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      缺氧及缺氧再復(fù)氧對正常骨組織發(fā)生與發(fā)展的影響

      2021-06-18 09:52:50文艷華劉云燕馬保安
      陜西醫(yī)學(xué)雜志 2021年6期
      關(guān)鍵詞:常氧組骨組織小梁

      王 歡,董 川,李 彬,王 偉,王 璞,馬 瓊,文艷華,劉云燕,馬保安

      (1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科,陜西 西安 710038;2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第941醫(yī)院,青海 西寧 810007)

      我國高原地區(qū)有其獨(dú)特的地勢地貌和氣候特點(diǎn),其中低壓低氧環(huán)境對人類的健康有一定影響,不僅可以直接影響機(jī)體功能狀態(tài),而且在機(jī)體受負(fù)荷刺激后,不同的地理環(huán)境因其氣壓等差異將產(chǎn)生不同的效應(yīng)[1],如呼吸加快、心率增快、紅細(xì)胞增多(血液黏滯性增加)等,同時(shí)也會出現(xiàn)消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及認(rèn)知、記憶功能的減退,甚至發(fā)生高原相關(guān)疾病[2-6]。骨質(zhì)疏松癥是一種多因素造成的慢性疾病[7-8]。目前的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),高原地區(qū)人群骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率顯著高于平原地區(qū),可能的影響因素包括氧氣濃度、日照、性別、年齡、體重、飲食習(xí)慣及基礎(chǔ)疾病等,其中氧氣濃度對于骨代謝的影響最為顯著[9-10]。高原低氧環(huán)境是否對骨組織有明確的影響,目前仍存在爭議。本研究通過觀察低氧與常氧環(huán)境中小鼠骨組織發(fā)生及發(fā)展是否存在差異,以及復(fù)氧能否改善低氧對骨組織的不良影響,進(jìn)一步明確缺氧與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性C57小鼠40只,體重16.5~24 g,由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SYXK(陜)2020-007。隨機(jī)分為常氧組(16只)、低氧組(16只)、及低氧轉(zhuǎn)常氧組(8只)。分籠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心SPF動物房及低壓低氧艙,每籠4只,自由攝食、飲水,溫度22~26 ℃,濕度55%~65%,光照時(shí)間按照12 h間隔。

      1.2 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備和軟件 低壓低氧模擬實(shí)驗(yàn)艙(中國貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司);SysmexXE-2100全自動血細(xì)胞分析儀(日本SYSME東亞公司);Micro-CT(GE);生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(西安交通大學(xué)航空航天工程學(xué)院機(jī)械結(jié)構(gòu)強(qiáng)度與振動國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室);圖形分析軟件(美國Autodesk公司);石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);復(fù)合光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympas公司)。

      1.3 動物模型制作及實(shí)驗(yàn)流程 常氧組和低氧組分別飼養(yǎng)于常氧和低氧環(huán)境8周,而低氧轉(zhuǎn)常氧組于低氧環(huán)境飼養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)至常氧環(huán)境飼養(yǎng)4周。三組小鼠前3 d分別置于動物飼養(yǎng)室及低壓低氧艙(正常大氣壓)內(nèi)喂養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境。第4天開始實(shí)驗(yàn),低壓低氧艙開始降壓,艙內(nèi)空氣壓力設(shè)置為61.64 kPa,模擬海拔4000 m的大氣壓,氧分壓12.91 kPa,定期開倉投喂。常氧組仍于動物房內(nèi)正常大氣壓下喂養(yǎng)。于4周和8周行心尖取血后將雙側(cè)股骨分離取出,右側(cè)先后行micro-CT及HE染色,左側(cè)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。

      1.4 血液學(xué)檢查 小鼠麻醉后由低壓低氧艙和動物飼養(yǎng)房移至手術(shù)室在心尖取血,標(biāo)本收集后立即送至西京醫(yī)院門診檢驗(yàn)科檢測血常規(guī)。

      1.5 micro-CT檢測 小鼠斷頸處死后,取右側(cè)股骨置于福爾馬林溶液中-4 ℃保存。標(biāo)本收集后統(tǒng)一行micro-CT檢測[11-12]。掃描參數(shù):分辨率8 μm,球管電流80 mA,球管電壓80 kV,曝光時(shí)間3000 ms。掃描完成后,選取距離股骨遠(yuǎn)端生長板1 mm處開始向近端高度2 mm范圍為感興趣區(qū)域行三維重建,使用Explore Reconstruction軟件進(jìn)行重建定量分析[13],檢測相對骨體積(BV/TV)、相對骨表面積(BS/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)[10]。

      1.6 組織學(xué)觀察 將多聚甲醛固定后的右側(cè)股骨標(biāo)本流水沖洗24 h,經(jīng)10% EDTA脫鈣14 d,常規(guī)逐級酒精脫水、二甲苯透明、石蠟浸潤及包埋。用切片機(jī)5 μm連續(xù)切片,二甲苯脫蠟,HE染色,光鏡下觀察骨小梁分布以及面積、長度、厚度等[14]。

      1.7 生物力學(xué)檢測 將在70%濕鹽水中保存的左側(cè)股骨用紗布擦干水分[15]。將股骨標(biāo)本放置在生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上,實(shí)驗(yàn)臺跨距6 mm,加載速率0.005 mm/s。在加載負(fù)荷過程中,機(jī)器實(shí)時(shí)記錄下載荷與位移參數(shù),直到股骨發(fā)生斷裂。比較兩組生物力學(xué)性能[16-17]。

      1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較用方差分析,三組間兩兩比較采用Newman-Keuls法(q檢驗(yàn)), 多樣本間兩兩比較涉及重復(fù)測量時(shí)用Bonferroni校正。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 三組小鼠體重及體重增量比較 見表1。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。4周時(shí)低氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組小鼠體重及體重增量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),但均低于常氧組(均P<0.05)。8周時(shí)三組小鼠體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組體重增量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但均高于低氧組(均P<0.05)。

      表1 各組小鼠體重及體重增量比較(g)

      2.2 三組小鼠血常規(guī)比較 見表2。4周時(shí),低氧組紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)及紅細(xì)胞壓積(HCT)均高于常氧組(均P<0.05)。8周時(shí),低氧組RBC、Hb、HCT均高于常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組(均P<0.05),而常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組上述指標(biāo)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

      表2 三組小鼠血常規(guī)比較

      2.3 三組小鼠4周及8周時(shí)微觀結(jié)構(gòu)比較 見表3(圖1)。micro-CT三維重建結(jié)果顯示,4周時(shí)低氧組骨小梁出現(xiàn)斷裂、變短、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化,空隙較大;常氧組骨小梁較粗,空隙較小,數(shù)量較多,連續(xù)性較好。8周時(shí)低氧組骨小梁斷裂、退化明顯,空隙明顯;低氧轉(zhuǎn)常氧組骨小梁空隙小且均勻,連續(xù)性較好。各參數(shù)量化分析結(jié)果顯示,4周時(shí)低氧組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧組,BS/TV高于常氧組(均P<0.05);8周時(shí)低氧組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組,BS/TV高于常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組(均P<0.05),而常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

      表3 三組小鼠4周及8周時(shí)微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

      圖1 各組小鼠股骨干骺段4周(A)及8周(B)時(shí)二維平面及三維重建圖

      2.4 三組小鼠股骨遠(yuǎn)端HE染色結(jié)果比較 見圖2。標(biāo)本均選擇股骨遠(yuǎn)端靠近生長板處的松質(zhì)骨進(jìn)行觀察。4周時(shí),可見低氧組骨小梁相對稀疏,常氧組骨小梁較為豐富。8周時(shí),低氧組較常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組明顯疏松,但常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組無明顯差異。

      圖2 三組小鼠股骨遠(yuǎn)端4周(A)、8周(B)時(shí)HE染色結(jié)果

      2.5 三組小鼠4周及8周時(shí)生物力學(xué)指標(biāo)比較 見表4。4周時(shí),低氧組股骨干最大力、剛度、最大應(yīng)力以及楊氏模量均低于常氧組(均P<0.05)。8周時(shí),低氧組股骨干最大力、剛度、最大應(yīng)力以及楊氏模量均低于常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組(均P<0.05),但常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

      表4 三組小鼠4周及8周時(shí)生物力學(xué)指標(biāo)比較

      3 討 論

      高原環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的復(fù)合環(huán)境,其中低大氣壓、低氧、低溫、低濕、強(qiáng)太陽輻射等因素往往綜合作用于人體,對身體機(jī)能、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、大腦功能(記憶和認(rèn)知)等有明顯的影響。目前認(rèn)為低壓低氧是其中重要且對機(jī)體影響較大的因素[18-19],對骨發(fā)生及骨愈合的影響也不乏報(bào)道。

      本研究著重觀察高原低壓低氧環(huán)境對小鼠正常骨發(fā)生、發(fā)展的影響,發(fā)現(xiàn)小鼠在缺氧環(huán)境較常氧環(huán)境中增長緩慢,紅細(xì)胞增多(血液黏滯性增加),符合高原缺氧環(huán)境的表現(xiàn)。較低的體重被認(rèn)為是降低氧耗量的適應(yīng)性改變,而增多的紅細(xì)胞從另一方面增加了血液的攜氧能力,從而保證機(jī)體更好地適應(yīng)低氧環(huán)境,這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[20-22]一致。低氧環(huán)境小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨較常氧環(huán)境骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量顯著減少,骨表面積和組織體積比顯著增加,說明低氧環(huán)境中正常骨組織發(fā)生了微觀結(jié)構(gòu)的改變,出現(xiàn)了骨質(zhì)流失,傾向于發(fā)生骨質(zhì)疏松,從而增加了發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)。生物力學(xué)測試則說明了低氧環(huán)境中小鼠骨骼機(jī)械性能同時(shí)受損,其產(chǎn)生可能涉及多種機(jī)制。骨組織的正常發(fā)生、發(fā)展有賴于正常氧分壓下的局部微環(huán)境,當(dāng)體內(nèi)組織氧分壓下降,組織內(nèi)的血管形成及細(xì)胞外基質(zhì)沉積均會減弱,往往會影響骨組織的強(qiáng)度和質(zhì)量。特別重要的是,低氧環(huán)境中的小鼠復(fù)氧后表現(xiàn)出了骨骼結(jié)構(gòu)和功能的改善和恢復(fù),與常氧環(huán)境無顯著差異,說明骨組織的發(fā)展很大程度上依賴于骨組織局部微環(huán)境中的氧分壓,而氧分壓的改變會影響多種骨細(xì)胞的相互作用,宏觀上表現(xiàn)為骨組織結(jié)構(gòu)功能的改變。本研究選取小鼠股骨進(jìn)行了micro-CT、HE染色和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)等,結(jié)果提示在模擬高原低壓低氧的環(huán)境下小鼠正常骨組織的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀功能受到不同程度的影響,存在發(fā)展為骨質(zhì)疏松的可能性,其產(chǎn)生可能涉及多種機(jī)制,復(fù)氧對骨骼結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)具有一定作用。

      骨的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)動態(tài)平衡的過程,由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓腔內(nèi)微環(huán)境共同完成。低氧環(huán)境下人體血氧濃度下降,骨髓腔內(nèi)氧濃度也受到明顯影響。在此微環(huán)境的變化下,成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的代謝必然受到影響[23-25]。低氧環(huán)境下各種細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)的釋放打破了成骨與破骨的動態(tài)平衡,綜合因素下造成骨質(zhì)流失[26-27]。本研究還發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過短期低氧環(huán)境已造成骨流失的情況下,復(fù)氧對于骨組織恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和功能尤為重要。因此,對于高原短期工作或任務(wù)人群,制定合理的高原環(huán)境中作業(yè)時(shí)間并及時(shí)有效地降高復(fù)氧對維持骨組織正常的平衡和保護(hù)原有的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

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