞數(shù)目較多，有散在少量壞死神經(jīng)元。山臘梅葉揮發(fā)油低劑量組較銀杏葉片組和山臘梅葉揮發(fā)油高劑量組次之。表明山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組均能減輕VD大鼠腦組織海馬CA1區(qū)損傷程度。

3 討論與結(jié)論

癡呆在老年慢性疾病中占有突出地位[16]，VD是AD之后最常見的癡呆原因之一，約15%的病例是由VD引起[3]。VD是癡呆中唯一一種可藥物預(yù)防的疾病[2]，但目前尚無針對(duì)VD的正規(guī)治療方法及特異性藥物，故研發(fā)安全有效的治療藥物十分必要。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，能較好反映體內(nèi)自由基程度，SOD是機(jī)體清除自由基的重要酶類之一，可間接反映機(jī)體抗氧化水平的強(qiáng)弱。腦部缺血缺氧，會(huì)引起細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致SOD被消耗，MDA大量產(chǎn)生[17-19]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)腦血管損傷的主要原因之一，腦內(nèi)自由基的大量堆積最終會(huì)導(dǎo)致腦細(xì)胞受損，加重VD病情[20]。故大鼠體內(nèi)MDA、SOD的生成水平能間接反映VD的病情程度。此次試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠有明顯的氧化應(yīng)激損傷，而治療組在山臘梅葉揮發(fā)油的干預(yù)下減輕了氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，說明山臘梅葉揮發(fā)油能夠通過減少氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮VD的防治和治療作用。

海馬組織是儲(chǔ)存記憶的重要部位，被認(rèn)為是認(rèn)知功能及記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其中CA1是腦缺血缺氧最敏感的區(qū)域[21]。研究發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元大量凋亡丟失，而海馬缺血性損傷是VD的重要病理基礎(chǔ)之一[22-24]。海馬CA1區(qū)與空間探索和認(rèn)知功能有著密切聯(lián)系，故在該試驗(yàn)中主要以海馬CA1區(qū)作為病理切片的觀察對(duì)象。此次試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬CA1區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞壞死且排列稀疏錯(cuò)亂，治療組在山臘梅葉揮發(fā)油的干預(yù)下減輕了海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，說明山臘梅葉揮發(fā)油對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

氧化損傷被認(rèn)為是VD發(fā)生的機(jī)制之一，該試驗(yàn)結(jié)果中山臘梅葉揮發(fā)油高、低劑量組均能提升VD大鼠腦組織內(nèi)SOD活性，有效降低MDA含量，清除大鼠腦組織內(nèi)氧自由基，減輕了氧化應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，一定程度上保護(hù)了大鼠腦海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞，從而改善大鼠的認(rèn)知功能障礙，提高了VD大鼠學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知、探索運(yùn)動(dòng)等能力。這可能是山臘梅葉揮發(fā)油改善VD大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制之一，但進(jìn)一步機(jī)制尚需深入研究，也為山臘梅葉的深度開發(fā)提供了研究方向和基礎(chǔ)。

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