顧陽 譚海 員林娜 孫海彥 常景玲 李志剛

（1.河南科技學院生命科技學院 現代生物育種河南省協同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng) 453003；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所海南省熱帶微生物資源重點實驗室，?？?571101）

環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作為生物體的第二信使，對新陳代謝具有重要的調節(jié)作用［1-2］，作為藥物具有提高機體免疫力、促進血液循環(huán)、改善心血管功能、預防過敏性疾病等功能，作為飼料添加劑在畜禽產品的生產中應用廣泛［3-4］。

利用微生物發(fā)酵生產cAMP時，存在嚴重的“碳溢流”現象并伴隨著副產物腺苷（AR）的大量積累。“碳溢流”即糖酵解途徑與三羧酸循環(huán)之間碳流不匹配，導致大量有機酸（乙酸和乳酸）產生；不僅大大降低cAMP對碳源的得率，導致碳源的嚴重浪費，還會引起培養(yǎng)環(huán)境的酸化，不利于菌體的生長代謝和產物合成［5-6］。副產物AR和cAMP均以AMP為原料合成，存在競爭關系，AR積累會影響產物產量和糖苷轉化率的提高。另外，cAMP和AR性質相近，AR的積累大大增加了產物分離純化的難度和成本。因此，合理調節(jié)碳代謝，減少有機酸和AR的積累是提高cAMP產量與得率的有效手段。

目前，關于調節(jié)代謝流改善cAMP發(fā)酵性能的研究主要集中在抑制糖酵解途徑、強化能量代謝以及工藝條件優(yōu)化等方面［7-8］。本實驗室前期研究中，通過外源添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉以及低聚磷酸鹽等輔助能量物質，促進前體ATP的合成，改變代謝流分配，提高了cAMP產量和生產效率［9-10］。Chen等［11］利用不同抑制劑對糖酵解途徑進行調節(jié)，發(fā)現氟化鈉能夠緩解“碳溢流”現象，有利于cAMP的合成。Song等［12］通過離子束注入法對節(jié)桿菌進行誘變處理，成功篩選到cAMP高產菌株，并利用糖酵解抑制劑大幅提高了cAMP產量。

氟化鈉是一種常見的糖酵解抑制劑，對丙酮酸激酶和烯醇化酶具有較強的抑制作用［13-14］。cAMP發(fā)酵過程中，利用氟化鈉促進產物合成的方法已經使用多年［11］。Niu等［15］通過13C 葡萄糖標記法進行代謝通量分析發(fā)現，氟化鈉提高了HMP途徑的通量，促進了cAMP的生物合成。但以上研究只關注了氟化鈉對糖酵解和磷酸戊糖途徑中代謝通量的影響，忽視了氟化鈉對能量代謝及副產物AR合成的影響。在發(fā)酵過程中，cAMP由ATP直接環(huán)化形成，而ATP磷酸化所需能量主要由NADH氧化交出電子并經電子呼吸鏈傳遞提供，強化能量代謝有利于產物合成［9］，另外，AR是由AMP在5′-核苷酸酶催化下脫磷酸生成，AR與產物合成均以AMP為底物，抑制5′-核苷酸酶活性，減少副產物AR積累，可以有效提高糖苷轉化和產物合成。本研究針對cAMP發(fā)酵合成的特點，從發(fā)酵動力學、各相關途徑碳通量和能量代謝等角度探討氟化鈉促進產物合成的生理機制，旨為進一步提高產物發(fā)酵性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗室保藏的節(jié)桿菌Arthrobacter sp.CCTCC 2013431，培養(yǎng)基配制方法參見文獻［9］。

1.1.2 儀器 SW-CJ-2FD雙人垂直凈化工作臺 蘇凈集團安泰公司制造；LMQ.C-100E高壓滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；ZWF-2112搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；BIOTECH-7BG機械攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設備有限公司；UV-2800紫外分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；液相色譜儀島津LC-2030C 日本島津儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)操作詳見前期研究［9］。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中氟化鈉添加量分別0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 g/L，每個條件做3個平行試驗。

1.2.2 分析方法 菌體干重（DCW）和葡萄糖測定方法參見文獻［7］。腺苷酸環(huán)化酶與琥珀腺苷酸合成酶活性測定方法參見文獻［16］。5′-核苷酸酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、丙酮酸激酶及己糖激酶活性采用試劑盒（Solarbio）進行測定，比酶活以U/mg蛋白表示。NADH和NAD+濃度采用試劑盒（Solarbio）進行測定。

乙酸和乳酸采用高效液相色譜法測定［17-18］。胞內代謝物檸檬酸、丙酮酸和草酰乙酸含量采用高效液相色譜法測定［19］。cAMP、腺苷、次黃嘌呤以及胞內ATP、AMP濃度測定均使用高效液相色譜測定［9，12］。天冬氨酸和谷氨酸采用Waters公司開發(fā)的AccQ-Tag法測定，操作方法和步驟按照說明書進行。

2 結果

2.1 不同氟化鈉添加量對cAMP發(fā)酵合成的影響

有研究表明，氟化鈉可以有效降低糖酵解途徑的碳通量［11］，促進cAMP的發(fā)酵合成。在250 mL錐形瓶中進行了添加不同濃度氟化鈉的發(fā)酵試驗，結果表明，隨著添加量的逐漸增加菌體濃度（DCW）和葡萄糖消耗量呈下降趨勢，而cAMP產量和轉化率則隨添加量增加呈現先升后降的趨勢，氟化鈉添加量為0.2 g/L時，cAMP產量和轉化率均達到最高值3.16 g/L和0.103 g/g，比對照（未添加氟化鈉）分別提高了35.6%和41.1%。表明添加氟化鈉雖然一定程度上抑制了菌體生長，卻能有效提高cAMP產量和得率。另外，氟化鈉添加量超過0.25 g/L時，菌體濃度、葡萄糖消耗，以及cAMP產量和轉化率均快速下降，表明高濃度的氟化鈉強烈抑制菌體生長和正常代謝，導致發(fā)酵產物的急劇下降（表1）。

2.2 7 L發(fā)酵罐中添加氟化鈉提高cAMP發(fā)酵整體性能

在7 L發(fā)酵罐中進行了添加0.2 g/L氟化鈉的發(fā)酵實驗，結果如圖1所示。添加與未添加氟化鈉兩批次中，次黃嘌呤濃度在發(fā)酵30 h后降至0.2 g/L以下，不再變化（圖1-B），表明發(fā)酵30 h后次黃嘌呤消耗殆盡，沒有嘌呤類物質存在條件下菌體開始通過從頭合成途徑生產cAMP（從頭合成發(fā)酵模式）。發(fā)酵72 h，添加氟化鈉批次的cAMP產量達到3.36 g/L，與對照批次相比，提高了25.8%，由于葡萄糖消耗量在兩批次中相差很小，cAMP得率也得到等幅度的提高。與對照批次相比，腺苷、乙酸和乳酸等副產物的積累量均顯著下降，分別降低了61.1%、54.8%和55.4%。腺苷與cAMP的合成都以AMP為原料，存在競爭關系，腺苷積累減少有利于cAMP產量和得率的提高；有機酸生成量下降不僅減少了碳源的浪費，而且使pH在發(fā)酵前期下降速度緩慢，后期回升加速，改善了培養(yǎng)環(huán)境（圖1-D）?？傊ㄟ^從頭合成發(fā)酵模式生產cAMP時，適量添加氟化鈉可以有效降低副產物的積累，緩解“碳溢流”現象，促進cAMP的合成。

與從頭合成途徑相比，補救途徑能夠直接利用外源嘌呤類物質進行cAMP的合成，代謝途徑縮短，能量消耗降低，產物合成效率高。在7 L發(fā)酵罐上進行了添加0.2 g/L氟化鈉的cAMP補救合成模式發(fā)酵實驗，發(fā)酵29 h向發(fā)酵液中添加1 g/L次黃嘌呤，使菌體繼續(xù)通過補救途徑合成產物。如圖2-B所示，與對照相比，添加氟化鈉批次中次黃嘌呤利用更快速，最終發(fā)酵液中殘留濃度也明顯低于對照；cAMP產量在68 h達到最大值4.35 g/L，比對照批次提高了27.9%，兩批次中葡萄糖消耗量相當，cAMP得率也得到顯著提高。此外，腺苷含量比對照批次的減少了64.1%，有機酸積累量也顯著降低（數據未給出）。以上結果表明，利用補救合成模式發(fā)酵cAMP時，添加適量氟化鈉能夠促進次黃嘌呤的快速利用，減少副產物腺苷和有機酸的積累，使更多碳源用于產物合成，促進cAMP產量和轉化率的提高。

圖1 氟化鈉對cAMP從頭合成發(fā)酵模式整體性能的影響Fig.1 Effects of NaF on cAMP fermentation production by de novo synthesis fermentation mode

圖2 氟化鈉對cAMP補救合成發(fā)酵模式整體性能的影響Fig.2 Effects of NaF on cAMP fermentation production by salvage synthesis fermentation mode

2.3 氟化鈉對cAMP合成途徑中關鍵酶活性的影響

cAMP生物合成途徑涉及磷酸戊糖途徑、腺苷酸合成途徑以及AMP磷酸化、ATP環(huán)化等過程，碳代謝流分配直接影響著產物的合成，而糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑間的碳流分配尤為重要。己糖激酶（hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途徑的限速酶，活性強弱反映了糖酵解途徑的代謝強度。6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）和琥珀腺苷酸合成酶（sAMPase）分別是磷酸戊糖途徑和腺苷酸合成途徑的關鍵酶，分別反映了碳流在兩條途徑中分配情況。對添加與未添加氟化鈉批次26、36、50和60 h樣品的胞內HK、PK、G6PDH和sAMPase的活性進行測定，結果如圖3所示。與對照批次相比，添加氟化鈉批次的HK活性有很小幅度的下降，并不顯著，而PK活性顯著下降，在36 h下降幅度最大達到40.2%，同時，G6PDH和sAMPase的活性明顯提高，最大漲幅分別達到100%和72.7%。表明氟化鈉添加對菌體利用葡萄糖的影響不大，但糖酵解途徑已經被顯著抑制，更多的碳流分配到磷酸戊糖途徑，進而通過腺苷酸合成途徑轉化為AMP，為產物合成提供原料。

圖3 氟化鈉對cAMP合成相關途徑中關鍵酶活性的影響Fig.3 Effects of NaF on the activities of key enzymes presented in cAMP biosynthesis pathways

AMP一方面經磷酸化形成ATP，進而由腺苷酸環(huán)化酶（AC）催化合成cAMP，一方面在5′-核苷酸酶（5-NT）作用下脫去磷酸基形成腺苷，腺苷大量形成必然對cAMP的積累以及后續(xù)分離純化過程產生不利影響。對添加與未添加氟化鈉批次的AC和5-NT的活性進行測定，結果表明AC活性在氟化鈉的作用下明顯提高，而5-NT的活性卻大幅下降（圖4）。表明副產物腺苷的合成受到氟化鈉的抑制，產物競爭AMP的壓力減弱，同時AC活性提高為產物合成提供了有力條件。

2.4 氟化鈉對胞內關鍵代謝物含量的影響

細胞內中間代謝物含量的變化一定程度上反映了代謝流分配情況。對糖酵解、三羧酸循環(huán)中的代謝物丙酮酸、草酰乙酸和檸檬酸，產物合成的前體氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）含量進行測定，結果如圖5所示。與對照批次相比，添加氟化鈉使丙酮酸含量明顯減少，草酰乙酸和檸檬酸含量變化不顯著，而天冬氨酸和谷氨酸含量有明顯的增加。氟化鈉顯著的抑制了糖酵解途徑，同時三羧酸循環(huán)代謝強度并沒有明顯的改變，考慮到乙酸和乳酸合成顯著下降的現象（圖1-C），猜想氟化鈉使原用于合成乙酸和乳酸的碳流分配到磷酸戊糖途徑，從而緩解了“碳溢流”現象，而進入三羧酸循環(huán)的碳流并未受到明顯影響。另外，前體氨基酸含量增加也為產物的合成奠定了物質基礎。

圖4 氟化鈉對腺苷酸環(huán)化酶和5′-核苷酸酶活性的影響Fig.4 Effects of NaF on the activities of AC and 5-NT

圖5 氟化鈉對胞內關鍵代謝物含量的影響Fig.5 Effects of NaF on main intracellular metabolites contents

2.5 氟化鈉對cAMP生物合成過程中能量代謝的影響

cAMP由ATP在腺苷酸環(huán)化酶作用下直接環(huán)化合成，胞內高ATP含量和ATP/AMP有利于產物合成。AMP磷酸化合成ATP所需能量主要由電子呼吸鏈提供，而NADH是電子呼吸鏈的主要電子供體，因此，NADH/NAD+的提高可以促進ATP的生成，進而促進產物合成。對添加與未添加氟化鈉批次的ATP/AMP和NADH/NAD+進行測定，結果表明添加氟化鈉致使ATP/AMP和NADH/NAD+明顯提高（圖6），為產物合成提供有利條件。這可能是由于氟化鈉抑制了糖酵解途徑，緩解了“碳溢流”現象，使有機酸生成量大幅減少（圖1-C），NADH的消耗隨之下降（乙酸和乳酸生成需要NADH作為輔酶），最終導致NADH/NAD+和ATP/AMP得到明顯提升。

3 討論

cAMP微生物合成過程具有反應條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢，受到越來越多的關注。目前，能夠積累cAMP的微生物主要來源于微桿菌屬（Microbacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）及酵母菌屬（Saccharomyces），其中節(jié)桿菌研究最多［20］。然而，cAMP發(fā)酵過程中存在嚴重的“碳溢流”現象，導致大量有機酸產生，不僅造成碳源的浪費，酸性條件還會影響細胞正常代謝和產物合成［5］?！疤家缌鳌笔怯捎谔墙徒馔緩胶腿人嵫h(huán)之間碳流不匹配導致的，前者的代謝通量超過后者，過剩的碳流在消耗大量NADH的條件下，形成有機酸釋放到胞外［21］。通過敲除關鍵酶基因和添加抑制劑弱化糖酵解途徑的代謝強度，能夠使代謝流重新分配，更多的分配到磷酸戊糖途徑，“碳溢流”現象能夠得到緩解［11，22］。

圖6 添加氟化鈉對細胞內能量代謝的影響Fig.6 Effects of NaF on NADH/NAD+ and ATP/AMP

由于缺少有效的基因改造手段，相關報道主要通過添加抑制劑的方式對cAMP生產菌株進行代謝調控［23］。有研究表明，氟化鈉能夠有效抑制丙酮酸激酶和烯醇化酶活性，進而降低糖酵解途徑的代謝通量［13-14］。Chen等［11］使用氟化鈉、碘乙酸、檸檬酸等多種抑制劑弱化糖酵解途徑發(fā)現，氟化鈉的效果最好，有效緩解“碳溢流”現象，cAMP產量得到顯著提高。本研究中，通過向cAMP發(fā)酵液中添加氟化鈉，丙酮酸激酶活性顯著下降，而6-磷酸葡萄糖脫氫酶、琥珀腺苷酸合成酶及腺苷酸環(huán)化酶等活性得到明顯提升，同時有機酸積累大幅下降，cAMP產量顯著提高。表明氟化鈉有效抑制糖酵解途徑，緩解了“碳溢流”現象，使更多碳流分配到產物合成途徑。另外，由于5′-核苷酸酶活性顯著降低，產物合成的一條分支途徑被抑制，副產物腺苷的積累顯著下降，為提高cAMP產量和得率提供有利條件。

在微生物細胞內，cAMP以ATP為底物直接環(huán)化形成，ATP持續(xù)高效合成是促進產物合成的重要因素［22］。ATP合成不僅需要前體氨基酸（天冬氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸）和戊糖等原料，還需要磷酸化反應所需的能量［10，19］。前期研究中，通過外源添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉以及低聚磷酸鹽等輔助能量物質，促進前體ATP的合成，提高了cAMP產量和生產效率［9-10］。本研究中由于氟化鈉的作用，胞內前體氨基酸含量明顯提高，為產物合成奠定了物質基礎；同時由于有機酸合成量降低，NADH消耗量大幅減少，使NADH/NAD+得到明顯提高，為產物合成奠定了能量基礎。氟化鈉促進cAMP生物合成機制的闡述，為高產菌株篩選和高產策略開發(fā)奠定了理論基礎。在后續(xù)工作中，將著重于cAMP生物合成途徑代謝調節(jié)機制的研究以及有效基因編輯工具的開發(fā)，進一步闡明cAMP合成調控機制，提高產物產量和轉化率。

4 結論

通過添加0.2 g/L氟化鈉，兩種發(fā)酵模式（從頭合成模式和補救合成模式）的cAMP產量分別達到3.36 g/L和4.35 g/L，與對應未添加氟化鈉批次相比，分別提高了25.8%和27.9%，腺苷和有機酸合成量顯著降低，發(fā)酵性能得到明顯改善。對cAMP合成途徑關鍵酶活性測定結果表明，氟化鈉抑制了PK和5-NT活性，而G6PDH、sAMPase和AC的活性得到明顯提高，表明糖酵解途徑和5-NT受到抑制，有機酸和腺苷合成受阻，更多碳流分配到產物合成途徑。通過氟化鈉的添加，ATP/AMP和NADH/NAD+均得到明顯提高，是由于有機酸合成量大幅減少，NADH的消耗隨之下降，促進了ATP的合成，為產物合成提供有利條件。