蕙蘭種子根狀莖培養(yǎng)與愈傷組織誘導(dǎo)

吳正景，高 文，馬鑫婷，高屹典，劉亞楠，楊芯賢，安冰潔

(1.河南科技大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471003;2.河南后博農(nóng)業(yè)科技有限公司，河南 洛陽 471003)

蕙蘭(CymbidiumfaberiRolfe)為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)地生草本植物，花葶從葉基部抽出，幾乎直立或稍外露，花大多為淺黃綠色，具5～11朵或更多花的總狀花序，通常有香氣，在我國北方地區(qū)長勢優(yōu)于春蘭。

目前關(guān)于蕙蘭組培方面的研究報(bào)道較少，主要因?yàn)檗ヌm對(duì)組培的條件要求較其他國蘭品種更為復(fù)雜，對(duì)其他國蘭的培養(yǎng)基配方適用性較差，在組培過程中容易發(fā)生褐化等問題。陳曉梅利用蕙蘭莖尖為外植體材料，通過誘導(dǎo)原球莖的形成建立起蕙蘭的離體快繁體系[1]；關(guān)仕港等人對(duì)金蕙進(jìn)行了生根實(shí)驗(yàn)，得到了最適合生根的培養(yǎng)基配方[2]；黃江等人用花莖和花芽，成功誘導(dǎo)出惠蘭的愈傷組織[3]；付秀琴發(fā)現(xiàn)在1/2MS培養(yǎng)基上，蕙蘭種子萌發(fā)率可達(dá)80%[4]。筆者通過種子無菌萌發(fā)，探討蕙蘭種子根狀莖的增殖、愈傷組織誘導(dǎo)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蕙蘭種子采集自河南省南陽市桐柏縣，經(jīng)河南科技大學(xué)園藝植物生物技術(shù)研究室無菌萌發(fā)，獲得蕙蘭種子根狀莖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根狀莖增殖 蕙蘭萌發(fā)種子根狀莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS，添加蔗糖 20 mg·L-1，瓊脂 7.0 g·L-1，pH=5.7，激素處理見表1。每處理接種4瓶，重復(fù)3次。60 d后測定其根狀莖總數(shù)、分支數(shù)、增加長度、增殖率、褐變數(shù)、生長狀況6項(xiàng)指標(biāo)。

表1 蕙蘭根狀莖增殖培養(yǎng)基

1.2.2 根狀莖分化出芽 蕙蘭根狀莖芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS，蔗糖15 mg·L-1，葡萄糖15 mg·L-1，瓊脂7.0 mg·L-1，pH=5.7，激素配方見表2。每處理接種3～4瓶，重復(fù)3次。40 d后測定其平均芽數(shù)、出芽率、平均長度、平均長葉數(shù)、褐化率、生長狀況。

表2 蕙蘭芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.2.3 根狀莖愈傷組織的誘導(dǎo) 接種時(shí)在惠蘭根狀莖表面劃出一個(gè)甚至多個(gè)傷口，以利于誘導(dǎo)愈傷組織的形成。每處理接種3～4瓶，重復(fù)3次。接種30 d后觀察愈傷誘導(dǎo)率、愈傷大小(長度)、生長狀況、褐化率、出芽率。

表3 蕙蘭根狀莖誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基

續(xù)表3 蕙蘭根狀莖誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)添加物對(duì)蕙蘭根狀莖增殖的影響

由表4可知，添加香蕉泥的培養(yǎng)基比添加土豆泥的培養(yǎng)基，其上惠蘭根狀莖的增殖率、增加的長度、分支數(shù)更高，褐變數(shù)更少。因此，添加香蕉泥的培養(yǎng)基比添加土豆泥的培養(yǎng)基更適合惠蘭根狀莖的增殖。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)根狀莖增殖的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)蕙蘭根狀莖分化出芽的影響

由表5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中的NAA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，惠蘭根狀莖出芽率均比接種于NAA1.0 mg·L-1的惠蘭根狀莖要長，同時(shí)其褐化率更低，生長狀況也較好。Y8處理中出芽率最高，達(dá)到87.5%，平均芽數(shù)為10.1，沒有出現(xiàn)褐化，說明培養(yǎng)基中單獨(dú)添加酪蛋白對(duì)蕙蘭出芽不利，而蛋白胨和酪蛋白同時(shí)添加時(shí)效果最好。

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)蕙蘭根狀莖誘導(dǎo)出芽的影響

2.3 根狀莖的愈傷誘導(dǎo)

由表6可知，單獨(dú)添加2,4-D和單獨(dú)添加NAA的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織，且當(dāng)2.4-D的濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)33.3%；激素配方 0.5 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-12,4-D+6-BA1.0 mg·L-1誘導(dǎo)的愈傷活力較好；添加椰汁對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織效果不明顯；培養(yǎng)基中加入1.0 g·L-1蛋白胨時(shí)，對(duì)于誘導(dǎo)惠蘭愈傷組織的形成效果最好，且誘導(dǎo)率比加入其他添加物的培養(yǎng)基要高，活力更強(qiáng)，且褐化率較低；KT對(duì)愈傷的誘導(dǎo)作用效果一般。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)蕙蘭誘導(dǎo)愈傷組織的影響

總之，在本次試驗(yàn)中，蕙蘭誘導(dǎo)愈傷組織效果最好的培養(yǎng)基配方是GY15，其誘導(dǎo)愈傷率為45.0%，愈傷為綠色，沒有褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

添加香蕉泥的培養(yǎng)基比添加土豆泥培養(yǎng)基更適合惠蘭根狀莖的增殖；誘導(dǎo)蕙蘭根狀莖分化出芽的最佳培養(yǎng)基配方為:MS + 2.0 mg·L-1NAA + 4.0 mg·L-16-BA + 1.0 g·L-1酪蛋白 + 1.0 g·L-1蛋白胨 + 15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1葡萄糖 + 7.0 g·L-1瓊脂；誘導(dǎo)根狀莖誘導(dǎo)愈傷組織形成的最適培養(yǎng)基配方為：MS + 0.5 mg·L-12,4-D + 1.0 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-16-BA +100 g·L-1椰汁 +30g·L-1蔗糖+7.0g·L-1瓊脂。

3.2 討論

2,4-D可以增加蕙蘭根狀莖的愈傷組織誘導(dǎo)率，但需要2,4-D和其他生長素及細(xì)胞分裂素配合使用，效果更好。

Samira Chugh等研究中表明，椰汁包含多種營養(yǎng)和激素，經(jīng)過高壓滅菌后與蘭花組培培養(yǎng)基的其他活性物質(zhì)相容性高，能夠刺激愈傷組織或者原球莖的形成，提高細(xì)小片段外植體的存活率，調(diào)整原球莖分化過程[5]。筆者試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 1.0 g·L-1的蛋白胨對(duì)誘導(dǎo)愈傷的效果最好，比加100 mL·L-1椰汁的效果更好。在誘導(dǎo)蕙蘭根狀莖出芽過程中，1.0 g·L-1蛋白胨和 1.0 g·L-1酪蛋白混合使用比單獨(dú)使用效果更好。