池上評(píng)

摘要?[目的]建立紅樹秋茄的愈傷組織體系，為實(shí)現(xiàn)秋茄種質(zhì)資源離體保存及其多樣性研究提供科學(xué)依據(jù)。[方法]以紅樹林秋茄幼嫩葉片作為外植體，研究2，4-D和6-BA不同濃度配比下秋茄葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率，以及不同激素水平對(duì)秋茄葉片和愈傷組織褐變情況的影響。[結(jié)果]2，4-D對(duì)秋茄葉片愈傷組織形成是必需的，添加一定量的6-BA有助于提高愈傷組織誘導(dǎo)率，最佳激素配比為MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率最高，達(dá)35.0%;秋茄葉片和愈傷組織均有褐變現(xiàn)象發(fā)生，21 d內(nèi)，褐變率達(dá)33.3%～45.0%。[結(jié)論]初步明確了秋茄葉片愈傷組織的誘導(dǎo)條件及褐變影響因素。

關(guān)鍵詞?秋茄;愈傷組織;繼代培養(yǎng);褐變

中圖分類號(hào)?S792.99?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）09-0130-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.033

Abstract?[Objective] To establish the callus system of Kandelia candel and provide scientific basis for in vitro conservation and diversity research of Kandelia candel germplasm resources. [Method] Taking young leaves of Kandelia candel as explants， the callus induction rate of Kandelia candel leaves under different concentrations of 2，4-D and 6-BA， and the effects of different hormone levels on the browning situation of Kandelia candel leaves and callus were studied. [Result] 2，4-D was necessary for callus formation of Kandelia candel leaves. Adding a certain amount of 6-BA was helpful to improve the callus induction rate. The best hormone ratio was MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA， and the induction rate was up to 35.0%. The leaves and callus of Kandelia candel had browning phenomenon， and the browning rate reached 33.3% - 45.0% within 21 days. [Conclusion] The callus induction conditions and browning influencing factors of Kandelia candel leaves were preliminarily determined.

Key words?Kandelia candel;Callus;Subculture;Browning

紅樹林是我國(guó)東南沿海的木本植物群落，對(duì)調(diào)節(jié)全球的氣候變化具有重要意義[1-2]，又因其有著豐富的生物量而具有巨大的生態(tài)價(jià)值[3-4]。同時(shí)，完整的紅樹林不僅可以為人類提供良好的游憩場(chǎng)所，還是一個(gè)藥源寶庫(kù)，因此具有很高的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5-6]。秋茄（Kandelia candel）是紅樹林的主要造林樹種[6]，具有重要的生態(tài)保護(hù)價(jià)值。目前，秋茄的自然分布北界位于福建北部（27°20′N），浙江溫州有少量人工栽培[7-9]。秋茄一般采用胚軸（胎生苗）直接插植進(jìn)行繁殖，不僅繁殖方式單一，還存在繁殖周期較長(zhǎng)、效率低、可控性差、人工移植成活率低、成本高及不易大面積推廣等問題。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在林業(yè)上的應(yīng)用[10]，研究如何利用這一技術(shù)來解決秋茄擴(kuò)大繁殖具有重要意義。目前，關(guān)于秋茄組織培養(yǎng)的報(bào)道較少，黃有軍[11]以秋茄頂芽和幼葉為外植體研究了光照和黑暗條件下，不同激素配比對(duì)愈傷組織形成的影響，結(jié)果表明，外源生長(zhǎng)素對(duì)秋茄的幼葉愈傷組織形成是必需的，1 mg/L 2，4-D 或≥4 mg/L NAA 對(duì)愈傷組織形成有較好作用。筆者通過建立紅樹秋茄的愈傷組織體系，研究最佳誘導(dǎo)激素配比及褐變影響因素，旨在為深入保護(hù)和開拓紅樹林植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性以及保護(hù)紅樹林資源、促進(jìn)紅樹林生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

以福建省晉江坫頭國(guó)有防護(hù)林場(chǎng)紅樹植物秋茄幼葉作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?秋茄愈傷組織形成。

挑選新鮮外植體，取嫩葉，在洗潔精溶液中浸泡5 min，自來水沖洗2 h，在無菌條件下將外植體置于75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗1次;然后用0.2%HgCl2溶液消毒8 min，無菌水漂洗4～5次，切取約9 cm2葉塊接種在不同激素配比的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。定期觀察葉片愈傷組織的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)情況。

1.2.2?不同激素配比對(duì)秋茄愈傷組織形成的影響。

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源生長(zhǎng)素2，4-D、細(xì)胞分裂素6-BA進(jìn)行激素配比完全試驗(yàn)（表1），其中，pH為5.8，于25 ℃完全黑暗條件下培養(yǎng)。每處理接種20瓶。培養(yǎng)20、30、40 d后，觀察記錄愈傷形成情況，并記錄葉片誘導(dǎo)數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的瓶數(shù)/接種數(shù)×100%

1.2.3?不同激素水平下秋茄葉片褐變現(xiàn)象觀察。

用秋茄葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)，選取其中1組作為秋茄葉片褐變現(xiàn)象觀察材料，并定期觀察秋茄葉片的褐變現(xiàn)象，4種不同激素配比為

A1：MS+0.5 mg/L 2，4-D+0 mg/L 6-BA;

A2：MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA;

A3：MS+0.5 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA;

A4：MS+0.5 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA。

1.2.4?不同激素水平下秋茄愈傷組織褐變現(xiàn)象觀察。

不同激素水平下，對(duì)已經(jīng)繼代4次的秋茄愈傷組織進(jìn)行植物器官組織誘導(dǎo)，定期觀察愈傷組織褐變現(xiàn)象。每處理接15瓶，每瓶接2～3個(gè)愈傷團(tuán)，培養(yǎng)基設(shè)置為

B1：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0 mg/L 6-BA;

B2：MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA;

B3：MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA;

B4：MS+2.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA。

1.3?培養(yǎng)條件

溫度為（25±2） ℃，相對(duì)濕度保持在70%～80%，光強(qiáng)為1 000～1 500 lx，光照12 h/d。

1.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?秋茄愈傷組織形成情況

經(jīng)觀察，接種20 d 后在切口處可見少量愈傷組織，呈淡綠色;30 d 左右愈傷組織逐漸明顯，形態(tài)松散，呈淡黃色;40 d左右愈傷組織呈淡黃色，且不再擴(kuò)大;約60 d呈黃褐色。

2.2?不同激素配比對(duì)秋茄愈傷組織形成的影響

由表1可知，2，4-D能誘導(dǎo)秋茄愈傷組織的形成，添加6-BA 后，誘導(dǎo)率有一定程度的提高，且隨著2，4-D濃度的升高，誘導(dǎo)率呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最高，而2，4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率反而下降。綜合來看，以處理B11（MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA）的誘導(dǎo)率最高，達(dá)35.0%，其次為處理⑩，誘導(dǎo)率為25.0%。

2.3?不同激素水平下秋茄葉片褐變情況

在不同激素水平條件下，誘導(dǎo)秋茄葉片愈傷組織過程中，葉片褐變先從外植體的切口開始，并逐漸向外植體中心部位蔓延，最后外植體呈腐熟狀。由表2可知，4種處理方法均引起秋茄葉片的褐變，在外植體移入培養(yǎng)皿初期，秋茄葉片褐變速率較快，隨后逐漸減慢。秋茄葉片的褐變率都相對(duì)較高，在第21天，A1和處理A3達(dá)到40%，A2和A4達(dá)到45%。

經(jīng)方差分析可知，不同處理對(duì)秋茄葉片的褐變作用差異顯著（P<0.05），不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)秋茄葉片的褐變作用差異極顯著（P<0.01）。

2.4?不同激素水平下秋茄愈傷組織褐變情況

從圖1可見，在不同激素水平條件下，誘導(dǎo)秋茄愈傷組織形成器官的過程中，秋茄愈傷組織與培養(yǎng)基接觸部分先出現(xiàn)褐變，并向其他部位蔓延，直至整團(tuán)愈傷組織全部褐變。

由表3可知，4種處理均會(huì)引起秋茄愈傷組織的褐變，在愈傷組織移入培養(yǎng)皿初期，褐變速率較快，而后逐漸減慢，愈傷組織的褐變率都相對(duì)較高，在第21天，B1、B2和B3均達(dá)到40.0%，B4達(dá)到33.3%。經(jīng)方差分析，不同激素濃度處理對(duì)秋茄愈傷組織的褐變作用差異顯著（P<0.05），不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)秋茄愈傷組織的褐變作用差異極顯著（P<0.01）。

3?結(jié)論與討論

3.1?秋茄愈傷組織形成條件

該試驗(yàn)表明，幼葉可以作為紅樹秋茄組織培養(yǎng)的外植體，同時(shí)，在挑選外植體材料時(shí)盡量選取葉片幼嫩部位，且無機(jī)械損傷，防止消毒劑傷害外植體細(xì)胞，導(dǎo)致其在誘導(dǎo)愈傷過程中發(fā)生褐變。

3.2?外源物質(zhì)對(duì)秋茄愈傷組織形成的影響

該研究結(jié)果表明，外源生長(zhǎng)素對(duì)秋茄幼葉愈傷組織的形成是必需的，這與馬麗等[12]的研究結(jié)果一致。筆者通過篩選，得到葉片愈傷組織的誘導(dǎo)最佳激素配比為MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，即當(dāng)2，4-D 濃度在1.0 mg/L 時(shí)有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，添加一定量的6-BA 有助于提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但過高的6-BA 則抑制愈傷組織的發(fā)生。據(jù)報(bào)道[13-15]，外源物質(zhì)活性炭在組培技術(shù)上具有廣泛的應(yīng)用，特別是用活性炭來預(yù)防外植體褐變的發(fā)生具有重要作用[16]，這有待于今后進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3?秋茄組織培養(yǎng)過程中葉片和愈傷組織褐變?cè)?/p>

該試驗(yàn)結(jié)果表明，在秋茄葉片愈傷的誘導(dǎo)和愈傷組織繼代的過程中均會(huì)發(fā)生褐變，且褐變率均較大。總體來看，褐變是阻礙秋茄組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的一大難題。該研究表明，選用較嫩部位進(jìn)行培養(yǎng)可有效減少褐變的發(fā)生，選取秋茄次生物質(zhì)含量較少的部位也可有效降低褐變率。有研究表明，在進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)器官試驗(yàn)時(shí)，使用繼代次數(shù)較低的愈傷組織可降低褐變的發(fā)生。

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