于 輝，李金磊，方忠意，鞏 丹

（1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄭州 450008；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

耐熱彎曲桿菌屬， 特別是空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌， 是常引起人畜共患細(xì)菌感染病的病原體［1］。 食用未煮熟的肉制品、受污染的水、未經(jīng)巴氏消毒的乳制品以及與帶菌動物密切接觸等均可導(dǎo)致感染［2］。 彎曲桿菌病是一種自限性疾病，在大多數(shù)情況下不需抗生素治療， 免疫功能低下的病例、嚴(yán)重或長期感染的病例，則須使用抗生素進(jìn)行治療［3］。

在一些國家， 彎曲桿菌是導(dǎo)致急性細(xì)菌性胃腸炎的主要細(xì)菌之一， 每年因彎曲桿菌引起的胃腸炎多達(dá)4 億～5 億例［3-4］。彎曲桿菌普遍存在于家禽腸道中，從家禽糞便、泄殖腔拭子和盲腸內(nèi)容物均可分離出［5-6］，因此，加強(qiáng)對雞源彎曲桿菌的監(jiān)測對維護(hù)公共安全具有重要意義。

該文通過對河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)， 掌握河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌分布及藥物敏感性情況， 為獸醫(yī)臨床用藥和結(jié)腸彎曲桿菌感染的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源雞泄殖腔拭子460 份， 采自河南省鄭州市、鶴壁市、新鄉(xiāng)市、焦作市、許昌市、漯河市、 商丘市7 個地區(qū)的規(guī)?；半u養(yǎng)殖場的260～390 日齡健康雞。

1.1.2 菌株結(jié)腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 23925）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑Preston 肉湯、 脫纖維綿羊血、CCDA 培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；96 孔藥敏板、 無菌馬血清購自上海星佰生物技術(shù)有限公司； 一次性無菌濾膜（0.45 μm）購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂糖購自Biowest 公司；DNA Marker DL 2 000、PCR 預(yù)混酶購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；50×TAE 購自北京索萊寶科技有限公司；α-氰-4-羥基肉桂酸購自Sigma 公司。

1.1.4 儀器設(shè)備生物安全柜（AC2-6S1 型，新加坡ESCO 公司），恒溫培養(yǎng)箱（IPP110 型，德國美墨爾特公司），離心機(jī)（3-18K 型，德國Sigma 公司），PCR 儀（LabCycler Standard Plus 型，德 國SENSO公司），電泳儀（EPS301 型，美國GE 公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（GeiDoc XR 型，美國Bio-Rad 公司），高壓滅菌鍋（HVE-50 型，日本Hirayama 公司），基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 （Axima-Performance 型，日本島津公司），厭氧罐［日本三菱瓦斯化學(xué)商貿(mào)（上海）有限公司］，移液器（德國艾本德公司）等。

1.1.5 引物根據(jù)結(jié)腸彎曲桿菌基因序列的保守片段，設(shè)計(jì)引物，上游P1：5′-AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC-3′， 下游P2：5′-TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC-3′，擴(kuò)增片段長度為364 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及預(yù)增菌用無菌棉簽采集雞泄殖腔拭子，立即轉(zhuǎn)接到含5%脫纖維綿羊血的Preston 肉湯中、微需氧條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，42 ℃培養(yǎng)4～6 h。

1.2.2 分離純化吸取50 μL 預(yù)增菌培養(yǎng)液滴加到鋪有無菌濾膜的CCDA 培養(yǎng)基上， 均勻滴加到5～6 個點(diǎn)，每個點(diǎn)約10 μL，室溫靜置5～10 min，待液體透過后去掉濾膜， 將培養(yǎng)基放入42 ℃恒溫箱，微需氧培養(yǎng)24～48 h，挑取單個疑似菌落劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板，42 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 PCR 鑒定用滅菌棉簽挑取純化好的菌落， 加入裝有無菌生理鹽水的1.5 mL 離心管，反復(fù)冷凍、 煮沸2～3 次，12 000 r/min 離心取上清液作為PCR 擴(kuò)增模板。 同時設(shè)陽性對照（模板為結(jié)腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸）、陰性對照（模板為無菌生理鹽水）和空白對照（模板為ddH2O）。

反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL，P1、P2 各1 μL，模板5 μL。

PCR 反 應(yīng)條 件：5 min， 94 ℃；1 min，94 ℃，1 min，64 ℃，1 min，72 ℃，2 個 循 環(huán)；1 min，94 ℃，1 min，62 ℃，1 min，72 ℃，2 個 循 環(huán)；1 min，94 ℃，1 min，60 ℃，1 min，72 ℃，2 個 循 環(huán)；1 min，94 ℃，1 min，58 ℃，1 min，72 ℃，2 個 循 環(huán)；1 min，94 ℃，1 min，56 ℃，1 min，72 ℃，2 個 循 環(huán)；1 min，94 ℃，1 min，54 ℃，1 min，72 ℃，30 個循環(huán)；10 min，72 ℃。

配制濃度為1.5%的瓊脂糖溶液，于微波爐中加熱溶解，待冷卻至50～60 ℃時，加入溴化乙錠（使終濃度達(dá)到0.5 μg/mL）混勻，倒入已插上梳子的膠槽。 待凝固后，轉(zhuǎn)入電泳槽，在每個泳道中加入8 μL 的PCR 產(chǎn)物，160 V 電泳20～30 min。 電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像。

1.2.4 基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI-TOF MS）飛行時間質(zhì)譜鑒定

1.2.4.1 樣品制備向1.5 mL 離心管中加入1 mL 75%的無水乙醇，從哥倫比亞血瓊脂平板上挑取4～6 個菌落于離心管中，振蕩混勻，超聲3 min，12 000 r/min 高速離心2 min， 棄去上清液。 加入50 μL 70%甲酸、50 μL 乙腈， 振蕩混勻， 超聲3 min，12 000 r/min 高速離心2 min，收集上清液。

1.2.4.2 點(diǎn)樣用移液器取1 μL 上清液， 點(diǎn)涂于MALDI 靶板孔上，自然晾干；再取2 μL CHCA 基質(zhì)（50%CAN，50%H2O，1%TFA）覆蓋到樣品上，自然晾干，將靶板放入質(zhì)譜儀進(jìn)行測量。

1.2.4.3 質(zhì)譜分析質(zhì)譜儀器參數(shù)調(diào)整如下：峰值調(diào)整模式為線性，陽離子模式，分子質(zhì)量范圍2 000～20 000 Da； 每孔采樣100 次； 激光強(qiáng)度50 Hz；離子源加速電壓20 kV。 每次試驗(yàn)前都要進(jìn)行儀器校準(zhǔn)：選擇標(biāo)品靶孔，采集一級質(zhì)譜圖。

利用Shimadzu Biotech Launchpad 軟件對采集的數(shù)據(jù)圖譜進(jìn)行分析鑒定。 采集結(jié)果導(dǎo)入Mascot數(shù)據(jù)庫，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，經(jīng)過軟件計(jì)算給出得分和鑒定結(jié)果，得分70 分（含）以上表示結(jié)果可信，70 分以下表示結(jié)果可疑。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法， 監(jiān)測結(jié)腸彎曲桿菌對阿奇霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素9 種抗菌藥的耐藥性。

取哥倫比亞血瓊脂平板上經(jīng)鑒定的結(jié)腸彎曲桿菌菌落數(shù)個， 用生理鹽水調(diào)制0.5 MCF， 吸取60 μL 加入12 mL 藥敏培養(yǎng)液（含600 μL 無菌馬血清）， 然后分別取100 μL 加入96 孔藥敏板，將藥敏板放入?yún)捬豕蓿瑫r放入微需氧產(chǎn)氣袋，42 ℃培養(yǎng)20～24 h，讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果，按照CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判定， 各抗菌藥物的判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 結(jié)腸彎曲桿菌抗菌藥物折點(diǎn)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中結(jié)腸彎曲桿菌分離鑒定結(jié)果

通過對樣品的選擇性分離純化， 經(jīng)PCR 和MALDI-TOF MS 飛行時間質(zhì)譜鑒定，460 批樣品共分離結(jié)腸彎曲桿菌42 株，分離率為9.13%。PCR和MALDI-TOF MS 飛行時間質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖1和表2。

圖1 結(jié)腸彎曲桿菌部分樣品PCR 鑒定結(jié)果

表2 結(jié)腸彎曲桿菌PCR 和MALDI-TOF MS 飛行時間質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離的42 株結(jié)腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、 阿奇霉素耐藥比較嚴(yán)重， 耐藥率分別為95.24%、90.48%、71.43%， 對氟苯尼考比較敏感，耐藥率為0，具體結(jié)果見表3。

表3 河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌對9 種抗菌藥物的藥敏結(jié)果 單位：%

多重耐藥方面，分離的42 株結(jié)腸彎曲桿菌有34 株（80.95%）耐3 種及3 種以上藥物，4 重耐藥最多，有16 株（38.10%），具體結(jié)果見表4。

表4 河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌多重耐藥結(jié)果（藥物大類）

3 討論

從20 世紀(jì)90 年代以來， 彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增加， 動物源性食品可通過食物鏈將耐藥彎曲桿菌傳遞給人類［7-8］。 家禽，主要是雞，被認(rèn)為是彎曲桿菌的重要儲存者［9］。 我國是家禽飼養(yǎng)和消費(fèi)大國，加強(qiáng)雞源結(jié)腸彎曲桿菌的監(jiān)測對促進(jìn)家禽業(yè)健康發(fā)展維護(hù)人類安全具有重要意義。

試驗(yàn)從河南省養(yǎng)雞場采集泄殖腔拭子， 通過選擇性增菌、分離，最后通過PCR 和MALDI-TOF MS 飛行時間質(zhì)譜對分離菌株進(jìn)行鑒定，提高了結(jié)腸彎曲桿菌分離的準(zhǔn)確性。 結(jié)腸彎曲桿菌的分離率為9.13%（42/460），這一結(jié)果比鄧義貞等［10］從雞泄殖腔拭子樣品中的分離率分別為14.67%（44/300）低，與張小燕等［11］從泄殖腔棉拭子樣品中的分離率為11.32%（60/530）和唐夢君等［12］從規(guī)?；B(yǎng)雞場、 農(nóng)貿(mào)市場和超市的雞泄殖腔樣品以及雞肉產(chǎn)品中的分離率為10.80%（81/750）相當(dāng)。 這些差異可能與不同地區(qū)養(yǎng)殖企業(yè)的養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)管理水平有關(guān)。

該研究分離的河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素耐藥嚴(yán)重，耐藥率均在70%以上，對四環(huán)素、泰利霉素、克林霉素、紅霉素耐藥較為嚴(yán)重，耐藥率50%～70%。 這一結(jié)果與國內(nèi)報道的雞源結(jié)腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率較高一致［11-14］，河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌對慶大霉素的耐藥率較聶荷敏等［15］報道的69.70%、張小燕等［11］報道的71.25%和唐夢君等［12］報道的71.00%低。 該研究中河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素的耐藥率較高， 這與家禽腹瀉等疾病的治療過程中大量使用喹諾酮類和四環(huán)素類藥物密切相關(guān)； 研究結(jié)果與其他報道有所差異， 可能與不同地區(qū)家禽飼養(yǎng)環(huán)境、 飼養(yǎng)水平以及家禽治療中使用和飼料中添加抗菌藥物的種類相關(guān)。 近兩年受非洲豬瘟的影響， 人們對于雞肉產(chǎn)品的消費(fèi)需求增加，因此，要在家禽飼養(yǎng)環(huán)節(jié)有效控制彎曲桿菌，加強(qiáng)生產(chǎn)管理，控制禽肉生產(chǎn)鏈中抗菌藥物的使用，促進(jìn)動物性食品的安全，保障人類健康。

4 結(jié)論

該研究從河南省蛋雞養(yǎng)殖場采集460 份樣品，共分離42 株結(jié)腸彎曲桿菌，總體分離率為9.13%，通過對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 分離菌株對環(huán)丙沙星、 萘啶酸、 阿奇霉素耐藥率均在70%以上，有34 株（80.95%）耐3 種及3 種以上藥物， 表明河南省雞源結(jié)腸彎曲桿菌耐藥率較為嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)家禽結(jié)腸彎曲桿菌耐藥性的監(jiān)測。