降解草酸鹽乳酸菌株的篩選及其酸乳發(fā)酵特性

劉建利，何 旭，孫欽飛

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021）

食源性草酸在腸道的吸收和分解與高草酸尿癥導(dǎo)致的草酸鈣腎結(jié)石有密切關(guān)系[1?2]，雖然理論上可以通過控制食源草酸的攝入來減少腸道對草酸的吸收，進而降低尿液中草酸的濃度，但許多常見的食物均含草酸，導(dǎo)致控制草酸攝入量這一途徑難以實現(xiàn)。因此，加強腸道微生物對草酸的分解，是預(yù)防草酸鈣結(jié)石較為理想的方法[3?4]。

對于草酸鹽降解菌，目前研究最深入的是食草酸桿菌（Oxalobacter formigenes），該菌能以草酸鹽作為其生長代謝的唯一或主要碳源，降解草酸效果顯著[5?7]。但草酸桿菌不能很好地適應(yīng)胃腸道環(huán)境，并且其生長必須有高濃度草酸，致使其胃腸道長期定植的難度大大增加。因此，只能在高草酸尿癥治療中使用[5,8]。

近年來，有研究表明乳酸菌能分解草酸鹽作為碳源，但其生長不依賴草酸鹽濃度，不以草酸鹽作為唯一可利用碳源，是典型的兼性草酸營養(yǎng)型細菌，再加之乳酸菌在腸道內(nèi)定植方面的天然優(yōu)勢，使其在預(yù)防高草酸尿癥方面具有獨特的優(yōu)勢[9?10]。已報道的能降解草酸鹽的乳酸菌包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）等[10?11]。通過酸乳攝入能定植于人體胃腸道的高效降解草酸鹽乳酸菌是一種預(yù)防草酸鈣腎結(jié)石的新途徑，以往的研究只關(guān)注乳酸菌的草酸鹽降解性能，鮮有涉及高效降解草酸鹽菌株的酸乳發(fā)酵性能。因此，將這些高效降解草酸鹽菌株應(yīng)用于酸乳發(fā)酵，需要明確其酸乳發(fā)酵特性。

本實驗通過檢測從牧區(qū)自制酸奶、家庭自制泡菜、酵頭等特色發(fā)酵食品分離的乳酸菌降解草酸鹽能力、體外胃腸道耐受能力、發(fā)酵酸乳能力，以期獲得既能高效降解草酸鹽，又能耐受胃腸道環(huán)境，同時在酸乳中發(fā)酵特性優(yōu)良菌株，為功能酸乳奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

49 株乳酸菌（見表1） 北方民族大學(xué)生物科學(xué)實驗示范中心保存；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus1805） 寧夏夏進乳業(yè)股份有限公司；胃蛋白酶（500 U/mg）、牛膽鹽 Biotopped 公司；胰蛋白酶（250 U/mg） 北京拜耳迪生物公司；酵母提取物 英國Oxoid 公司；牛肉浸粉 青島海博生物技術(shù)有限公司；純牛奶 伊利利樂枕純牛奶；葡萄糖、草酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、酸氫二鉀、無水乙酸鈉、檸檬酸二銨、硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸錳、吐溫80 天津市大茂化學(xué)試劑廠；酸溶液參考鮑雅靜等[12]、膽鹽溶液等參考張麗[13]、人工模擬胃液參考楊續(xù)金[14]、人工模擬腸液參考張磊[15]和王立平[16]文獻配制；草酸鹽培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基[16]經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，待溫度冷卻到約60 ℃時，在500 mL MRS 培養(yǎng)基中加入500 mL 使用0.22 μm濾膜過濾的20 mmol/L 草酸鈉溶液，使其最終濃度為10 mmol/L。

表1 菌株編號及來源Table 1 Name and source of strains

SC-30 型恒溫水浴鍋 上海漢諾有限公司；UV765 型分光光度計 上海精科有限公司；TMSPRO 質(zhì)構(gòu)儀 配有不同規(guī)格的圓柱探頭P/75，美國FTC 公司；UV-5500 紫外分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效降解草酸鹽菌株的篩選

1.2.1.1 草酸鹽標準曲線的制備 以草酸能催化鉻酸鉀氧化甲基紅的原理，用分光光度法測量草酸鹽濃度[17?18]。取7 個10 mL 的容量瓶分別加入0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 mL 用1 mmol/L 草酸鈉儲備液稀釋成為50 mol/L 草酸鈉工作液，用蒸餾水定容到刻度后加入2.0 mL 0.4 mol/L 鹽酸，2.0 mL 0.1 mmol/L甲基紅溶液，4 mL 1.0 mmol/L 鉻酸鉀溶液，搖勻反應(yīng)15 min，加入1 mL 1.0 mmol/L Zr（IV）搖勻終止反應(yīng)。以蒸餾水做參比在515 nm 處測其硫酸鈣吸光度值。以草酸鈉濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，在Excel 中繪制標準曲線，回歸方程y=?0.0189x+0.7701，決定系數(shù)R2=0.9912。

1.2.1.2 回收率實驗 參考金朝霞[19]、董婷婷[20]的方法，取5 mL 含10 mmol/L 草酸鈉的MRS 培養(yǎng)基，37 ℃ 100 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，取1.5 mL 培養(yǎng)培養(yǎng)液，2500 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液于10 mL的刻度試管中，加5 mL 蒸餾水，用少量0.25 mol/L NaOH 或者0.1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 至中性，蒸餾水定容至10 mL 再進行50 倍稀釋，取10 mL稀釋液于離心管中，加2.0 mL 飽和硫酸鈣和20 mL 95%乙醇混勻。室溫加蓋靜置3 h，2500 r/min 離心10 min，倒出上清液，沉淀即為草酸鹽待測物。同標曲的方法，加入2.0 mL 0.4 mol/L 鹽酸后做相同處理，以蒸餾水做參比在515 nm 處測吸光度值，代入標曲中計算獲得檢測液中草酸鈉的濃度。

培養(yǎng)基中草酸鈉濃度（mmol/L）=檢測液中草酸鈉濃度（μmol/L）×500/1000

式中：500 表示培養(yǎng)液到測定液的稀釋倍數(shù)。

回收率（%）=對照培養(yǎng)基中草酸鈉濃度×100/10

式中：10 表示培養(yǎng)基配制時加入的草酸鈉濃度10 mmol/L。

1.2.1.3 菌株降解草酸鹽能力測定 將保存在?80 ℃的乳酸菌菌種在常溫中融化后，按接種量為2%的比例接種于5 mL MRS 培養(yǎng)基中、37 ℃100 r/min 搖床培養(yǎng)18～24 h 進行活化。取0.2 mL 活化菌液接種于5 mL 含10 mmol/L 草酸鈉的MRS 培養(yǎng)基，37 ℃100 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。以不接種乳酸菌，同樣培養(yǎng)的空白草酸鈉培養(yǎng)基為對照。當方法回收率在90%～110%時，測定試驗菌株培養(yǎng)液和對照培養(yǎng)液的草酸鈉濃度，計算各菌株草酸鈉降解率。

降解率（%）=（1?菌株培養(yǎng)液草酸鈉濃度/對照培養(yǎng)液草酸鈉濃度）×100

1.2.2 菌株體外腸胃道耐受性測定 參考孫敏等[21]、趙瑞香等[22]、柏建玲等[23]和朱宏等[24]方法，稍作改動。將活化后的菌株按2%的比例接種于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃100 r/min 搖床培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液2 mL，12000 r/min 離心2 min 收集菌體，在超凈工作臺中倒掉上清液并加2 mL 滅菌生理鹽水進行重懸；吸取菌懸液0.5 mL 分別加入到4.5 mL pH3.0 鹽酸溶液、人工模擬胃液、膽鹽溶液、人工模擬腸液和滅菌生理鹽水中，37 ℃100 r/min 搖床培養(yǎng)4 h，取500 μL 上述處理液到5 mL 的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃100 r/min 搖床培養(yǎng)8 h 后，在600 nm處測吸光度值，用以下公式計算菌株存活率，以保加利亞乳桿菌為對照（CK）。

存活率（%）=(B/A)×100

式中：A 表示生理鹽水中培養(yǎng)吸光度值；B 表示各處理液中培養(yǎng)吸光度值。

1.2.3 菌株酸乳發(fā)酵特性評價

1.2.3.1 菌懸液的制備 將篩選出的乳酸菌按2%的比例接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 100 r/min搖床培養(yǎng)24 h，12000 r/min 離心2 min 收集菌體并調(diào)整菌懸液波長600 nm 出的吸光度值為2.5，用無菌蒸餾水清洗3 遍。

1.2.3.2 菌株發(fā)酵酸乳 參考袁鳳霞等[25]方法，在純牛奶中按15%的比例加入白砂糖，攪拌溶解后，在高壓滅菌鍋中95 ℃、120 Pa 滅菌5 min。準確量4 mL菌懸液加到滅菌的牛奶混合液中搖勻。在培養(yǎng)箱中40 ℃發(fā)酵8～12 h。以保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸乳為對照（CK）。

1.2.3.3 酸乳品質(zhì)感官評價 參照生慶海等[26]制作的感官評價表，隨機選10 名16 級食品科學(xué)與工程班的學(xué)生對4 ℃冷藏12 h 后熟的酸乳，按感官評價標準從氣味、質(zhì)地、口感三個方面進行評價，計算平均值（表2）。

表2 酸乳感官評定標準表Table 2 Sensory evaluation standard of yoghourt

1.2.3.4 酸乳質(zhì)構(gòu)特性的測定 參考楊瑩瑩等[27]、徐鑫等[28]方法，選擇TMS-75 mm 型號的測試探頭測量酸乳的破裂力、硬度、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性和彈性等質(zhì)構(gòu)指標。條件如下：最小觸發(fā)力設(shè)置為0.3 N、采樣速度10 Hz、兩次壓縮停留間隔為0 s、測前和測后速率為30 mm/min。

1.2.3.5 酸乳持水力測定 參考孫敏等[21]、袁鳳霞等[25]方法，準確稱取發(fā)酵后的酸乳15 g，4500 r/min離心10 min 后稱取上清液的質(zhì)量，并記錄數(shù)據(jù)。持水力的計算公式如下所示：

式中：X 表示持水力，%；A 表示樣品質(zhì)量，g；B 表示上清液質(zhì)量，g。

1.2.3.6 酸乳滴定酸度和后酸度測定 參考孫敏等[21]、袁鳳霞等[25]方法，取5 g 4 ℃貯存0、3、6 d的酸乳、40 mL 冷卻煮沸水和5 滴5 g/L 酚酞酒精溶液，于三角瓶搖勻后，用已標定的NaOH 標準溶液滴定到微紅色，且顏色在 30 s 內(nèi)不消失即為滴定終點，記錄消耗的 NaOH 標準溶液所用的毫升數(shù)。后酸度為第6 和第0 d 的酸度差。

1.2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定 參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書；PCR 擴增16S rDNA，50 μL PCR 反應(yīng)體系：25 μL 10×PCR Mix、1 μL 10 μmol/L的上下游引物（27F/1492R[29]）、1 μL 模板DNA、22 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序為：預(yù)變性94 ℃ 10 min；變性94 ℃ 1 min；退火56 ℃ 1 min；延伸72 ℃ 1 min；30 個循環(huán)；后延伸72 ℃ 10 min，由南京金斯瑞生物公司進行測序。將測序序列在EZBioCloud 數(shù)據(jù)庫中比對鑒定。分別以Weissella halotolerans（AB022926.1）和Lactobacillus bifermentans（M58809.1）16S rDNA序列為外群，利用MrBayes3.2.5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)3 次，用Excel 作圖，SPSS 21 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

主成分分析法（PCA）評價[30]：采用SPSS21 軟件將發(fā)酵酸乳品質(zhì)指標進行主成分分析，取累計貢獻率不低于85%且特征值大于1.00 的因子作為主成分。利用主成分對發(fā)酵酸乳進行綜合評價，并將各主成分得分Fi 乘以相應(yīng)權(quán)重后求和，就能得到綜合評價函數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效降解草酸鹽菌株篩選

49 株供試乳酸菌菌株表現(xiàn)出不同降解的效果，有7 株乳酸菌的培養(yǎng)基中草酸的降解率小于0，占總數(shù)的14.3%，在培養(yǎng)的過程中不僅沒有降解草酸鈉，甚至出現(xiàn)草酸鹽含量增長的現(xiàn)象；23 株菌降解率0%～30%，占總數(shù)46.94%；降解率31%～69%的菌有10 株，占20.41%；只有菌株“天水A1”、“四川郫縣A1”、“駝奶9”、“魯青6”、“鄂溫克”、“拉絲酸奶1”、“山南酸奶1”、“魯濟19”、“云南昆明A”等9 株菌的降解率在70%以上，占18.36%（圖1），9 株菌中降解率最高的是菌株“拉絲酸奶1”，達86.96%（圖2）。

圖1 菌株草酸鹽降解率Fig.1 Oxalate-degradation rate of strains

圖2 降解率高于70%菌株Fig.2 Strains with oxalate-degradation rate more than 70%

2.2 菌株體外腸胃道耐受性

測定草酸鹽降解率高于70%的9 株菌體外胃腸道耐受性，結(jié)果如圖3，在pH3.0 的酸溶液中，9 株高降解菌的存活率在31%～67%之間，其中最高的菌株是“魯青6”存活率為66.36%；在人工模擬胃液中，9 株菌的存活率在32%～61%之間，最高為菌株“魯青6”，達60.13%；在膽鹽溶液中，9 株菌的存活率在35%～73%之間，最高是菌株“拉絲酸奶1”，達72.19%；在人工模擬腸液中，各菌株的存活率均在69%～155%之間，菌株“魯青6”、“鄂溫克”的存活率在100%以上，分別為116.12%和153.26%。選取在各個溶液中的存活率耐受性均高于50%的3 株菌株“四川郫縣A1”、“鄂溫克”、“魯青6”作為在胃腸道耐受性較好菌株。

圖3 高效降解草酸鹽菌株模擬胃腸道耐受性結(jié)果Fig.3 Result of tolerance of strains with high efficient degradation oxalate in artificial simulated gastrointestinal tract environment

2.3 發(fā)酵酸乳特性評價

2.3.1 發(fā)酵酸乳品質(zhì)感官評價 感官評價是發(fā)酵酸乳風味測評的一個重要手段，將體外胃腸道耐受性實驗中篩選出的3 株菌以及對照菌用于制作酸乳，在后熟之后對酸乳的質(zhì)地、氣味以及口感三個方面進行評價。結(jié)果如表3，氣味指標得分最高的是菌株對照保加利亞乳桿菌、菌株“四川郫縣A1”和菌株“鄂溫克”菌株發(fā)酵酸乳；質(zhì)地和口感得分最高的是對照保加利亞乳桿菌、菌株“魯青6”和菌株“鄂溫克”菌株發(fā)酵酸乳；總計得分最高的是對照保加利亞乳桿菌和菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳，最低的是菌株“四川郫縣A1”發(fā)酵酸乳。

表3 各菌株發(fā)酵酸乳感官評價結(jié)果（分）Table 3 Sensory evaluation scores of yoghourts fermented with different strains (scores)

2.3.2 發(fā)酵酸乳持水力 酸乳持水力是指經(jīng)過高速離心后，酸乳凝膠體系中總固形物對水分的保持能力，在酸乳持水力越高，說明大分子物質(zhì)對水分子的作用力越強，穩(wěn)定性也越好。各菌株發(fā)酵的酸乳的持水力在45%～75%之間（圖4），其中持水力最大的是菌株“鄂溫克”發(fā)酵酸乳，達到了75.61%，菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳次之，持水力最小的是菌株“四川郫縣A1”的為47.73%。

圖4 菌株發(fā)酵酸乳持水力Fig.4 Holding water capacity of yoghourt fermented with different strains

2.3.3 發(fā)酵酸乳酸度和后酸度 酸度是影響發(fā)酵酸乳口感的重要因素之一，后酸度對發(fā)酵酸乳貯藏期間的風味和貯藏時間有直接影響[31]。表4 可知，菌株“鄂溫克”發(fā)酵酸乳的酸度最高，但保存6 d 后后酸度卻最大，后酸度最小的是菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳，為10.66°T，其酸度也適宜。從發(fā)酵酸乳酸度和后酸度方面比較，菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳較好。

表4 菌株發(fā)酵酸乳酸度和后酸度（°T）Table 4 Titratable acidity and post-acidity of yoghourt fermented with different strains (°T)

2.3.4 發(fā)酵酸乳質(zhì)構(gòu)特性 質(zhì)地是評價酸乳感官質(zhì)量的重要指標之一，質(zhì)構(gòu)儀是一種測定食品質(zhì)地的現(xiàn)代化精密儀器，可模擬人體口腔再以具體的數(shù)據(jù)客觀地測評發(fā)酵酸乳質(zhì)地，使分析的結(jié)果更準確。如圖5、圖6，4 株菌發(fā)酵酸乳的破裂力、咀嚼性、彈性以菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳的最高，硬度以菌株“鄂溫克”發(fā)酵酸乳的最大，膠粘性和內(nèi)聚力以菌株“鄂溫克”和菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳最高。因此，菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳大多數(shù)質(zhì)構(gòu)指標較優(yōu)。

圖5 菌株發(fā)酵酸乳的破裂力、硬度、膠黏性、內(nèi)聚力、咀嚼性Fig.5 Rupture force,hardness,gumminess,cohesiveness and chewiness of yoghourt fermented with different strains

圖6 高效降解菌株發(fā)酵酸乳彈性Fig.6 Springiness of yoghourt fermented with different strains

2.3.5 主成分分析法綜合評價發(fā)酵酸乳品質(zhì) 對酸乳的酸度、后酸度、持水力以及各質(zhì)構(gòu)指標進行主成分分析，根據(jù)特征值大于1、積累貢獻率大于85%為標準能提取出兩個主成分，如表5，這兩個主成分的累計貢獻率達到了85.538%，說明用這兩個主成分能夠反應(yīng)原有變量的大多數(shù)數(shù)據(jù)的信息，其中，第一主成分的貢獻率為63.224%，特征值為5.690；第二主成分的貢獻率為22.314%，特征值為2.008。

表5 總方差分解結(jié)果Table 5 Total variance explained

主成分旋轉(zhuǎn)矩陣（表6），第一主成分里的高載荷指標有破裂力X4（因子載荷值為0.797）、內(nèi)聚力X7（因子載荷值為0.882）、咀嚼性X8（因子載荷值為0.892）、彈性X9（因子載荷值為0.909）；第二主成分包含的高載荷指標有酸度X1（因子載荷值為0.923）、后酸度X2（因子載荷值為0.879）、持水力X3（因子載荷值為0.736）、硬度X5（因子載荷值為0.807）、膠粘性X6（因子載荷值為0.667）。

表6 主成分載荷矩陣Table 6 Principal component loading matrix of PCA

由表6 可得出各主成分的表達式：

通過以上2 個主成分可構(gòu)建出酸乳的綜合品質(zhì)評價模型F：

根據(jù)的綜合品質(zhì)評價模型可得各菌株發(fā)酵酸乳綜合得分，如表7，菌株“魯青6”和菌株“鄂溫克”發(fā)酵酸乳得分較高，表明菌株“鄂溫克”和菌株“魯青6”發(fā)酵酸乳品質(zhì)最好。

表7 高效降解菌株發(fā)酵酸乳的主成分得分和綜合得分Table 7 Principal component scores and comprehensive scores of yoghourt fermented efficient degradation strains

2.4 菌株分子鑒定

菌株“魯青6”和“鄂溫克”既能高效降解草酸鹽，又能耐受胃腸道，同時酸乳發(fā)酵特性優(yōu)良。提取菌株基因組 DNA，采用 PCR 擴增16S rDNA 序列，獲得約1500 bp 序列，測序后將序列在Ezbiocloud中比對，結(jié)果顯示菌株“魯青6”的16S rDNA 序列與Weissella cibariaKACC11862（Type）的 16S rDNA 序列（AEKT01000037）相似度高達100%，菌株“鄂溫克”的16S rDNA 序列與Lactobacillus paracaseisubsp.toleransJCM 1171（Type）的16S rDNA 序列（D16550）相似度高達100%，將序列和屬其他種的16S rDNA 用Bayes 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹上，顯示“魯青6”與食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）聚在一起（圖7），“鄂溫克”與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）聚在一起（圖8）。因此，菌株“魯青6”為食竇魏斯氏菌，菌株“鄂溫克”為副干酪乳桿菌。

圖7 基于16S rDNA 用Bayes 法構(gòu)建魏斯氏菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of the genera Weissella based on 16S rDNA sequences

圖8 基于16S rDNA 用 Bayes 法構(gòu)建乳桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of the genera Lactobacillus based on 16S rDNA sequences

3 結(jié)論與討論

不同生境、不同種屬的乳酸菌降解草酸鹽的能力不同。Weese 等[32]報道來自犬糞便樣品的37 株乳酸菌體外降解草酸鹽活性最高65%。Federici等[33]報道動物雙歧桿菌菌株（Bifidobacterium animalis）DSM10104 降解率為61%，而長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）菌株MB 282 和青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentic）菌株MB 238 的降解率分別為35%和57%，短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）菌株MB 283 的降解率為38%。本實驗49 株供試乳酸菌中，約38.77%降解率的菌株在30%以上，18.36%降解率的菌株在70%以上，降解率最高達86.96%。不僅具有降解能力的菌株比例高，部分菌株對培養(yǎng)基中的草酸鹽的降解率也高于報道，提示我們中國民間傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蘊藏著豐富而獨特的微生物資源，有待于進一步發(fā)掘。

本實驗獲得食竇魏斯氏菌菌株“魯青6”和副干酪乳桿菌菌株“鄂溫克”既能高效降解草酸鹽，又能耐受胃腸道，同時酸乳發(fā)酵特性優(yōu)良，但本實驗僅進行了菌株體外降解草酸鹽實驗，后續(xù)開展2 株菌體內(nèi)降解實驗和菌株安全性評價實驗取得較好結(jié)果后，2 株菌可作為功能酸乳開發(fā)候選發(fā)酵菌株。