蘭科植物與菌根真菌專一性研究進(jìn)展*

唐燕靜，郭順星，陳 娟

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

0 引 言

蘭科（Orchidaceae），是與真菌形成典型菌根共生關(guān)系的高等植物類群，是植物界第二大科，物種多樣性豐富、分布廣泛，共分為5亞科、763屬、2.8萬余種，占被子植物物種多樣性比例的8%[1-2].該科許多種類是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，如鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、天麻（Gastrodia elata）等為我國歷屆藥典收錄[3].蘭科多樣性的物種、多樣化的傳粉機(jī)制及其與真菌特殊的共生關(guān)系吸引全世界生物學(xué)家進(jìn)行研究.由于“從頭到腳”，即從昆蟲傳粉到菌根共生，都體現(xiàn)了生物共生關(guān)系，其被認(rèn)為是進(jìn)化生態(tài)學(xué)及生物間相互作用研究的最理想的模式植物[4-5].自然條件下，真菌對(duì)蘭科種子的萌發(fā)、幼苗的生長發(fā)育乃至成年植株的繁殖和分布有著重要影響.近年來，蘭科植物與真菌的共生關(guān)系已經(jīng)成為生物學(xué)和生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).

蘭科植物高度依賴菌根真菌來完成其生命周期，尤其在缺乏胚乳導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏的種子萌發(fā)階段和幼苗生長階段[6-9].Bernard[10]最早觀察到同屬或同種蘭科植物總是與同一類真菌共生，因此，提出蘭科植物與其共生真菌存在一定的專一性關(guān)系.此后，眾多學(xué)者圍繞二者之間的專一性關(guān)系開展了大量研究[8，11-12].然而，該領(lǐng)域的研究一直是蘭科植物研究的熱點(diǎn)和爭論的焦點(diǎn).隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用，越來越多的研究結(jié)果傾向于蘭科植物與共生真菌之間存在某種特定的專一性關(guān)系，且這種關(guān)系受多種因素影響[13-14].

本文綜述了近年來蘭科植物與菌根真菌專一性關(guān)系相關(guān)文獻(xiàn)，從定義、影響因素、蘭科菌根研究方法及共生機(jī)制等方面進(jìn)行總結(jié)和分析，旨在全面分析蘭科菌根專一性這一現(xiàn)象，為今后更好地利用菌根技術(shù)，實(shí)現(xiàn)蘭科植物的規(guī)?；耘嗪鸵吧Ｓ於ɑA(chǔ)；同時(shí)對(duì)瀕危蘭科植物在原始生態(tài)環(huán)境的生態(tài)恢復(fù)也具有一定的指導(dǎo)意義.

1 專一性關(guān)系定義

植物與微生物（病原菌及共生真菌）相互作用時(shí)普遍存在一定的專一性關(guān)系，這種專一性關(guān)系常與宿主植物間的系統(tǒng)發(fā)育、生理差異，微生物間的競爭關(guān)系以及共生體之間的互惠效應(yīng)、資源優(yōu)先分配等因素相關(guān)[15-16].蘭科菌根是繼叢枝菌根及外生菌根之外的第3種菌根類型，研究表明：蘭科菌根共生較其他類型的菌根關(guān)系有更高的菌根專一性[17-18]，體現(xiàn)在這些共生真菌通常是腐生菌，且僅在蘭科植物根內(nèi)形成典型的菌根共生結(jié)構(gòu)，即菌絲圈（pelotons）.

關(guān)于蘭科菌根的早期研究提出：在植物分類學(xué)上，屬于同一屬或種的蘭科植物總與相同種類的真菌共生，即蘭科菌根真菌在宿主植物屬或種水平上存在專一性[10]；而隨后的實(shí)驗(yàn)表明蘭科菌根在“種?種”的水平上（宿主植物?共生真菌）沒有專一性[19].有關(guān)蘭科植物與菌根真菌專一性的命題一直存在爭議，究其原因可能與不同學(xué)者對(duì)二者專一性關(guān)系的定義及界定范圍不同有關(guān)[20].Mycorrhizal ecolo?gy[20]書中指出一種蘭科植物與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上屬于同一分支的真菌共生，即認(rèn)為其具有一定的菌根真菌專一性；而最近有學(xué)者指出蘭科植物與菌根真菌專一性，廣義上指宿主植物與多種特定真菌類群共生，表現(xiàn)為宿主植物對(duì)共生真菌具有一定偏好性[13]，嚴(yán)格意義上指宿主植物與唯一種類真菌共生，表現(xiàn)為一定的排他性[21].絕大多數(shù)研究蘭科植物與菌根真菌專一性的相關(guān)文獻(xiàn)是采用廣義的專一性定義，具有一定的普遍性，本文專一性定義包含廣義上的專一性和狹義上的專一性定義.

蘭科植物與菌根真菌之間專一性關(guān)系的研究方法通常有2種.一種是從自然生態(tài)環(huán)境中采集成年蘭科植物的根，從皮層細(xì)胞中分離菌根真菌，探討成年蘭科植物與菌根真菌之間的關(guān)系；另一種是在體外實(shí)驗(yàn)條件下，利用蘭科種子與各種菌根真菌進(jìn)行共生萌發(fā)，探討實(shí)驗(yàn)室條件下，種子或原球莖與菌根真菌之間的關(guān)系[22-23].針對(duì)以上研究方法，有學(xué)者提出“生態(tài)專一性”（ecological specificity）和“潛在專一性”（potential specificity）的概念，即在自然生態(tài)環(huán)境下，真菌能在蘭科植物根的皮層細(xì)胞或原球莖中形成菌絲圈，則表明蘭科植物與這類真菌之間存在生態(tài)專一性；而在適宜的體外條件下，如實(shí)驗(yàn)室條件下，采用真菌與蘭科種子或幼苗共培養(yǎng)的方式，研究在蘭科植物的組織細(xì)胞中形成菌絲圈，則表明二者之間存在潛在專一性[23].同時(shí)，有研究表明利用原位萌發(fā)技術(shù)，在自然條件下，促進(jìn)種子萌發(fā)的真菌種類要遠(yuǎn)少于實(shí)驗(yàn)室條件下，因此，表現(xiàn)出在自然條件下，蘭科植物與共生真菌有更強(qiáng)的專一性[23-24]，即潛在專一性不等同于生態(tài)專一性.

生態(tài)專一性與潛在專一性是根據(jù)蘭科菌根專一性研究方法衍生出的一組概念，二者側(cè)重點(diǎn)不同，互為補(bǔ)充.如采集蘭科植物的根，利用真菌特異性引物，通過高通量測(cè)序方法鑒定的菌根真菌，并討論其與宿主植物的關(guān)系，通常屬于生態(tài)專一性范疇；而在實(shí)驗(yàn)室條件下，從蘭科植物根組織塊或根內(nèi)菌絲圈直接分離、培養(yǎng)共生真菌，并通過與特定蘭科植物共培養(yǎng)的方式，篩選出的菌根真菌，分析其與宿主的關(guān)系，則多是采用潛在專一性概念.

2 影響因素分析

蘭科植物種類豐富、營養(yǎng)類型復(fù)雜、生態(tài)類型多樣、地理分布限制，這些都會(huì)不同程度地影響蘭科植物和與其共生真菌之間的專一性關(guān)系，本文對(duì)比總結(jié)了代表性文獻(xiàn)的結(jié)果，并分析了影響蘭科菌根專一性關(guān)系的主要因素（表1）[6，12，25-46].

表1 蘭科植物與菌根真菌之間專一性關(guān)系的影響因素[6，12，25-46]

續(xù)表

2.1 分類等級(jí)

蘭科植物與菌根真菌之間專一性研究時(shí)間較久，但蘭科植物與真菌之間的協(xié)同進(jìn)化研究卻始終被忽略.蘭科植物包含800余屬，2.8萬余種，就目前已研究的有限屬、種，無論是原始還是進(jìn)化的蘭科植物種類，其報(bào)道主要與膠膜菌科（Tulasnella?ceae）、角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae）及蠟殼耳目（Se?bacinales）真菌共生[27].蘭科植物的屬、種分類地位及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，甚至不同倍體會(huì)部分影響與真菌的共生關(guān)系[9，47-48].

Jacquemyn 等[49]研究了 21種紅門蘭屬（Orchis）的植物，顯示其菌根真菌呈明顯的鑲嵌結(jié)構(gòu)（nested network），具體表現(xiàn)為親緣關(guān)系相近的蘭科植物傾向與同一組單一分類單元（operational taxonomic units，OTU）的真菌共生，且隨著植物系統(tǒng)發(fā)育距離的增加，二者之間的專一性程度降低.表明蘭科菌根真菌專一性受蘭科植物物種的系統(tǒng)發(fā)育限制.蘭科植物斑葉蘭屬（Goodyera）系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)表明其系統(tǒng)發(fā)育中較原始的種類菌根真菌專一性較高，隨著植物系統(tǒng)發(fā)育距離的增加，二者之間的專一性發(fā)生變化[27]，且蘭科植物保留祖先共生體的多樣性和進(jìn)化生態(tài)位的保守型，最終表現(xiàn)為蘭科菌根的系統(tǒng)發(fā)育具有一定的保守性.

2.2 營養(yǎng)類型

蘭科植物與菌根真菌之間專一性關(guān)系可能與蘭科植物異養(yǎng)程度有關(guān)[50]，其在不同營養(yǎng)類型的宿主之間有較大差異.基于成年的蘭科植物對(duì)碳源利用的不同，可分類為光合自養(yǎng)型（photosynthetic）、完全真菌異養(yǎng)型（fully mycoheterotrophic）和部分真菌異養(yǎng)型（partial mycoheterotrophic）或混合營養(yǎng)型（mixotrophs）3種不同的營養(yǎng)類型[51]，其中完全真菌異養(yǎng)型和部分真菌異養(yǎng)型或混合營養(yǎng)型又統(tǒng)稱為菌根異養(yǎng)型（mycoheterotrophic）.

無論是廣泛分布或限制性分布的光合自養(yǎng)型蘭科植物，往往具有較低的菌根真菌專一性關(guān)系[26-27，36]；從表 1 可知，與大部分光合自養(yǎng)型蘭科植物共生的菌根真菌為膠膜菌科，角擔(dān)菌科和蠟殼耳目 ，如Gavilea australis[38]、羊 耳 蒜（Liparis japoni?ca）[39]、石斛屬（Dendrobium）[44]或特定地域分布的光合自養(yǎng)型蘭科植物Piperia yadonii[36]，且光合自養(yǎng)型蘭科植物通常與蠟殼耳目B組（Sebacinales Group B）共生[52].與非光合自養(yǎng)型蘭科植物整個(gè)生活史都不同程度依賴共生真菌為其提供營養(yǎng)物質(zhì)不同，光合自養(yǎng)型蘭科植物在成年階段，自身進(jìn)行光合作用獲得營養(yǎng)物質(zhì)，因此，可能對(duì)共生真菌的依賴更少，甚至有些植物為共生真菌提供碳營養(yǎng)物質(zhì)，其與真菌形成共生關(guān)系時(shí)，存在一種機(jī)會(huì)主義現(xiàn)象，導(dǎo)致光合自養(yǎng)型蘭科植物與共生真菌的專一性較低.

菌根異養(yǎng)型蘭科植物，大多與可以進(jìn)行光合作用的鄰近樹木的外生菌根真菌或非絲核菌類的腐生真菌，尤其是木腐菌、葉腐菌或蠟殼耳目A組（Sebacina?les Group A）共生 ，表 現(xiàn) 出高 度 的 專 一性[25，51，53-55].Barrett等[25]對(duì)完全真菌異養(yǎng)型蘭科植物珊瑚蘭屬（Corallorhiza）植物Corallorhiza striata的42個(gè)種群、107個(gè)個(gè)體進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Corallorhiza striata只與屬于外生菌根真菌的革菌科（Thelephoraceae）革菌屬（Tomentella）真菌共生，表現(xiàn)出高度的專一性.不同種類的混合營養(yǎng)型蘭科植物舌唇蘭屬（Platanthera）植物小舌唇蘭（Platanthera minor）與形成外生菌根的角擔(dān)菌科真菌共生[33]、頭蕊蘭屬（Cephalanthera）植物金蘭（Cephalanthera falcata）與革菌屬真菌共生[34]、鶴頂蘭屬（Limodorum）植物L(fēng)i?modorum abortivum與外生菌根真菌?紅菇科（Russu?laceae）真菌具有高度的專一性[50].生長在森林中的綠色蘭科植物，在蔭蔽環(huán)境中光合效率低下，因此，強(qiáng)烈依賴共生真菌為其提供碳水化合物，表現(xiàn)為混合營養(yǎng)型.菌根異養(yǎng)型蘭科植物由于其分布具有不重疊的地理范圍或棲息地有一定偏好性，導(dǎo)致沒有遇到某些真菌類群或其變種；或者可能因?yàn)榕c其共生的真菌具有更穩(wěn)定、高輸出量的碳及其他營養(yǎng)物質(zhì)特性，最終導(dǎo)致二者之間具有高度專一性.混合營養(yǎng)型蘭科植物的菌根真菌專一性程度介于光合自養(yǎng)型和完全真菌異養(yǎng)型蘭科植物之間，一方面較自養(yǎng)型蘭科植物菌根真菌專一性程度高，另一方面比完全真菌異養(yǎng)型蘭科植物菌根真菌專一性程度低.

2.3 生態(tài)類型

蘭科植物的生態(tài)類型與其菌根真菌間的專一性關(guān)系的研究近幾年備受關(guān)注.蘭科植物從生活環(huán)境上可分為地生、石生、附生和腐生4種生態(tài)類型.從表1中可知，不同種類的地生蘭，如斑葉蘭屬植物的優(yōu)勢(shì)共生菌群為角擔(dān)菌屬真菌[27]，竹葉蘭屬（Arundina）植物的優(yōu)勢(shì)共生菌群為膠膜菌屬[46]，附生蘭樹蘭屬（Epidendrum）[35]、凸唇蘭屬（Cyrtochi?lum）多與膠膜菌科、蠟殼耳目真菌共生[42]，腐生蘭珊瑚蘭屬植物僅與革菌屬真菌共生[25].此外，熱帶地區(qū)的附生蘭的共生真菌類群較地生蘭共生真菌更為保守和專一[56]，由于附生蘭在熱帶生態(tài)系統(tǒng)中種類高度多樣化，生長環(huán)境存在水分短缺、養(yǎng)分有限和輻照受一定約束等問題，導(dǎo)致其比地生蘭的生態(tài)位緊張，具有較強(qiáng)的營養(yǎng)限制，因此，需要較為穩(wěn)定的營養(yǎng)來源.地生蘭的種子在地下發(fā)育很長時(shí)間，期間靠真菌提供穩(wěn)定、持久的碳源，因此，地生蘭可能會(huì)形成極高的菌根真菌特異性，表現(xiàn)為世界范圍內(nèi)的地生蘭與膠膜菌科真菌共生[49，57]，如杓蘭屬（Cypripedium）植物的優(yōu)勢(shì)共生菌群主要是膠膜菌屬真菌[30].大多數(shù)的附生綠色蘭科植物的共生真菌屬于角擔(dān)菌科、膠膜菌科和蠟殼耳目，且與地生蘭共生萌發(fā)真菌一樣，都以膠膜菌科和角擔(dān)菌科真菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì).

2.4 地理分布

蘭科菌根專一性與宿主植物的地理分布存在一定的相關(guān)性.蘭科植物種子缺乏胚乳，在種子萌發(fā)及幼苗生長階段高度依賴菌根真菌完成其生命周期.因此，蘭科植物的地理分布受共生真菌的豐度與分布的影響，從而影響蘭科菌根真菌專一性.

部分研究表明，在島嶼分布的蘭科植物或具有較高的菌根真菌專一性，或多與以膠膜菌科真菌為優(yōu)勢(shì)菌根真菌的絲核菌類真菌共生[12].如 Swift等[12]研究夏威夷群島（6個(gè)獨(dú)立海洋島嶼）特有開唇蘭屬（Anoectochilus）植物Anoectochilus andvicensis的菌根真菌種類，顯示其每一個(gè)種群都與角擔(dān)菌屬特定種共生，表明二者之間具有較高的專一性，可能的原因是由于島嶼上可利用的真菌種類較少，使其具有較高的菌根真菌專一性；Martos等[56]研究顯示，熱帶島嶼Reunion島上生長的25屬73種蘭科植物（地生蘭和附生蘭）多與絲核菌類真菌共生，其中膠膜菌科真菌為主要優(yōu)勢(shì)菌根真菌所占百分比69%，其次為Sebacinales Group B真菌和角擔(dān)菌科真菌，推測(cè)不同島嶼的真菌種類不同，在一定程度上限制了當(dāng)?shù)靥m科植物與其菌根真菌的專一性.

陸地地區(qū)或地理分布更廣的不同島嶼地區(qū)的蘭科植物其菌根真菌專一性相對(duì)較低，可能由于陸地共生真菌的種類更多，蘭科植物有更大的概率與更多的真菌共生.具體表現(xiàn)為熱帶地區(qū)由于其真菌種類豐富，該地區(qū)的蘭科植物具有較低的菌根真菌專一性[26].膠膜菌屬真菌是地中海地區(qū)蘭科植物優(yōu)勢(shì)共生菌根真菌[58]；McCormick 和 Jacque?myn[59]研究表明，大規(guī)模分布的同種稀有蘭科植物的菌根真菌種類無顯著性差異，大規(guī)模分布的稀有蘭科植物與菌根真菌之間專一性不受真菌地理位置的影響；McCormick等[8]指出在小規(guī)模有限的取樣尺度上稀有蘭科植物與菌根真菌之間專一性受地理位置的影響；Xing等[60]研究表明2種廣泛分布的蘭科植物手參（Gymnadenia conopsea）、火燒蘭（Epipactis helleborine）受地理位置的影響，其菌根真菌組成有顯著性差異，具體表現(xiàn)為：歐洲地區(qū)（3個(gè)國家共4個(gè)居群）手參的OTU主要屬于膠膜菌科，而中國地區(qū)（6個(gè)居群）手參的OTU則主要屬于角擔(dān)菌科真菌；歐洲地區(qū)（3個(gè)國家7個(gè)居群）火燒蘭的OTU主要屬于紅菇科，而中國地區(qū)（3個(gè)省7個(gè)居群）的OTU主要屬于塊菌科（Tuberaceae），且2種蘭科植物的菌根群落的相似性隨著地理距離的增加而顯著降低，表明部分廣泛分布的蘭科植物不同地區(qū)的菌根真菌專一性不同.值得注意的是蘭科植物的分布不一定受共生真菌分布的限制.

2.5 生長發(fā)育階段

蘭科植物與菌根真菌之間專一性關(guān)系與宿主植物生長發(fā)育相關(guān)，在蘭科植物生長發(fā)育過程中，共生真菌的多樣性存在一個(gè)瓶頸.且對(duì)于溫帶地區(qū)歐洲一些混合營養(yǎng)型蘭科植物在其幼苗后期階段專一性程度最高，在植物成年階段共生真菌種類再次增加[46].如 Huang等[61]從齒瓣石斛（Dendrobium devonianum）原球莖中分離得到菌根真菌FDd1、兜唇石斛（Dendrobium aphyllum）中分離得到菌根真菌FDaI7、硬葉蘭（Cymbidium mannii）中分離得到菌根真菌FCb4，研究證實(shí)3種菌根真菌均能促進(jìn)齒瓣石斛的種子萌發(fā)與原球莖的形成，但只有FDd1能夠促進(jìn)其幼苗生長，表明該植物幼苗成長階段具有較高的菌根真菌專一性.腐生蘭科植物天麻，其種子萌發(fā)階段需要與紫箕小菇（Mycena osmuudicola）、石斛小菇（Mycena dendrobii）等小菇屬（Mycena）真菌共生，而其原球莖發(fā)育及繁殖則必須要與蜜環(huán)菌共生[62].

蘭科植物的成年階段營養(yǎng)物質(zhì)需求增加，改變共生真菌種類有助于其提高對(duì)環(huán)境波動(dòng)干擾的耐受性.此外，蘭科植物在不同生長階段與不同真菌共生，具有一定的生態(tài)優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)為蘭科植物在早期生長階段，由于和成年植物具有不同的共生真菌，從而避免了與成年蘭科植物的競爭.Jacque?myn等[49]指出紅門蘭屬原球莖階段對(duì)菌根真菌的專一性高于成年階段；而Waud等[63]表明羊耳蒜屬植物L(fēng)iparis loeselii的原球莖階段所含共生真菌種類比幼苗及成年階段所含共生真菌種類豐富.可能因?yàn)長iparis loeselii是一種生長周期短，頻繁萌發(fā)與死亡的物種，因此，需要與更多的真菌共生以達(dá)到增加種子萌發(fā)概率的目的，表現(xiàn)為其在原球莖階段有較低的菌根真菌專一性.蘭科植物發(fā)育階段與菌根真菌的專一性關(guān)聯(lián)模式還有待深入研究.

2.6 其他因素

除以上主要客觀因素外，土壤養(yǎng)分有效性[9]、土壤含水量[63]、土質(zhì)類型[64]、采樣量大小、采樣時(shí)間[65]、實(shí)驗(yàn)室條件下的培養(yǎng)條件和研究手段等其他因素，也對(duì)蘭科植物與菌根真菌之間的專一性研究有一定的影響.

理想情況下，蘭科植物與菌根真菌之間的專一性研究，應(yīng)在蘭科植物原生境或模擬原生境的條件下進(jìn)行，具體表現(xiàn)為真菌在接近自然生態(tài)環(huán)境的基質(zhì)上培養(yǎng)、蘭科種子具有一定活性以及了解共生期間所參與的所有物種等.然而，大多數(shù)情況下，二者之間專一性研究是建立在離理想狀態(tài)很遠(yuǎn)的情況下進(jìn)行.隨著研究蘭科植物種類的增多、蘭科菌根生態(tài)學(xué)的發(fā)展、分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、共生機(jī)制的完善和專一性定義明確，蘭科植物與菌根真菌之間專一性關(guān)系將會(huì)有更確切的研究結(jié)論出現(xiàn).

3 研究方法

蘭科菌根真菌的鑒定及多樣性分析是研究蘭科植物與菌根真菌專一性關(guān)系的前提，是全面理解二者之間的專一性的基礎(chǔ).根據(jù)蘭科菌根真菌研究方法的發(fā)展歷程，結(jié)合鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性與高效性，將其研究方法主要分為2種，即經(jīng)典研究法和分子生物學(xué)方法.

3.1 經(jīng)典研究法

經(jīng)典的研究方法主要基于形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和生理學(xué)特征對(duì)蘭科菌根真菌進(jìn)行研究，該研究的前提是以獲得可培養(yǎng)的真菌.真菌的分離培養(yǎng)方法主要包括組織塊表面消毒分離法、單菌絲圈分離法、原生境種子誘捕法和實(shí)驗(yàn)室播種誘捕法等.早期蘭科菌根信息均是運(yùn)用此類方式獲得，該方法使基本的真菌鑒定、蘭科種子共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)成為可能.

（1）組織塊表面消毒分離法.利用流動(dòng)水將蘭科植物組織表面沖洗干凈后，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗組織塊表面的消毒劑后，將其切成小段接種在培養(yǎng)基中培養(yǎng).在適宜的培養(yǎng)條件下，及時(shí)觀察分離純化菌根真菌.該方法操作簡便，且不需要大型儀器，但存在菌根真菌的分離率低或鑒定不準(zhǔn)確的現(xiàn)象.

（2）單菌絲圈分離法.用解剖針從表面消毒后的組織塊細(xì)胞中分離菌絲團(tuán)，在體式鏡下挑取單個(gè)菌絲團(tuán)接種到培養(yǎng)基中，在合適的條件下培養(yǎng)，并及時(shí)觀察純化菌根真菌.該方法使蘭科菌根真菌的分離率大大提高，但是實(shí)驗(yàn)操作有一定難度，不易分離出菌絲圈，且部分菌根真菌的菌絲圈在培養(yǎng)基上生長活力減弱，不易存活.

（3）原生境種子誘捕法.將蘭科植物種子套袋后放置于原生環(huán)境中進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，從已萌發(fā)的原球莖中分離菌根真菌.該方法有利于定向分離得到促種子萌發(fā)的真菌.

（4）實(shí)驗(yàn)室播種誘捕法.取原生環(huán)境中土壤、枯枝落葉等基質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，以獲得原生環(huán)境中促種子萌發(fā)的真菌.該方法有利于分離促萌發(fā)真菌，且打破蘭科種子共生萌發(fā)研究的時(shí)空限制[66].

經(jīng)典的研究方法對(duì)菌根真菌的分類、遺傳多樣性研究有一定的限制，因?yàn)樘m科菌根真菌種類復(fù)雜，形態(tài)學(xué)特征往往不明顯，在人工培養(yǎng)基上很難產(chǎn)生有重要鑒別特征的孢子，因此，該方法很難將菌根真菌鑒定到種水平，易造成鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確.此外，通過分離培養(yǎng)方法獲得的真菌種類和數(shù)量相當(dāng)有限，大量的菌根真菌可能未被分離培養(yǎng).但在實(shí)驗(yàn)室條件下，研究蘭科種子共生萌發(fā)、菌根真菌對(duì)蘭科植物生長發(fā)育的影響和蘭科植物保育工作需要可培養(yǎng)的菌根真菌資源.因此，通過經(jīng)典研究方法獲得可培養(yǎng)的菌根真菌具有一定的現(xiàn)實(shí)意義.如Zi等[67]利用原生境種子誘捕法，對(duì)西雙版納熱帶地區(qū)藥用附生蘭科植物兜唇石斛進(jìn)行了有效促萌發(fā)真菌的分離、鑒定，并在實(shí)驗(yàn)室條件下成功進(jìn)行離體共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn).

3.2 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法主要利用DNA測(cè)序技術(shù)來鑒定真菌種類，該方法對(duì)真菌的鑒定更加準(zhǔn)確和高效，故應(yīng)用廣泛；尤其是近幾年發(fā)展起來的高通量測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）在蘭科菌根研究中的應(yīng)用，極大地提高了人們對(duì)蘭科菌根真菌多樣性和豐富性的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)蘭科植物與菌根真菌之間專一性的理解.早期分子生物學(xué)技術(shù)在蘭科菌根真菌研究領(lǐng)域的應(yīng)用表現(xiàn)為，使用真菌通用引物或菌根真菌特異性引物，對(duì)蘭科植物根的DNA片段進(jìn)行直接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly?merase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和克隆測(cè)序[26，68]、單個(gè)菌絲圈PCR擴(kuò)增或利用末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal?restriction fragment length polymorphism，T?RFLP）技術(shù)[69]、變性/溫度梯度凝膠電泳（dena?tured/temperature gradient gel electrophoresis，DGGE/TGGE）技術(shù)[70]、DNA微列陣（芯片）技術(shù)[71]等分析蘭科植物根內(nèi)的菌根真菌組成.上述方法是經(jīng)典研究方法的補(bǔ)充，與經(jīng)典研究法相比，其所需樣品量少、耗時(shí)少、鑒定精準(zhǔn)且效率高.

NGS歷經(jīng)幾代測(cè)序平臺(tái)，如454測(cè)序平臺(tái)[58]、Meseq 測(cè)序平臺(tái)、Hiseq 測(cè)序平臺(tái) 101[72]和 Illumina MiSeq平臺(tái)[42]等，科研人員利用以上平臺(tái)研究蘭科植物菌根真菌的群落特征，探討蘭科植物的菌群區(qū)系如何隨時(shí)間、蘭科植物生命階段的變化而變化，較全面分析二者之間的專一性問題.rDNA片段NGS相對(duì)于早期分子生物學(xué)技術(shù)單位成本較低，在高度多樣化的微生物系統(tǒng)中，利用該技術(shù)所得序列豐度豐富，目前該技術(shù)廣泛應(yīng)用于蘭科植物定殖組織的真菌檢測(cè)和根際微生物檢測(cè)，鑒定準(zhǔn)確性得到大幅度提升.

4 作用機(jī)制

目前，有關(guān)蘭科植物的菌根共生機(jī)制尤其是蘭科植物對(duì)共生真菌專一性的識(shí)別機(jī)制少見報(bào)道[73-74].為了探究蘭科菌根相互作用的復(fù)雜性，科研人員已進(jìn)行了大量的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究，在一定程度上闡明了菌根真菌的作用[75-76]，但是蘭科菌根共生機(jī)制相比叢枝菌根、外生菌根共生機(jī)制研究較少，尤其是在分子生理學(xué)方面.

最新研究表明，菌根異養(yǎng)型蘭科植物與菌根真菌共生時(shí)，至少部分地?fù)碛兄参锱c叢枝菌根真菌共生的分子機(jī)制[73，77].Favre?Godal等[74]推測(cè)了菌根真菌與蘭科植物相互作用時(shí)的可能機(jī)制（圖1），包括：（1）蘭科植物會(huì)分泌植物信號(hào)分子，如獨(dú)腳金內(nèi)酯和類黃酮或其他次生代謝物；（2）蘭科菌根真菌會(huì)分泌菌根因子（mycorrhizal factors，Myc factors），如脂質(zhì)幾丁糖/短鏈幾丁質(zhì)寡聚物（COs/LCOs）或類似化合物來激活植物的共同共生基因（common symbi?osis genes，CSGs）；（3）真菌通過分泌小抑制劑蛋白等效應(yīng)物來逃避病原體相關(guān)分子模式（pathogen?as?sociated molecular patterns，PAMPs）引發(fā)的免疫反應(yīng)，從而逃避植物的防御機(jī)制；（4）蘭科植物分泌植物激素，幫助真菌定植或干擾植物產(chǎn)生防御激素等4個(gè)可能的級(jí)聯(lián)反應(yīng).此外，蘭科菌根真菌分泌多種可誘導(dǎo)植物免疫的細(xì)胞壁降解酶，幫助其在蘭科植物組織皮層細(xì)胞內(nèi)定殖[78].以上推測(cè)內(nèi)容為研究蘭科植物的菌根共生機(jī)制提供了思路與方向.

圖1 蘭科菌根形成過程中宿主植物與共生真菌相互作用時(shí)推測(cè)的作用機(jī)制示意[74]

5 問題與展望

蘭科是植物界分布最廣，物種多樣性最豐富的有花植物科之一，蘭科植物高度依賴菌根真菌來完成其生命周期，大量研究表明蘭科植物與菌根真菌之間存在一定的專一性.近年來，蘭科菌根真菌多樣性及專一性研究有了長足的進(jìn)展.然而，由于實(shí)驗(yàn)和分析的局限性，目前對(duì)蘭科植物與菌根真菌專一性的認(rèn)識(shí)可能還不完整，蘭科菌根真菌專一性還存在一系列問題有待深入研究，主要集中在以下3個(gè)方面：

（1）蘭科菌根真菌的多樣性是研究蘭科植物與菌根真菌之間專一性的基礎(chǔ)，只有獲得了更多種類的菌根真菌才能更加全面地分析二者之間的專一性關(guān)系.目前蘭科菌根真菌的發(fā)掘遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，由于蘭科植物種類龐大，絕大多數(shù)的蘭科植物尚未被研究，且已有研究缺乏一定的系統(tǒng)性.以我國藥用植物鐵皮石斛為例，目前其研究僅限于一定地區(qū)、某個(gè)居群、甚至幾株植物內(nèi)生真菌的純培養(yǎng)分離與分子分類等內(nèi)容，缺乏一定的系統(tǒng)性研究，如本實(shí)驗(yàn)室大多針對(duì)浙江金華市、云南景洪市等地區(qū)進(jìn)行鐵皮石斛的蘭科菌根真菌研究，而對(duì)我國其他非主產(chǎn)地區(qū)，如江西南昌市、安徽六安市和貴州駐興義市等地區(qū)的鐵皮石斛研究較為缺乏.今后應(yīng)加大力度建立同屬不同物種之間、同一物種不同地理分布（遠(yuǎn)距離與近距離）的居群之間、甚至野生種與栽培種之間、植物不同生長階段之間，同時(shí)兼顧不同取樣時(shí)間與取樣數(shù)量的菌根真菌的分離鑒定與分子分類，旨在全面為蘭科植物與菌根真菌的相互作用關(guān)系提供新論據(jù)，為分析二者之間的專一性提供更多數(shù)據(jù)，得出接近真實(shí)的結(jié)論.

（2）盡管大量文獻(xiàn)指出蘭科植物與菌根真菌之間存在專一性關(guān)系，但是二者之間相互作用的識(shí)別機(jī)制相比其他類型的菌根相互作用機(jī)制研究較少，尤其是在分子生理學(xué)方面.目前，蘭科菌根相互作用的分子機(jī)制研究大多局限于相關(guān)基因的表達(dá)及其功能預(yù)測(cè)方面.由于蘭科種子小，遺傳操作困難，國內(nèi)外尚未建立起蘭科菌根共生的遺傳轉(zhuǎn)化體系，使得轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組的數(shù)據(jù)的深入挖掘和研究受到一定的限制.菌根真菌與蘭科植物共生過程的形態(tài)學(xué)研究表明，蘭科菌根共生建立的早期，同樣經(jīng)歷了二者的相互識(shí)別、接觸和真菌在特定部位侵入，繼而在胚或根皮層細(xì)胞內(nèi)形成菌絲圈，而后隨著發(fā)育進(jìn)程，菌絲圈消解.然而，有關(guān)每個(gè)過程的細(xì)節(jié)，如細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，信號(hào)分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、菌絲圈的形成和消解過程與機(jī)制等，都鮮有研究.因此，蘭科菌根真菌的特性、共生遺傳轉(zhuǎn)化體系、蘭科菌根共生機(jī)制與其他菌根的異同，以及蘭科菌根的作用機(jī)制將是今后的研究重點(diǎn).

（3）利用蘭科植物與菌根真菌二者之間專一性關(guān)系，加強(qiáng)菌根真菌對(duì)蘭科植物資源保護(hù)及利用.蘭科植物種數(shù)雖多，但也是受威脅最嚴(yán)重的物種之一.一方面由于其復(fù)雜的生活史，蘭科植物很容易受到棲息地破壞和氣候變化的嚴(yán)重影響；另一方面不可持續(xù)的采集（通常是非法和無證許可的）帶來的威脅，這對(duì)一些是園藝、食品或藥品的原材料的蘭科植物種群來說是一個(gè)額外的風(fēng)險(xiǎn).為了更有效地保護(hù)蘭科植物，菌根真菌的作用對(duì)蘭科植物種群的生存延續(xù)至關(guān)重要，如果根據(jù)專一性研究結(jié)果，在最佳時(shí)期提供相應(yīng)的菌肥，增加其成活率，或增加一些藥用蘭科植物的藥用活性成分等，對(duì)于蘭科植物的保育和栽培、瀕危蘭科植物種群資源的保護(hù)和恢復(fù)有極大貢獻(xiàn).