不同地域烘焙咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)的檢測(cè)與評(píng)價(jià)

智美麗 徐學(xué)萬(wàn) 吳立濤 潘 華 黃維蘭 張 芳

（1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京100124；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081）

咖啡是茜草科咖啡屬常綠小喬木，原產(chǎn)地為非洲的埃塞俄比亞，其與茶葉、可可并稱為世界的3大飲料[1]。目前世界上主要咖啡產(chǎn)區(qū)均位于北緯25°和南緯30°之間的區(qū)域，這個(gè)適合種植咖啡樹的區(qū)域也被稱為“咖啡帶”。在咖啡的品質(zhì)評(píng)價(jià)中，酸度是評(píng)價(jià)咖啡飲品的重要指標(biāo)之一，影響咖啡酸度的主要物質(zhì)是來自咖啡豆烘焙過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)[2]。烘焙咖啡豆中含有咖啡酸、綠原酸、富馬酸、沒食子酸、琥珀酸、無(wú)水檸檬酸、L－蘋果酸、DL－酒石酸、D－（－）奎寧酸等30多種有機(jī)酸[3]，其中產(chǎn)生酸味的主要成分包括有無(wú)水檸檬酸和DL－酒石酸等[4]。蘋果酸產(chǎn)生的酸澀味，會(huì)讓人產(chǎn)生愉快的感覺[5]，而其他的有機(jī)酸則主要產(chǎn)生苦味[2]。D－（－）奎寧酸以游離形式或酯類形式存在于咖啡豆中，是用于合成流感藥物達(dá)菲的起始材料[6]?？Х人峋哂姓{(diào)血脂、抗氧化的作用[7]。綠原酸和葫蘆巴堿不僅是咖啡豆中含量較高的風(fēng)味物質(zhì)，還具有很多生物功效，例如抗菌[8]、抗氧化[9]、抗腫瘤[10]等功效。目前對(duì)咖啡豆的研究主要集中于加工方式對(duì)咖啡豆成分含量的影響[11～13]，咖啡豆中部分功效成分的檢測(cè)以及功能研究等[14～16]，而評(píng)價(jià)不同地域?qū)Х榷癸L(fēng)味物質(zhì)含量影響的研究報(bào)道則較少。咖啡種植的3大產(chǎn)區(qū)為中南美洲產(chǎn)區(qū)、非洲產(chǎn)區(qū)、亞洲及太平洋產(chǎn)區(qū)。我國(guó)種植咖啡豆的地區(qū)主要為云南省、海南省和臺(tái)灣省。為了進(jìn)一步探究不同地域?qū)Х榷癸L(fēng)味成分的影響，本研究選取市面上常見的進(jìn)口咖啡豆，產(chǎn)地為意大利、肯尼亞、巴西和巴拿馬，國(guó)產(chǎn)咖啡豆產(chǎn)地為我國(guó)云南省、海南省和臺(tái)灣省，共7個(gè)產(chǎn)區(qū)的深度烘焙咖啡豆為研究對(duì)象，采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC－MS）的方法檢測(cè)咖啡酸、綠原酸、富馬酸、沒食子酸、琥珀酸、無(wú)水檸檬酸、L－蘋果酸、DL－酒石酸、D－（－）奎寧酸和葫蘆巴堿這10種風(fēng)味物質(zhì)成分，并運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析的方法對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，明確不同地域的咖啡豆的品質(zhì)特征。

一、材料與方法

（一）材料與儀器咖啡酸（CAS：331－39－5，純度98%）， 綠原酸（CAS：327－97－9， 純度98%）， 富馬酸（CAS：110－17－8， 純度98%），沒食子酸（CAS：149－91－7，純度98%），琥珀酸（CAS：110－15－6，純度98%），無(wú)水檸檬酸（CAS：77－92－9， 純度98%），L－蘋果酸（CAS：97－67－6， 純度98%），DL－酒石酸（CAS：133－37－9， 純度98%），D－（－） 奎寧酸（CAS：77－95－2， 純度98%）， 葫蘆巴堿（CAS：535－83－1，純度98%）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、甲酸為色譜純，購(gòu)自福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；乙醇為分析純，購(gòu)自北京化工廠。Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo公司；Thermo Scientific Q Exactive四極桿－靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo公司；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7μm）色譜柱，美國(guó)Waters公司；離心機(jī)，Centrifuge 5430/5430R，德國(guó)Eppendorf公司。

樣品采集選用市面上常見產(chǎn)區(qū)的深度烘焙咖啡豆，品種為阿拉比卡種。進(jìn)口咖啡豆的產(chǎn)區(qū)選自意大利（歐洲）、肯尼亞（非洲）、巴西（南美洲）、巴拿馬（北美洲），國(guó)產(chǎn)咖啡豆產(chǎn)區(qū)選自我國(guó)云南省、海南省、臺(tái)灣省。對(duì)這7個(gè)產(chǎn)區(qū)進(jìn)行采樣，每個(gè)產(chǎn)區(qū)采集10份樣品，采樣規(guī)格1～2 kg，樣品采集后寄送到實(shí)驗(yàn)室，用磨粉機(jī)磨成細(xì)粉，過40目篩。

（二）咖啡豆中成分的提取方法咖啡豆中的有機(jī)酸與葫蘆巴堿的提取方法參照楊剴舟等[17]和SMRKE等[18]的研究成果，并加以改進(jìn)。精密稱取不同產(chǎn)地的深度烘焙咖啡粉末0.50 g（精確至0.001g），置于50 mL離心管中，加入30 mL50%乙醇，于室溫下超聲提取40 min，5 500 r/min離心5 min，取上清液于50 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取濾液用稀釋劑稀釋100倍，稀釋劑為添加0.1%甲酸的甲醇－水溶液（甲醇∶水＝1∶9，V/V），待測(cè)。

（三）咖啡豆中成分的檢測(cè)方法樣品提取液采用高效液相色譜－四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC－Q/Orbitrap HRMS）進(jìn)行測(cè)定，選用C18色譜柱（2.1×100 mm，1.7μm），每次進(jìn)樣5 L，甲醇+1%甲酸為流動(dòng)相A，水+1%甲酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫程序：0 min，3%A；2 min，3%A；3 min，90%A；5 min，90%A；6 min，3%A；8 min，3%A。柱溫35℃，流速為0.2 mL/min，正/負(fù)離子切換掃描，高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC－MS）的掃描范圍為50～500 m/z，分辨率70 000 FWHM，正離子模式電壓為3.8 kV，負(fù)離子模式電壓為3.2kV。離子傳輸管溫度為320℃，輔助氣加熱溫度為350℃，質(zhì)譜檢測(cè)信息見表1。

表1 咖啡豆中風(fēng)味性物質(zhì)成分的質(zhì)譜信息

（四）數(shù)據(jù)分析每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，最終結(jié)果用平均值表示。檢測(cè)數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS26.0軟件完成。

二、結(jié)果與分析

（一）咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)成分含量分析各風(fēng)味成分標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC－MS圖見圖1，可以看出，各物質(zhì)得到了充分的分離。不同地域的咖啡豆樣品各活性成分含量測(cè)定結(jié)果見表2，可以看出，綠原酸和葫蘆巴堿是咖啡豆中含量較高的風(fēng)味物質(zhì)，其中綠原酸的含量為7.14～20.58 mg/g，葫蘆巴堿的含量為9.48～29.26 mg/g。綠原酸是一種縮酚酸，具有抗菌、 抗病毒[14，19]、 清除自由基[15]、 抗炎[20]、抗氧化[21]等作用。葫蘆巴堿是生物堿類物質(zhì)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，其具有降低血糖、降低血脂[16]、保護(hù)腎臟[22]、保護(hù)心血管及心臟[23]等藥理作用。沒食子酸和DL－酒石酸的含量最低，均低于0.004 0 mg/g。

不同地域咖啡豆總風(fēng)味物質(zhì)的總含量情況見圖2，可以看出，7個(gè)產(chǎn)地的咖啡豆樣品中，巴拿馬咖啡豆樣品總風(fēng)味物質(zhì)的含量明顯高于其他產(chǎn)地的咖啡豆樣品，為71.93 mg/g；我國(guó)海南省和臺(tái)灣省的樣品風(fēng)味物質(zhì)含量都較低，分別為37.92 mg/g和36.92 mg/g。國(guó)產(chǎn)咖啡豆中，云南省的咖啡豆風(fēng)味物質(zhì)含量較高，表明其品質(zhì)較好，口感較其他國(guó)產(chǎn)咖啡豐富。在7個(gè)來源地中，產(chǎn)區(qū)為巴拿馬的咖啡豆樣品綠原酸、無(wú)水檸檬酸、L－蘋果酸和葫蘆巴堿的含量最高，分別為20.58、8.79、3.45和29.26 mg/g。我國(guó)臺(tái)灣產(chǎn)區(qū)的咖啡豆綠原酸含量最低，為7.14 mg/g，比巴拿馬樣品降低了65.31%。我國(guó)海南產(chǎn)區(qū)的咖啡豆葫蘆巴堿含量最低，為9.48 mg/g，比巴拿馬樣品降低了67.59%。

圖1 咖啡豆中風(fēng)味性物質(zhì)成分標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-MS圖

表2 不同地域咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)含量（mg/g）

圖2 不同地域咖啡豆風(fēng)味性性物質(zhì)總含量

（二）咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)含量的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

1.主成分分析。對(duì)7個(gè)產(chǎn)地深度烘焙咖啡豆樣品的10種活性成分進(jìn)行主成分分析，得到主成分載荷陣見表3，共提取出了3個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)了79.03%的方差，表明原始數(shù)據(jù)的大部分信息可以被因子提取，因子分析的結(jié)果是有效的。從表3中可以看出，富馬酸、D－（－）奎寧酸、咖啡酸、琥珀酸的第1主成分特征向量系數(shù)最高，即這4種成分主要載荷于第1主成分；L－蘋果酸、葫蘆巴堿、綠原酸、無(wú)水檸檬酸主要載荷于第2主成分；DL－酒石酸和沒食子酸則主要載荷于第3主成分。

表3 咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)主成分載荷陣

計(jì)算各產(chǎn)地烘焙咖啡豆樣品中風(fēng)味物質(zhì)的主成分得分，各地的平均得分如圖3所示，從圖中可以看出，不同產(chǎn)地烘焙咖啡豆樣品中第3主成分得分差別不大，說明地域因素對(duì)載荷于第3主成分的DL－酒石酸和沒食子酸的影響較小。產(chǎn)地為云南的樣品中第1主成分得分最低，即云南產(chǎn)區(qū)的烘焙咖啡豆中富馬酸、D－（－）奎寧酸、咖啡酸、琥珀酸的含量較其他地區(qū)低。對(duì)烘焙咖啡豆風(fēng)味及口感影響較大且含量較多的葫蘆巴堿和綠原酸都載荷于第2主成分，由圖3可知，巴拿馬來源的咖啡豆第2主成分得分最高，即巴拿馬咖啡豆中葫蘆巴堿和綠原酸含量較高，其口感更為豐富。同樣，來自于海南產(chǎn)區(qū)的咖啡豆相對(duì)遜色，可能與咖啡樹的栽種環(huán)境有關(guān)。

圖3 不同地域咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)主成分得分圖

2.聚類分析。對(duì)7個(gè)產(chǎn)地咖啡豆樣品中10種風(fēng)味物質(zhì)的含量進(jìn)行聚類分析，如圖4所示。從圖中可以看出，所有的咖啡豆樣品，按照咖啡豆中主要風(fēng)味物質(zhì)富馬酸、D－（－）奎寧酸、咖啡酸、琥珀酸、L－蘋果酸、葫蘆巴堿、綠原酸、無(wú)水檸檬酸、DL－酒石酸、沒食子酸的含量及其分布特點(diǎn)來劃分，可以分為3大類，分別為A類、B類和C類。每類樣品的產(chǎn)地來源如表4所示。其中A類樣品中含有32個(gè)樣品，綠原酸和葫蘆巴堿的含量較低，約80%的樣品中綠原酸和葫蘆巴堿的含量分別低于10 mg/g和15 mg/g；B類樣品中含有DL－酒石酸，含量為3.8～8.5μg/g，而A類和C類樣品中沒有檢測(cè)到酒石酸。C類樣品中樣品個(gè)數(shù)最少，只有11個(gè)，但所有樣品都來自國(guó)外，其中來自巴拿馬的樣品占C類樣品總量的54.5%。C類樣品的特點(diǎn)是載荷于第2主成分的L－蘋果酸、葫蘆巴堿、綠原酸、無(wú)水檸檬酸含量均顯著高于其他樣品，L－蘋果酸含量均高于2.8 mg/g，無(wú)水檸檬酸含量均高于7.5 mg/g，50%的樣品中葫蘆巴堿含量均高于30 mg/g。說明氣候條件和地理位置對(duì)咖啡豆的品質(zhì)影響較大，其中巴拿馬的咖啡豆風(fēng)味物質(zhì)含量較高，品質(zhì)較好。10種風(fēng)味物質(zhì)按照樣本的含量高低也聚為3類，葫蘆巴堿、綠原酸、L－蘋果酸、無(wú)水檸檬酸為一類，DL－酒石酸和沒食子酸為一類，富馬酸、咖啡酸、D－（－）奎寧酸、琥珀酸為一類，聚類結(jié)果與主成分分析的結(jié)果一致（見圖5）。

圖4 不同地域咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)含量聚類熱圖

表4 3類樣品來源匯總

圖5 咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)成分組件空間圖

3.判別分析。為了進(jìn)一步確定咖啡樣品分類結(jié)果的可信度，通過判別分析對(duì)不同產(chǎn)地的咖啡豆樣品進(jìn)行交叉驗(yàn)證，結(jié)果見表5。其中交叉驗(yàn)證遵循“留一個(gè)在外”的原則，即每組是通過除了這個(gè)組以外的其他組推導(dǎo)出來的判別函數(shù)來分類的。由表5可以看出，通過判別函數(shù)的預(yù)測(cè)，有55個(gè)樣品是分類正確的，即有78.6%的原始樣品被判對(duì)。圖6為咖啡樣品判別分組的分類結(jié)果圖，從圖中可以看出，7組的質(zhì)心可以得到明顯的區(qū)分。70個(gè)樣品中除個(gè)別樣品在重合區(qū)域外，大部分樣品分組清晰，與聚類分析的結(jié)果保持一致。

圖6 不同地域咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)判別分組結(jié)果

表5 不同地域咖啡豆風(fēng)味性物質(zhì)判別分析結(jié)果

三、討論

咖啡作為世界3大飲品之一，備受不同消費(fèi)人群的青睞，對(duì)咖啡的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)尤為重要。有機(jī)酸等物質(zhì)是咖啡中重要的成分，影響咖啡的風(fēng)味及口感，所以對(duì)咖啡中有機(jī)酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，更能科學(xué)全面地評(píng)價(jià)咖啡豆的品質(zhì)?？Х人?、綠原酸、富馬酸、沒食子酸、琥珀酸、無(wú)水檸檬酸、L－蘋果酸、DL－酒石酸、D－（－）奎寧酸、葫蘆巴堿是咖啡豆中主要的風(fēng)味物質(zhì)，這些有機(jī)酸類物質(zhì)可以改善毛細(xì)血管壁的通透性、增強(qiáng)毛細(xì)血管的彈性[24～25]。在檢測(cè)的咖啡樣品中的10種風(fēng)味物質(zhì)中，所有的樣品中葫蘆巴堿和綠原酸的含量較高，而沒食子酸、琥珀酸、DL－酒石酸含量較低。綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸生成的一種縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[26]。綠原酸在咖啡生豆中的含量較高，咖啡豆經(jīng)過烘焙，綠原酸發(fā)生美拉德反應(yīng)生成一些復(fù)雜的化合物，使綠原酸的含量較生豆有些下降[27]。綠原酸是影響咖啡酸度的重要物質(zhì)，并且賦予咖啡收斂性和苦味[28～29]。葫蘆巴堿是一種生物堿類物質(zhì)，其受熱易分解，可以生成大量的二氧化碳以及風(fēng)味物質(zhì)[30]，所以與綠原酸類似，烘焙咖啡豆中的葫蘆巴堿含量也低于咖啡生豆。

由采用主成分分析與聚類分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，巴拿馬的咖啡樣品在載荷于第2主成分中的L-蘋果酸、葫蘆巴堿、綠原酸、無(wú)水檸檬酸的含量中占有很大的優(yōu)勢(shì)。意大利和我國(guó)臺(tái)灣產(chǎn)區(qū)的咖啡樣品各主成分的得分差別不大，即這兩個(gè)產(chǎn)地的咖啡豆樣品各風(fēng)味物質(zhì)的含量差別不大。意大利大部分地區(qū)屬亞熱帶地中海式氣候，傳統(tǒng)的意式咖啡豆口感醇厚，酸度甜度很高?？夏醽喪芤嬗诨鹕酵寥?，咖啡有較鮮明的水果味，酸度較為密實(shí)。巴西是咖啡生產(chǎn)大國(guó)，種植約全球1/3的咖啡樹，巴西產(chǎn)區(qū)海拔較低，有很多低于1 000 m的莊園用于咖啡的種植，地貌較為平坦，氣候穩(wěn)定，優(yōu)質(zhì)咖啡產(chǎn)量較低，咖啡口感酸度低，較為甜美，呈現(xiàn)巧克力氣息。巴拿馬境內(nèi)咖啡產(chǎn)區(qū)有不少獨(dú)特的微氣候，所以巴拿馬產(chǎn)區(qū)擁有很多質(zhì)量絕佳的咖啡，現(xiàn)今精品咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)巴拿馬咖啡來說無(wú)疑是一個(gè)很好的機(jī)會(huì)。在我國(guó)，云南省地處我國(guó)西南邊陲，氣候基本上屬于亞熱帶和熱帶季風(fēng)氣候，平均氣溫較高，年溫差小，十分適合種植小粒種咖啡等熱帶經(jīng)濟(jì)作物，口感較為豐富，帶有木質(zhì)氣息。海南省土壤肥沃，自然環(huán)境優(yōu)良，咖啡味道香濃，口感高，有著天然的奶香味、巧克力香味。我國(guó)臺(tái)灣省是一個(gè)充滿丘陵與高山的海島，咖啡豆需要較為炎熱的環(huán)境來促使成熟，只有臺(tái)灣省中南部的山區(qū)有足夠的條件孕育出優(yōu)質(zhì)的咖啡豆，臺(tái)灣省咖啡有水果的甜香味，口感較為豐富。

四、結(jié)論

本研究基于多元統(tǒng)計(jì)分析探析不同區(qū)域咖啡豆中風(fēng)味性物質(zhì)含量及其差異規(guī)律，檢測(cè)分析了7個(gè)不同產(chǎn)地10種風(fēng)味性物質(zhì)的含量，采用多元統(tǒng)計(jì)分析的方法進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果表明，綠原酸和葫蘆巴堿是咖啡豆中主要的風(fēng)味物質(zhì)，其中產(chǎn)地為巴拿馬的咖啡豆樣品中綠原酸和葫蘆巴堿的含量最高，分別為20.58 mg/g和29.26 mg/g。我國(guó)臺(tái)灣省的咖啡豆綠原酸含量最低，為7.14 mg/g。其他風(fēng)味物質(zhì)含量差異不大，其中沒食子酸、DL－酒石酸含量最少。通過主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)咖啡樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量受地域影響較大，其中巴拿馬的咖啡樣品具有明顯的獨(dú)特性。本研究將為今后咖啡豆產(chǎn)業(yè)的科學(xué)監(jiān)管、加工指導(dǎo)以及居民的健康消費(fèi)提供技術(shù)支撐與理論依據(jù)。