藏紅花素對人宮頸癌Hela細(xì)胞順鉑耐藥性的影響

李 萍，姬白嫣，魏 娟，杜小敬，黃 鳳

（邯鄲市第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 邯鄲 056000）

宮頸癌是發(fā)病率和致死率均較高的婦科惡性腫瘤，雖然手術(shù)和放射治療、化學(xué)治療技術(shù)都取得了很大進(jìn)步，但中晚期宮頸癌患者5 a生存率仍不足50%［1］。腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥所致化學(xué)治療敏感性降低是導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要因素之一［2-3］，因此，給予化學(xué)治療耐藥逆轉(zhuǎn)劑可能是延長宮頸癌患者生存期的有效手段。藏紅花屬鳶尾科番紅花屬草本植物，為我國傳統(tǒng)中藥品種，具有活血化瘀、涼血解毒之功效。藏紅花主要活性成分藏紅花素具有較為廣譜的抗腫瘤活性，對白血病、結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌等均具有抑制作用［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素能夠提高人肺腺癌A549細(xì)胞［5］、人胃癌BGC-823細(xì)胞［6］對順鉑治療的敏感性。本研究以耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞為受試細(xì)胞，探討藏紅花素對人宮頸癌Hela細(xì)胞順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及相關(guān)機(jī)制，旨在為臨床改善宮頸癌順鉑治療的耐藥性提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞耐順鉑人宮頸癌細(xì)胞系Hela／DDP購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)細(xì)胞所細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器藏紅花素購自美國Sigma公司，注射用順鉑購自山東齊魯制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字H20073652），達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶、胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自南京立喬生物科技有限公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京恩晶生物有限公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自美國Sigma-Aldrich公司，激活型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）抗體、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；INC153型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Memmert公司，3550UV型酶標(biāo)儀、Mini-PROTEAN3型電泳槽、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，CyFlow Counter型流式細(xì)胞儀購自德國Partec公司，TE22型轉(zhuǎn)膜儀購自美國Hoefer公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，以2.5 g·L－1胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107L－1后接種于6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)75%時隨機(jī)分為空白對照組、藏紅花素組、順鉑組及聯(lián)合組。空白對照組細(xì)胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，藏紅花素組細(xì)胞用含終質(zhì)量濃度400 mg·L－1藏紅花素的培養(yǎng)基培養(yǎng)［7］，順鉑組細(xì)胞用含終質(zhì)量濃度5 mg·L－1順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)［8］，聯(lián)合組細(xì)胞用含終質(zhì)量濃度400 mg·L－1藏紅花素和5 mg·L－1順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后行各指標(biāo)檢測。

1.3.2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率藥物干預(yù)48 h后，取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度值，并計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率＝（空白對照組吸光度值－實驗組吸光度值）／空白對照組吸光度值×100%。每組細(xì)胞設(shè)10個復(fù)孔，取均值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況取藥物干預(yù)48 h后各組對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后接種于6孔板，每孔5×105個細(xì)胞，每孔加入5μL FITC和5μL PI染液后輕輕混勻，4℃避光孵育10 min后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡狀況并計算凋亡率（流式細(xì)胞圖的左下象限為正常細(xì)胞、左上象限為壞死細(xì)胞、右上象限為晚期凋亡細(xì)胞、右下象限為早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為右上象限和右下象限的百分率之和）。每組細(xì)胞設(shè)10個復(fù)孔，取均值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期分布情況取藥物干預(yù)48 h后各組對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿，每皿5×106個細(xì)胞，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，于－20℃下固定1 h，1 500 r·min－1離心10 min（離心半徑15 cm）取細(xì)胞，PBS沖洗2次后加入10μL RNA水解酶Rnase，37℃放置1 h，加入PI染液避光孵育0.5 h，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.3.5 Western blot法檢測各組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、cyclin D1、CDK2蛋白表達(dá)取藥物干預(yù)48 h后各組對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗滌后超聲破碎細(xì)胞，4℃12 000 r·min－1離心20 min后取沉淀，采用二辛可寧酸法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，水浴高溫變性，然后應(yīng)用Western blot法進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測：通過電泳槽行凝膠電泳，通過轉(zhuǎn)膜槽將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，麗春紅染色，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加稀釋的兔抗人一抗cleaved caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、cyclin D1（1∶1 000）、CDK2（1∶1 000）后4℃孵育12 h，PBS洗膜后滴加稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，DAB顯色后應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。以待測蛋白條帶灰度值與β-肌動蛋白（β-actin）內(nèi)參條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)10次，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞增殖抑制率比較空白對照組、藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組Hela／DDP細(xì)胞增殖抑制率分別為（0.00±0.00）%、（31.12±3.99）%、（34.96±4.30）%、（39.85±5.47）%。藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝24.664、25.710、23.038，P＜0.01）。藏紅花素組細(xì)胞增殖抑制率與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.070，P＞0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率高于順鉑組和藏紅花素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.222、4.077，P＜0.05）。

2.2 4組細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖1?？瞻讓φ战M、藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率分別為（5.12±0.79）%、（19.28±2.46）%、（20.63±2.68）%、（33.92±3.89）%。藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝15.984、17.554、22.944，P＜0.01）。藏紅花素組與順鉑組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.043，P＞0.05）。聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于順鉑組和藏紅花素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝8.897、10.059，P＜0.01）。

圖1 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis of cisplatin-resistant human cervical cancer Hela／DDP cells in the four groups

2.3 4組細(xì)胞周期分布比較結(jié)果見表1。與空白對照組比較，藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組G0／G1期細(xì)胞比例顯著升高，G2／M期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。藏紅花素組與順鉑組G0／G1、G2／M期細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與藏紅花素組和順鉑組比較，聯(lián)合組G0／G1期細(xì)胞比例顯著升高，G2／M期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。空白對照組、藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組S期細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4組耐順鉑人宮頸癌細(xì)胞Hela／DDP細(xì)胞周期分布比較Tab.1 Comparison of cell cycle distribution of cisplatinresistant human cervical cancer Hela／DDP cells among the four groups（±s）

表1 4組耐順鉑人宮頸癌細(xì)胞Hela／DDP細(xì)胞周期分布比較Tab.1 Comparison of cell cycle distribution of cisplatinresistant human cervical cancer Hela／DDP cells among the four groups（±s）

注：與空白對照組比較a P＜0.01；與藏紅花素組比較b P＜0.05；與順鉑組比較c P＜0.05。

組別n G0／G1期／%S期／%G2／M期／%空白對照組10 22.02±3.58 33.79±3.69 44.19±5.34藏紅花素組10 36.40±4.17a 34.62±3.76 28.98±4.22a順鉑組10 39.35±4.23a 36.32±3.98 24.33±4.62a聯(lián)合組10 44.01±4.70abc 37.76±4.43 18.23±4.88ab F 51.243 2.567 53.779 P 0.000 0.071 0.000 c

2.4 4組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量及Bax／Bcl-2值比較結(jié)果見表2和圖2。藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量及Bax／Bcl-2值均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。藏紅花素組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量及Bax／Bcl-2值與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量和Bax／Bcl-2值高于順鉑組和藏紅花素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高于藏紅花素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量及Bax／Bcl-2值比較Tab.2 Comparison of relative expression of cleaved caspase-3，Bcl-2，Bax protein and the ratio of Bax／Bcl-2 in cisplatinresistant human cervical cancer Hela／DDP cells among the four groups（±s）

表2 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量及Bax／Bcl-2值比較Tab.2 Comparison of relative expression of cleaved caspase-3，Bcl-2，Bax protein and the ratio of Bax／Bcl-2 in cisplatinresistant human cervical cancer Hela／DDP cells among the four groups（±s）

注：與空白對照組比較a P＜0.05；與藏紅花素組比較b P＜0.05；與順鉑組比較c P＜0.05。

組別n cleaved caspase-3 Bax Bcl-2 Bax／Bcl-2空白對照組10 0.09±0.03 0.19±0.04 0.26±0.06 0.73±0.14藏紅花素組10 0.24±0.06a 0.34±0.07a 0.32±0.06a 1.11±0.23a順鉑組10 0.28±0.07a 0.41±0.10a 0.35±0.08a 1.19±0.30a聯(lián)合組10 0.36±0.09abc 0.74±0.16abc 0.41±0.11ab 1.79±0.38abc F 29.314 42.053 6.070 25.072 P 0.000 0.000 0.002 0.000

圖2 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of cleaved caspase-3，Bcl-2，Bax protein of cisplatin-resistant human cervical cancer Hela／DDP cells in the four groups

2.5 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見表3和圖3。與空白對照組比較，藏紅花素組、順鉑組、聯(lián)合組Hela／DDP細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。順鉑組細(xì)胞中cyclin D1蛋白相對表達(dá)量顯著低于藏紅花素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；藏紅花素組細(xì)胞中CDK2蛋白相對表達(dá)量與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合組細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量顯著低于藏紅花素組和順鉑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of relative expression of cyclin D1，CDK2 protein in cisplatin-resistant human cervical cancer Hela／DDP cells among the four groups（±s）

表3 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of relative expression of cyclin D1，CDK2 protein in cisplatin-resistant human cervical cancer Hela／DDP cells among the four groups（±s）

注：與空白對照組比較a P＜0.01；與藏紅花素組比較b P＜0.01；與順鉑組比較c P＜0.01。

組別n cyclin D1 CDK2空白對照組10 0.95±0.21 0.51±0.12藏紅花素組10 0.65±0.14a 0.35±0.09a順鉑組10 0.43±0.07ab 0.32±0.07a聯(lián)合組10 0.28±0.06abc 0.14±0.04abc F 46.958 31.724 P 0.000 0.000

圖3 4組耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of cyclin D1，CDK2 protein in cisplatinresistant human cervical cancer Hela／DDP cells in the four groups

3 討論

目前，臨床上治療宮頸癌主要采取手術(shù)結(jié)合放射治療、化學(xué)治療的綜合方案，該方案能夠明顯改善患者生活質(zhì)量并延長生存期，早期未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶的患者5 a生存率可達(dá)80%［9］；ⅡB、ⅢA、ⅢB期患者5 a生存率分別為58%、35%、32%，Ⅳ期患者5 a生存率僅為16%［10］。我國每年約3萬例患者死于宮頸癌［11］。順鉑被認(rèn)為是治療宮頸癌最有效的單藥化學(xué)治療藥物［12］，但獲得性耐藥嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用，因此，尋找能夠逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的藥物對宮頸癌的治療至關(guān)重要。

藏紅花素是傳統(tǒng)中藥藏紅花的主要活性成分，隨著藥理學(xué)研究的深入，其抗腫瘤活性得到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素能夠通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對人肺腺癌A549細(xì)胞、人胃癌BGC-823細(xì)胞［6］的順鉑耐藥性起到逆轉(zhuǎn)作用。本研究結(jié)果顯示，與順鉑單獨用藥比較，藏紅花素與順鉑聯(lián)合給藥能夠更加顯著地提高耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率、阻滯細(xì)胞周期于G0／G1期，提示藏紅花素具有逆轉(zhuǎn)人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞對順鉑耐藥性的作用。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是順鉑抗腫瘤最主要的作用機(jī)制之一［13］，該過程有多種基因、蛋白參與調(diào)控，cleaved caspase-3參與細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行，是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的調(diào)控蛋白［14］。Bcl-2家族基因?qū)?xì)胞凋亡線粒體通路信號傳導(dǎo)發(fā)揮著關(guān)鍵作用［15］，其中Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放、激活caspase-3而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2能夠抑制Ca2＋內(nèi)流超載、保護(hù)線粒體膜通透性、抑制cleaved caspase-3活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡［16］；Bcl-2和Bax能夠形成異源二聚體而抑制細(xì)胞凋亡，Bax蛋白之間則能夠形成同源二聚體而促進(jìn)凋亡［17］，因此，Bax／Bcl-2比值更能反映二者對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，與順鉑單獨用藥比較，藏紅花素與順鉑聯(lián)合給藥能夠顯著提高耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量，降低Bcl-2蛋白相對表達(dá)量，并提高Bax／Bcl-2值；與空白對照組比較，藏紅花素單藥干預(yù)能夠顯著提高Hela／DPR細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量，降低Bcl-2蛋白相對表達(dá)量并提高Bax／Bcl-2值，這可能是藏紅花素逆轉(zhuǎn)人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的重要分子機(jī)制。

抑制細(xì)胞增殖是順鉑抗腫瘤另一重要機(jī)制，而細(xì)胞增殖依賴正常的細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)。細(xì)胞周期過程由多種基因參與調(diào)控，其中cyclin D1和CDK2發(fā)揮著重要調(diào)控作用，二者均具有促使細(xì)胞周期通過G0／G1期限制點進(jìn)入S期的作用［18］。本研究結(jié)果顯示，與順鉑單獨用藥比較，藏紅花素與順鉑聯(lián)合給藥能夠顯著降低耐順鉑人宮頸癌Hela／DDP細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量；與空白對照組比較，藏紅花素單獨用藥能夠顯著降低Hela／DPR細(xì)胞中cyclin D1、CDK2蛋白相對表達(dá)量，這可能是藏紅花素抑制Hela／DDP細(xì)胞增殖的重要機(jī)制，也是逆轉(zhuǎn)人宮頸癌Hela細(xì)胞順鉑耐藥性的另一重要分子機(jī)制。

綜上所述，藏紅花素能夠逆轉(zhuǎn)人宮頸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Hela／DDP細(xì)胞凋亡、阻滯Hela／DDP細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)。