白魯根 賀小霞

1.靖邊縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，靖邊，718500，中國(guó)

2.靖邊縣中醫(yī)醫(yī)院，靖邊，718500，中國(guó)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1］。P53起初被認(rèn)為是致癌基因，隨著研究的深入，其抑癌功能陸續(xù)報(bào)道［2］。P53 參與腫瘤的周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及抑制血管生成等過程［3］。沙棘籽油是從沙棘種子中提取的油液，是一種寶貴的藥用植物油，含有多種維生素、生物活性物質(zhì)以及微量元素，特別是維生素、胡蘿卜素、不飽和脂肪酸如亞麻酸、亞油酸、硒在抗腫瘤和增強(qiáng)免疫能力方面有獨(dú)特的生物活性［4］。近年來中藥抗腫瘤已成為科研熱點(diǎn)，沙棘油抗腫瘤的作用早在2004年的研究中就發(fā)現(xiàn)沙棘油可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7402 凋亡［5］。范磊等研究發(fā)現(xiàn)沙棘、肉豆蔻及其組方能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 增殖并促進(jìn)其凋亡［6］。但是關(guān)于沙棘油在胃癌的作用，目前研究報(bào)道較少，有待進(jìn)一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HGC-27 細(xì)胞株，由寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子病毒室惠贈(zèng)；細(xì)胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿，均購自唐山市研壹生物有限責(zé)任公司；一抗P53/P21/Bcl-2/β-actin，購自proteintech 公司；二抗，購自中山金橋公司；蛋白提取試劑盒，購自凱基生物公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8）細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，購自北京全式金生物公司；Western Blotting曝光儀，購自AZURE 公司；酶標(biāo)儀，購自bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)定助溶劑DMSO 對(duì)HGC-27 細(xì)胞活性的影響

本實(shí)驗(yàn)使用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為助溶劑溶解沙棘油，通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DMSO對(duì)于HGC-27 細(xì)胞安全劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶加入細(xì)胞培養(yǎng)液（5%雙抗+10%胎牛血清+85% 1640 培養(yǎng)基）放入5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h 后待細(xì)胞長(zhǎng)滿后開始傳代，將HGC-27 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，等到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，消化細(xì)胞后接種于96 孔板內(nèi)，每孔接種約5 000 個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度的DMSO 細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，DMSO 濃度梯度依次為0、0.01、0.1、0.5、1、2、2.5、5、10（%），繼續(xù)在5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄掉原培養(yǎng)液每孔加入不含DMSO 的細(xì)胞培養(yǎng)液0.1 mL，同時(shí)每孔加入0.01 mL 的CCK-8 檢測(cè)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后開始測(cè)定吸光度值并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每孔重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)定沙棘油對(duì)HGC-27 細(xì)胞的影響

通過實(shí)驗(yàn)1.2.1 檢測(cè)出助溶劑DMSO 的安全劑量，使用DMSO 溶解沙棘油溶解于培養(yǎng)液中干預(yù)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.1.將HGC-27 細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，每孔接種約5 000 個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后加入含沙棘油的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，沙棘油濃度梯度依次為0、1、5、10、20、40 μg·mL-1，繼續(xù)在5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄掉原培養(yǎng)液加入不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液0.1 mL，同時(shí)加入 0.01mL 的 CCK-8 檢測(cè)試劑，開始測(cè)定吸光度值并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每孔重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 Western Blotting 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

將HGC-27 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h，加入含沙棘油的細(xì)胞培養(yǎng)液作用24 h 后吸掉換入新鮮培養(yǎng)基，沙棘油使用濃度10、20、40 μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后收取細(xì)胞并提取蛋白。加樣開始電泳，配置SDS-PAGE 蛋白膠，每孔加20 μL 樣品，80 V 恒定電壓開始電泳待蛋白進(jìn)入濃縮膠后將電壓調(diào)至10 V 恒壓電泳宜至漠酚藍(lán)跑到底部，停止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件為300 mA 轉(zhuǎn)模30～50 min，待封閉完成后分別放入一抗中室溫孵育2～4 h，其中一抗?jié)舛确謩e為P53（1∶300）、P21（1∶400）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（1∶450），洗膜后放入二抗（1∶4 000）中室溫孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液采集圖像，保存數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0 分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism5.0 作圖。原始數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，同時(shí)滿足方差齊性，則使用t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMSO 對(duì)胃癌細(xì)胞活性影響

使用不同濃度的含DMSO 的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)HGC-27 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig.1 所示，DMSO 濃度梯度依次為0、0.01、0.1、0.5、1、2、2.5、5、10（%），當(dāng)DMSO濃度小于等于0.1%時(shí)細(xì)胞活性較對(duì)照組，無顯著性差異。當(dāng)DMSO 濃度分別為10、5、2.5、2、1、0.5（%）時(shí)，較對(duì)照組，細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05）。提示小于等于0.1% DMSO 細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)胃癌HGC-27 細(xì)胞活性無影響。

Fig.1 The effect of DMSO on the cell viability of gastric cancer HGC-27 cells

2.2 沙棘油對(duì)胃癌細(xì)胞活性的影響

使用不同濃度含沙棘油培養(yǎng)基干預(yù)HGC-27細(xì) 胞，結(jié)果Fig.2 所示，當(dāng)沙棘油濃度為5、10、20、40 μg·mL-1干預(yù)HGC-27 細(xì)胞，均能夠較好的抑制HGC-27 細(xì)胞的增殖（P<0.05）。

Fig.2 The effect of seabuckthorn oil on the cell viability of HGC-27 cells

2.3 Western Blotting 檢 測(cè)P53、Bcl-2、P21 蛋白表達(dá)水平

使用不同濃度含沙棘油培養(yǎng)基干預(yù)HGC-27 細(xì)胞，提取蛋白用Western Blotting 檢測(cè)凋亡基因P53、Bcl-2、P21 蛋白表達(dá)量，結(jié)果如Fig.3 所示，較對(duì)照組當(dāng)沙棘油濃度為10、20、40 μg·mL-1時(shí)，P53 蛋白表達(dá)量均明顯增加，P<0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；較對(duì)照組當(dāng)沙棘油濃度為5、10、20、40 μg·mL-1時(shí)，Bcl-2 蛋白表達(dá)量均明顯降低，P21 蛋白表達(dá)量均明顯升高，P<0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.3 The protein expression level of P53,Bcl-2,P21 on HGC-27 cells intervented by seabuckthorn oil

3 討論

近年來胃癌的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人類健康［7］。與胃癌相關(guān)的腫瘤基因成為抗腫瘤的研究熱點(diǎn)，其中促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的P53 基因起初被認(rèn)為是一種致癌基因，隨著研究的深入P53 抑癌功能逐漸被發(fā)現(xiàn)［8］。P53 通常在Bcl-2 家族的作用下通過線粒體調(diào)控凋亡，Bcl-2 家族主要由抑制細(xì)胞凋亡蛋白和促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白組成，P21 基因是人體最主要的凋亡基因，是極重要的促細(xì)胞凋亡基因之一［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)P53 作為轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平激活P21 的表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞衰老，抑制腫瘤的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［11］。林方德等研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過上調(diào)人胃癌MGC-803 細(xì)胞p53 蛋白表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)，有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展［12］。

沙棘為胡頹子科酸刺屬的落葉灌木或小喬木，又名沙棗、酸柳果、酸柳［13］。沙棘籽油是從沙棘種子中提取的油液，是一種寶貴的藥用植物油，在抗腫瘤和增強(qiáng)免疫能力方面有獨(dú)特的生理功能［14］。沙棘提取物及單體化合物對(duì)腫瘤活性有很好的抑制作用，沙棘提取物中富含有黃酮類化合物、白花青素、苦木素、香豆素等對(duì)抗癌作用功效顯著［15］。據(jù)報(bào)道沙棘汁富含維生素C和E，沙棘中還含有大量的黃酮類物質(zhì)，羅昕通過使用沙棘提取液對(duì)K562、HL-60、YAC-1 腫瘤細(xì)胞體外干預(yù)培養(yǎng)，受試藥對(duì)HL-60、YAC-1 細(xì)胞DNA 合成有抑制作用，對(duì)K562 細(xì)胞DNA 中UdR 有釋放作用，提示沙棘提取液對(duì)血液腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用［16］。張哲民研究發(fā)現(xiàn)沙棘樹皮提取物、沙棘樹皮和樹枝混合提取物具抗轉(zhuǎn)移活性，沙棘樹枝、葉、根提取物、樹皮油、果和葉油對(duì)艾氏腹水癌未表現(xiàn)出抗腫瘤特性［17］。劉雪梅等研究發(fā)現(xiàn)使用沙棘油浸泡過的鼠糧喂養(yǎng)的小鼠，治療組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，對(duì)照組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況相反，推斷沙棘油阻礙腫瘤的生長(zhǎng)［18］。朱煜研究發(fā)現(xiàn)沙棘油對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡有一定抑制作用且其抑制casepase 通路中的線粒體途徑是其可能的機(jī)制［19］。

本研究通過使用沙棘油干預(yù)胃癌HGC-27 細(xì)胞，通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5、10、20、40 μg·mL-1的沙棘油能夠有效抑制HGC-27 細(xì)胞的增殖。陸林發(fā)通過使用沙棘果渣總黃酮干預(yù)胃癌細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8 法檢測(cè)不同濃度的沙棘總黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示不同濃度沙棘總黃酮能不同程度地抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901 的增殖，并且呈劑量和時(shí)間依賴性，本研究與此結(jié)果趨勢(shì)一致［20］。通過Western Blotting 檢測(cè)凋亡基因P53、Bcl-2、P21 變化，結(jié)果顯示10、20、40 μg·mL-1的沙棘油干預(yù)HGC-27 細(xì)胞，P53、P21 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，提示胃癌細(xì)胞凋亡增加，本研究結(jié)果與朱煜研究趨勢(shì)一致［19］。

綜上所述，沙棘油可通過P53 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌HGC-27 細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖，來達(dá)到抗腫瘤作用，沙棘油具有良好的抗腫瘤作用。