甘蔗新基因ShUGT2的生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位

李延博 王俊剛 趙婷婷 張樹珍 熊國(guó)如

(1 海南大學(xué)園藝學(xué)院 海南海口 570228;2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所∕中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心∕海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?571101)

糖基轉(zhuǎn)移酶 （glycosyltransferases，GT）普遍存在于自然界生物體內(nèi)，是一個(gè)龐大的基因家族，其作用是對(duì)糖基進(jìn)行催化，將活性供體分子轉(zhuǎn)移到激素、次級(jí)代謝物、蛋白等大小分子上［1］，改變受體分子的生物活性、穩(wěn)定性、水溶性、運(yùn)輸特性、亞細(xì)胞定位及其與受體的相互識(shí)別等特性［2］。在植物體內(nèi)最主要的糖基供體是尿核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP－glycosyltransferases，UGT），又稱作UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，它對(duì)于維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用［1］。

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)于UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的研究較多，有很多UGT 基因在不同植物中被克隆出來，如擬南芥［3］、水稻［4］、小麥［5］、大豆［6］、煙草［7］等；對(duì)于它們的生物學(xué)功能也有進(jìn)一步的研究，主要涉及植物的次級(jí)代謝、激素調(diào)節(jié)以及生長(zhǎng)發(fā)育等幾個(gè)方面［8-10］。如UGT76C2跟細(xì)胞分裂素有關(guān)，在該基因的過表達(dá)植株中，細(xì)胞分裂素N-糖苷含量明顯上升，在沉默植株中則下降，證明UGT76C2通過糖基化影響了細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育［11］。UGT73C5的過表達(dá)植株，其體內(nèi)油菜素內(nèi)酯減少且油菜素內(nèi)酯糖苷增加，而抑制表達(dá)的株系結(jié)果正好相反，證明了UGT73C5通過調(diào)控植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯含量來調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育［12］。而UGT74E2過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)生長(zhǎng)素積累，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢，且出現(xiàn)矮小化等現(xiàn)象［13］。UGT78D1可以糖基化槲皮素和山奈酚的3-OH 位置，進(jìn)而參與黃酮醇糖苷的生物合成［14］。

甘蔗（Saccharum officinarum）作為重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是最大的糖料作物，對(duì)中國(guó)乃至世界的食糖產(chǎn)業(yè)貢獻(xiàn)巨大［15］。甘蔗體內(nèi)有著眾多的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用尚不清楚。為明確糖基轉(zhuǎn)移酶基因在甘蔗內(nèi)的功能，本研究利用甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆出一個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因ShUGT2，對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析，通過構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體進(jìn)行蛋白定位分析，運(yùn)用半定量RT-PCR 技術(shù)確定該基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)情況，為后續(xù)研究提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

甘蔗來源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心儋州綜合試驗(yàn)站甘蔗基地，水稻品種日本晴由武漢伯遠(yuǎn)生物公司提供。

1.1.2 試劑

感受態(tài)細(xì)胞DH 5α 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒購(gòu)于生工生物工程有限公司；半定量RT-PCR試劑、Taq 酶、測(cè)序載體、cDNA 合成試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，RNA 提取試劑盒購(gòu)于Omega 公司；pCAMBIA1300-GFP載體由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗ShUGT2基因的克隆

取生長(zhǎng)成熟期甘蔗品種ROC22葉片，按試劑盒說明書提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知，28S、18S 和5S 條帶清晰，無DNA 污染；紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度可知，RNA 樣品滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。cDNA 第一鏈合成按TaKaRa 公司說明書進(jìn)行操作。根據(jù)甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)序列引物ShUGT2-F 和ShUGT2-R（表1），以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：cDNA 模板 1 μL，2 ×Taq 酶 12.5 μL， 引 物 ShUGT2-F 1 μL， 引 物ShUGT2-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 7 min；95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃2 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，將目的片段切膠回收，連接到pMD19-T 載體，于 16℃培養(yǎng) 12 h；轉(zhuǎn)入 DH 5α 感受態(tài)細(xì)胞，PCR 驗(yàn)證顯示，菌液呈陽(yáng)性克隆；將陽(yáng)性單菌落送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.2 生物信息學(xué)分析方法

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)和DNAMAN 軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。運(yùn)用 ProtParam 軟件 （https：//web.expasy.org/protparam/） 分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)， TMHMM Serverv.2.0 軟 件 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)，InterProScan軟件 （www. ebi. ac. uk/interPro/search/sequence-search）分析其結(jié)構(gòu)域，使用SOPMA 軟件（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html） 進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析， 用Swiss-Model 軟件（https：//swissmodel.expasy.org/） 進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。

1.2.3 ShUGT2蛋白的亞細(xì)胞定位

以pMD19-T 載體為模板，以ShUGT2-L-F 和ShUGT2-L-R為同源引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收目的片段；用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ單酶切pCAMBIA1300-GFP 載體，使其線性化；用DNA 回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物；將目的片段和線性克隆載體連接，于37℃金屬浴30 min；隨后立即冰水浴5 min，轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，PCR 驗(yàn)證菌液呈陽(yáng)性克隆，使用試劑盒提取質(zhì)粒。

挑取成熟期的水稻品種日本晴葉片，切割至0.2 mm 左右，置于10 mL 酶解液（1.25%Cellulose R10 和0.75 % Macerozyme R10）中酶解，黑暗真空30 min，50 r/min 酶解4 h；加入等體積W5 溶液，經(jīng)120 目細(xì)胞篩過濾，以200 r/min 離心3 min，棄上清；加入1 mL W5 溶液洗滌原生質(zhì)體，之后以200 r/min 離心3 min；棄上清，加入1 mL MMG 溶液重懸，暗保存。

吸10 μL （2 μg/μL） 質(zhì)粒DNA 于2 mL 離心管，緩慢加入100 μL 原生質(zhì)體懸浮液，并混勻；加入110 μL 40%PEG 溶液，緩慢混勻，黑暗條件下轉(zhuǎn)染15 min；加入400 μL W5 溶液，終止轉(zhuǎn)染，以120 r/min 離心2 min；去上清，加入1 mL WI 溶液，暗培養(yǎng)12 h?？瞻讓?duì)照載體pCAMBIA1300-GFP 操作同上。使用激光共聚焦顯微鏡觀察定位結(jié)果。

1.2.4ShUGT2半定量RT-PCR表達(dá)分析

取成熟期甘蔗ROC22 的根、莖、葉組織，按Omega 公司試劑盒說明書提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；根據(jù)目的基因的cDNA序列設(shè)引物ShUGT2-YF 和 ShUGT2-Y-R （表 1），以GAPDH為內(nèi)參基因［16］，引物測(cè)序合成由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min ；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 20 s，28個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗基因ShUGT2的克隆及序列分析

圖1 甘蔗基因ShUGT2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

參考甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物ShUGT2-F 和ShUGT2-R，擴(kuò)增出約1.8 kb 的目的基因片段（圖1）。將PCR 凝膠產(chǎn)物回收，連接pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化，測(cè)序后獲得1 867 bp長(zhǎng)度的序列。序列分析表明，ShUGT2含有1 782 bp 的完整開放閱讀框，編碼593 個(gè)氨基酸，根據(jù)氨基酸多重序列（圖2）對(duì)比和系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與高粱的SbUGT2、玉米的ZmUGT2、谷子的SitUGT2、狗尾草的SvUGT2等具有較高的序列相似性，其中與高粱的SbUGT2（XP_002468380.1） 同源性最為接近，達(dá)到了92.45%。

圖2 不同植物UGT氨基酸多重序列比對(duì)分析

續(xù)圖2 不同植物UGT氨基酸多重序列比對(duì)分析

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

2.2 生物信息學(xué)分析

通過理化性質(zhì)分析可知，ShUGT2 編碼蛋白理論等電點(diǎn)（pI）為8.16，相對(duì)分子量為67.28 kDa，不穩(wěn)定系數(shù)為48.68，是一種不穩(wěn)定蛋白，疏水性指數(shù)為-0.338，預(yù)測(cè)其為親水性蛋白。富含精氨酸Arg（R）（10.5%）、丙氨酸Ala（A） （9.8%）、纈 氨 酸 Val （V）（8.8%）、 亮 氨 酸 Leu （L）（8.4%）、冬氨酸Asp（D）（7.3%）、甘氨酸Gly（G）（7.1%）等。

通過跨膜區(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有1 個(gè)跨膜區(qū)，位于20～42 氨基酸的位置（圖4）。氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，ShUGT2 編碼的氨基酸具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶家族的特征結(jié)構(gòu)域，位于309～514個(gè)氨基酸（圖5）。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，該氨基酸存在α-螺旋、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。其中，有265 個(gè)氨基酸形成α-螺旋，占44.69%，84 個(gè)氨基酸形成伸展鏈，占14.17%；30 個(gè)氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角，占5.06%；214 個(gè)氨基酸形成無規(guī)則卷曲，占36.09%（圖6）。進(jìn)一步通過同源建模得到該氨基酸產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（圖7）。

2.3 ShUGT2蛋白的亞細(xì)胞定位

通過同源重組技術(shù)，將經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證（圖8）呈陽(yáng)性克隆的菌液提取pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP質(zhì)粒，使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的原生質(zhì)體的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對(duì)照pCAMBIA1300-GFP 空載體在原生質(zhì)體的每個(gè)部位都有表達(dá)（圖9-a），在線粒體上pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP 融合載體發(fā)出綠色熒光，具有明顯的定位特征（圖9-b），因此推論ShUGT2 編碼蛋白是一種線粒體蛋白。

圖4 跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

圖5 結(jié)構(gòu)域分析

圖6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

2.4 ShUGT2的半定量RT-PCR表達(dá)分析

選取甘蔗品種ROC22號(hào)葉片、莖和根部等組織器官，通過半定量RT-PCR 技術(shù)分析甘蔗ShUGT2基因的表達(dá)特性（圖10）。ShUGT2在甘蔗的葉片、莖和根部均有表達(dá)，但表達(dá)的特異性并不明顯。

圖8 菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆電泳結(jié)果

3 討論

圖9 ShUGT2蛋白的亞細(xì)胞定位

圖10 半定量RT-PCR結(jié)果

UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶在維持細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮了重要作用。植物在大自然中生存需要快速地適應(yīng)不斷變化的內(nèi)部和外部環(huán)境，其顯著反應(yīng)即產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而這些代謝物的產(chǎn)生往往需要大量的糖基化修飾，為了鑒定ShUGT2蛋白功能，本研究成功地從甘蔗中克隆出了編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因ShUGT2。該基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1 782 bp，編碼593 個(gè)氨基酸，在ShUGT2 蛋白序列中，包含了UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶超家族的功能保守域IPR002495，屬于GT8 家族的木聚糖α-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶。而GT8家族主要涉及木聚糖的生物合成，植物失去木聚糖基本上等于喪失了次生生長(zhǎng)能力，會(huì)出現(xiàn)矮小化和不抽薹的現(xiàn)象，而適當(dāng)提高木聚糖的合成可促進(jìn)二次細(xì)胞壁的形成，使植物具有更強(qiáng)的支撐力和生長(zhǎng)發(fā)育能力［17-18］。例如擬南芥中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因GUX1（AtPGSIP1）和GUX2（AtPGSIP3）可催化葡萄糖醛酸連接到木聚糖主鏈，從而形成植物的側(cè)鏈，并幾乎參與植物木聚糖所有側(cè)鏈的合成［19］。

在對(duì)基因功能的研究發(fā)現(xiàn)，亞細(xì)胞定位與基因功能有著緊密聯(lián)系；蛋白質(zhì)位于不同的細(xì)胞部位中，所行使的功能也不同。本研究利用融合綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)對(duì)ShUGT2 編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，該蛋白定位于線粒體中，主要在線粒體內(nèi)行使其功能。而線粒體在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)以及調(diào)控細(xì)胞增殖與代謝等多種過程中都發(fā)揮了重要作用［20］。因此，ShUGT2 蛋白很可能參與線粒體的代謝過程，通過參與木聚糖的合成，來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)半纖維素成分，促進(jìn)二次細(xì)胞壁形成，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育，為植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮了重要作用。

雖然已從很多不同的植物材料中分離出UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但由于技術(shù)手段的局限性，一些基因的作用底物未被鑒定，作用機(jī)制尚未清楚，目前的研究方向多集中于植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及激素平衡等方面。從半定量RT-PCR 中可看出，ShUGT2在甘蔗的根、莖、葉組織中均有表達(dá)。因此下一步的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)，將對(duì)甘蔗不同組織器官（根、莖、葉等）、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同影響因素下ShUGT2的表達(dá)特異性進(jìn)行分析，對(duì)其展開更深入的研究。本研究為進(jìn)一步分析該基因在甘蔗中的具體功能提供了依據(jù)。