龍春麗, 宋拉拉, 胡明文, 夏忠敏, 秦利軍

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒研究所， 貴陽(yáng) 550006；3.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 貴陽(yáng) 550025；5.貴州省土壤肥料工作總站， 貴陽(yáng) 550005)

辣椒(CapsicumannuumL.)屬茄科(Solanaceae)一年生或多年生植物，是重要的茄果類蔬菜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，在世界各地被大范圍種植和食用[1]。我國(guó)辣椒種植面積已超過(guò)130萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量約2 800萬(wàn)t，每年總產(chǎn)值約為700億元[2]。其中，貴州是辣椒的主產(chǎn)區(qū)之一，僅2018年種植面積就高達(dá)35萬(wàn)hm2，占全國(guó)辣椒種植總面積的16.6%，是貴州省規(guī)?；图卸茸罡叩氖卟藛纹穂3]。近年來(lái)，化學(xué)農(nóng)藥及肥料的不合理施用，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境不斷惡化[4]。鎘是農(nóng)耕地中常見(jiàn)的重金屬污染物，作物通過(guò)根系吸收的鎘超過(guò)閾值時(shí)，往往會(huì)抑制其生長(zhǎng)[5]。研究表明，鎘脅迫會(huì)引起植株表型異常，如葉、莖黃化，株高降低，葉寬變窄，莖圍縮小等[6-8]。另外，廖芳芳等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鎘對(duì)不同品種辣椒種子萌發(fā)的影響不同，抗性品種的種子萌發(fā)指標(biāo)顯著高于不抗品種；時(shí)小東等[10]研究鎘對(duì)米蕎1號(hào)種子萌發(fā)影響發(fā)現(xiàn)，低濃度的鎘能促進(jìn)種子萌發(fā)，提高種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)，而高濃度鎘則會(huì)抑制種子萌發(fā)。貴州辣椒資源豐富，如牛角椒、線椒、簇生朝天椒和小山椒等[11]，因此篩選和培育耐鎘的地方辣椒品種對(duì)促進(jìn)貴州辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。本試驗(yàn)以貴州15個(gè)地方辣椒品種中篩選出的兩個(gè)耐鎘辣椒品種LCL 4和LCL 6為材料，研究CdCl2脅迫對(duì)其種子萌發(fā)特征指標(biāo)(發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì))及抗性生理指標(biāo)(MDA含量和AOEs酶活)的影響，分析這些指標(biāo)在兩個(gè)品種中的變化差異，以期為篩選培育耐鎘地方辣椒品種、實(shí)現(xiàn)耐鎘辣椒品種規(guī)模化種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料試劑：辣椒品種LCL 4和LCL 6，種子由貴州省農(nóng)科院辣椒研究所提供。CdCl2、CuSO4和冰醋酸(分析純，≥99.5%)購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量測(cè)定試劑盒以及超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

主要儀器：臺(tái)式離心機(jī)(BECKMAN COULTER Microfuge 20 R Centrifuge)、分析天平(DENVER INSTRUMENT Max 210 g，d=0.1 mg)、水浴鍋(Thermo SCIENTIFIC HAAKE SC 100)、渦旋振蕩器(Thermo SCIENTIFIC M 37610-33 CN)、精密pH計(jì)(METTLER TOLEDO FiveEasy FE 20)、可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Thermo SCIENTIFIC Varioskan Flash 3001)。

1.2 方 法

1.2.1鎘脅迫下種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

分別配制200 mg·L-1的CdCl2溶液和0.01 g·mL-1的CuSO4溶液各500 mL備用。挑選籽粒飽滿、大小一致的辣椒種子若干浸泡于0.01 g·mL-1的CuSO4溶液中消毒60 min，之后用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗5～6次，晾干備用。種子晾干后撒播于墊有兩層無(wú)菌濾紙的玻璃培養(yǎng)皿(直徑為9 mm)中(每皿50粒)，用移液槍吸取6 mL 200 g·mL-1的CdCl2溶液完全浸潤(rùn)濾紙，加上蓋后以Parafilm封口膜(PM-996)進(jìn)行密封以防止水分蒸發(fā)，對(duì)照組以清水替代CdCl2溶液，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。觀察并記錄種子萌發(fā)情況。以胚根突破種皮露白作為種子萌發(fā)的標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充CdCl2溶液或蒸餾水以保證濾紙濕潤(rùn)。辣椒種子萌發(fā)后第7天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第14天時(shí)計(jì)算發(fā)芽率。分別按下列公式計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

發(fā)芽率(%)=(14 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(7 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.2辣椒苗培養(yǎng)及鎘脅迫處理

分別將兩品種種子撒播于育苗盤(pán)中，在16 h光照(28 ℃)/8 h黑暗(23 ℃)條件下自然萌發(fā)，待辣椒苗長(zhǎng)至6 cm時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至花盆(盆高18 cm，直徑15 cm，每盆裝培養(yǎng)基質(zhì)5 kg)后，置于溫度為(25±2)℃，濕度為80%，光照為1 800 lx的玻璃溫室中培養(yǎng)。每個(gè)品種種植15株，對(duì)辣椒幼苗進(jìn)行常規(guī)管護(hù)。待辣椒幼苗長(zhǎng)至4片真葉時(shí)，用配制的150 mg·L-1的CdCl2溶液進(jìn)行灌根處理，CdCl2溶液施用量以花盆底部開(kāi)始流出液體為宜。分別于第0天(處理前)、第1、3、5天剪取相同葉位的葉片0.2 g，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3鎘脅迫下辣椒苗MDA含量測(cè)定

取不同時(shí)期的凍存辣椒葉片各0.1 g，分別加入900 μL生理鹽水進(jìn)行研磨制備成10%組織勻漿液體，于4 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液為待測(cè)樣品。按照MDA測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定待測(cè)樣品在532 nm波長(zhǎng)下的吸光值，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4鎘脅迫下辣椒苗AOEs活性測(cè)定

待測(cè)樣按照1.2.3步驟進(jìn)行制備，SOD、POD和CAT酶活性測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 測(cè)定待測(cè)樣品在550、420 nm和405 nm波長(zhǎng)下的吸光值，分別計(jì)算SOD、POD和CAT酶活性，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Excel 2010軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對(duì)不同品種辣椒種子萌發(fā)的影響

由表1可知，200 mg·L-1的CdCl2溶液處理下LCL 6種子發(fā)芽率為96.26%，而LCL 4種子發(fā)芽率為96.67%，后者在脅迫條件下發(fā)芽率略高于前者，說(shuō)明200 mg·L-1的CdCl2溶液對(duì)兩個(gè)品種的辣椒種子萌發(fā)存在一定的抑制作用，且對(duì)LCL 6種子的抑制較強(qiáng)。LCL 4種子發(fā)芽勢(shì)對(duì)照組為100%，處理組為96.67%，而LCL 6發(fā)芽勢(shì)對(duì)照組為96%，處理組為93.3%，表明LCL 4種子在200 mg·L-1的CdCl2脅迫條件下具有較好的萌發(fā)特性，且發(fā)芽的整齊度較好。

表1 200 mg·L-1 CdCl2溶液對(duì)兩品種辣椒種子萌發(fā)的影響

2.2 鎘脅迫對(duì)葉片MDA含量的影響

MDA含量可反映植物受傷害的程度，故MDA含量可以用作評(píng)價(jià)生物的抗逆性和受傷害程度的指標(biāo)[12]。150 mg·L-1CdCl2處理辣椒幼苗后，LCL 4和LCL 6辣椒葉片表現(xiàn)為隨著時(shí)間的推移MDA含量逐漸下降的變化特征。LCL 4品種在處理第3天時(shí)，MDA含量與第1天相比有一定程度的增加，而僅為處理前(第0天)的56.25%。在處理第5天時(shí)兩個(gè)品種MDA含量都顯著降低，且LCL 6中MDA含量略低于LCL 4，兩者差異不顯著。

2.3 鎘脅迫對(duì)葉片SOD活性的影響

CdCl2溶液處理后，2個(gè)辣椒品種葉片中SOD活性均有一定增加，之后表現(xiàn)為隨脅迫時(shí)間推移SOD活性出現(xiàn)先增后降的變化趨勢(shì)。在CdCl2脅迫第3天時(shí)，LCL 4品種和LCL 6品種中SOD酶活均達(dá)到最大值，分別為913.73 U·(g·min)-1和756.25 U·(g·min)-1。在第5天時(shí)，兩個(gè)品種SOD酶活性開(kāi)始下降，LCL 4降至762.2 U·(g·min)-1，而LCL 6降至524.53 U·(g·min)-1。這種先升后降的趨勢(shì)符合一般抗性植物響應(yīng)逆境脅迫的規(guī)律?？傮w而言，LCL 4品種中SOD活性比LCL 6活性高，說(shuō)明前者在應(yīng)答CdCl2脅迫時(shí)抗性更強(qiáng)。

2.4 鎘脅迫對(duì)葉片CAT活性的影響

CdCl2脅迫后CAT活性測(cè)定表明，隨著鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT與SOD變化趨勢(shì)類似，即先增加后下降。在處理第5天時(shí)，兩個(gè)品種CAT含量均開(kāi)始下降，LCL 4品種中CAT活性為125.34 U·(g·min)-1，為脅迫處理前(第0天時(shí))的 61.6%，而LCL 6品種中CAT活性為116.40 U·(g·min)-1，為脅迫處理前(第0天時(shí))的72.8%。整體上，這兩個(gè)品種CAT變化趨勢(shì)一致，但LCL 4品種相比較LCL 6品種活性強(qiáng)，說(shuō)明前者對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除能力。

2.5 鎘脅迫對(duì)葉片POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以清除植物細(xì)胞中的H2O2，進(jìn)而減少活性氧對(duì)植物的傷害。POD活性測(cè)定表明，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)POD活性也表現(xiàn)為先增加后減少的變化趨勢(shì)。CdCl2脅迫第3天時(shí)，POD活性均達(dá)到最大值，LCL 4為1116.05 U·(g·min)-1，LCL 6為981.32 U·(g·min)-1。第5天時(shí)降至最低值，分別為處理前的70.8%和78.2%。

3 討 論

土壤中重金屬污染嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[11]。據(jù)調(diào)查，貴州土壤中重金屬鎘含量的平均值為0.659 mg·kg-1，顯著高于無(wú)公害蔬菜及水果的產(chǎn)地環(huán)境中的鎘含量(0.3～0.6 mg·kg-1)[13]。彭思云等[14]研究表明，貴州省土壤中鎘和汞是主要的重金屬污染物，其中鎘的單因子污染指數(shù)高達(dá)4.05，說(shuō)明全省境內(nèi)鎘污染較為嚴(yán)重。農(nóng)作物中鎘元素過(guò)量積累不僅會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻，還會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入動(dòng)物和人體內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病[15-16]。因此，篩選耐鎘抗鎘作物品種，對(duì)于農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展及降低鎘素的毒害作用具有十分重要的意義。本研究以前期篩選的2個(gè)耐鎘地方辣椒品種LCL 4和LCL 6為材料，分析鎘脅迫對(duì)其種子萌發(fā)及對(duì)幼苗抗性生理變化等的影響，以期為培育耐鎘辣椒新品種提供理論依據(jù)。

本研究表明，LCL 6和LCL 4種子的發(fā)芽率分別為96.26%和96.67%，與對(duì)照組相(99%和100%)比較均有一定程度下降，說(shuō)明200 mg·L-1CdCl2溶液在一定程度上抑制了種子的萌發(fā)，這與廖芳芳等[9]、孫亞莉[17]、宋拉拉等[18]研究結(jié)果一致，但兩者萌發(fā)率降幅均無(wú)顯著差異，說(shuō)明此濃度CdCl2脅迫對(duì)LCL 6和LCL 4種子萌發(fā)率無(wú)顯著抑制作用。但發(fā)芽勢(shì)指標(biāo)測(cè)定表明，CdCl2脅迫后LCL 4發(fā)芽勢(shì)為96.67%，低于對(duì)照組的100%，而LCL 6發(fā)芽勢(shì)為93.33%，低于對(duì)照組的96%。結(jié)合發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)結(jié)果分析，兩個(gè)耐鎘品種中，以LCL 4品種種子受鎘脅迫的影響較小。另外，以150 mg·L-1CdCl2溶液對(duì)辣椒幼苗進(jìn)行脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)，LCL 4和LCL 6葉片中MDA含量隨著時(shí)間的推移逐漸下降。在LCL 4品種中，脅迫處理第3天時(shí)，MDA含量與第1天相比有小幅增加，但僅為處理前的56.25%。說(shuō)明鎘脅迫導(dǎo)致辣椒幼苗細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生氧化損傷，但兩個(gè)品種能較快調(diào)節(jié)自身保衛(wèi)機(jī)制降低質(zhì)膜氧化產(chǎn)物MDA的積累，從而保護(hù)細(xì)胞。

植物在應(yīng)答逆境脅迫時(shí)可通過(guò)調(diào)動(dòng)自身保護(hù)酶活性，增強(qiáng)其對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力[19-20]。研究表明，當(dāng)植物體內(nèi)O2-·含量異常時(shí)往往會(huì)引起CAT、SOD[21]、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、POD[22]、谷光甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)等保護(hù)酶活性的高表達(dá)以消除O2-·或H2O2的過(guò)量積累。CdCl2脅迫后AOEs酶活測(cè)定表明，CdCl2脅迫3 d時(shí)，LCL 4品種和LCL 6品種中SOD酶活均達(dá)到極大值，分別為913.73 U·(g·min)-1和756.25 U·(g·min)-1，而在脅迫5 d時(shí)，兩個(gè)品種SOD酶活性開(kāi)始下降，LCL 4降至762.2 U·(g·min)-1，而LCL 6降至524.53 U·(g·min)-1；在脅迫處理第5天時(shí)，LCL 4品種中CAT活性為125.34 U·(g·min)-1，為脅迫處理前(第0天時(shí))的 61.6%，而LCL 6品種中CAT活性為116.40 U·(g·min)-1，為脅迫處理前(第0天時(shí))的72.8%。LCL 4品種CAT活性較LCL 6強(qiáng)，說(shuō)明對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除能力。另外，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)POD活性也表現(xiàn)為先增加后減少的變化趨勢(shì)。CdCl2脅迫第3天時(shí)，POD活性均達(dá)到最大值，LCL 4為1 116.05 U·(g·min)-1，LCL 6為981.32 U·(g·min)-1。以上研究為進(jìn)一步培育地方耐鎘辣椒品種、促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展及探討耐鎘的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。