玉米須多糖對糖尿病大鼠的糖脂代謝及PGC-1α蛋白糖異生信號通路的影響

胡玉立 丁雷 李梅 劉瑋 趙丹 吳麗麗 秦靈靈 劉銅華

玉米須是禾本科植物玉蜀黍(ZeamaysL.)的干燥花柱，全國大部分地區(qū)均產(chǎn)，含有豐富的多糖、生物堿和黃酮類化合物等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，玉米須具有降糖、降脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[1-2]。同時(shí)玉米須，味甘淡，性平，能夠利尿祛熱、護(hù)肝利膽，契合消渴病內(nèi)熱的基本病機(jī)[3]。已有多項(xiàng)研究證明玉米須具有確切的降糖作用，其可能通過改善胰島素抵抗，促進(jìn)胰島素分泌，促進(jìn)糖原合成，抑制氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮作用[4-8]，但其是否抑制糖異生及其具體機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察玉米須多糖對2型糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rats,ZDF)的糖脂代謝的影響，以及基于過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α) 蛋白信號通路探討玉米須多糖抑制糖異生作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究玉米須的功效及降糖機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性ZDF大鼠12只，13～14周齡，270～400 g；正常對照ZL大鼠6 只，13～14周齡，280～330 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK(Jing) 2016 0011。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，室溫(25±2)℃，相對濕度(50±5)%，晝夜循環(huán)12小時(shí)/12小時(shí)條件下。動物自由飲水，正常維持飼料喂養(yǎng)，飼料由北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室提供。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號:BUCM-4-2019040904-2104)

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

玉米須多糖，購自西安品誠生物科技有限公司，批號：PC-1905043。

甘油三酯測定試劑盒(中生北控股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號：YZB/國2087-2003);總膽固醇測定試劑盒(中生北控股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號：YZB/國0689-2010)；低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(中生北控股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號：YZB/國0599-2003)；高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(中生北控股份有限公司,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號：YZB/國0677-2003)；糖原過碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1281);蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120);叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forehead box-containing protein of the O subfamily 1，F(xiàn)oxO1)(C29H4)Rabbit mAb(CST公司，批號：2880)，Phospho-FoxO1(Ser256) Antibody(CST公司，批號：9461)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)(D12F5) Rabbit mAb (CST 公司，批號：12940)；葡萄糖6磷酸酶 (glucose-6-phosphatase, G6Pase) (D5D2) Rabbit mAb(CST 公司，批號：12263)；Anti-PGC1 alpha antibody(Abcam 公司，批號：GR3213300-2)；β-Actin(13E5)Rabbit mAb(CST公司，批號：4970)；山羊抗兔IgG H&L(HRP)(Abcam公司，批號：GR3355126-1)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

臺式高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司，3K15)；快速血糖儀及配套試紙(日本愛科來國際貿(mào)易上海有限公司，GT-1941)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司，BX53)；垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司，Mini-PROTEAN Tera System)；凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司，ChemiDocTM XRE with Image LabTM Software)。

1.4 動物造模、分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12小時(shí)，采尾靜脈血測定各組大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)，以FBG>7.0 mmol/L且隨機(jī)血糖>11.1 mmol/L作為2型糖尿病模型成模標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)ZDF大鼠FBG和體質(zhì)量(body weight，BW)水平，采用區(qū)組隨機(jī)法，實(shí)驗(yàn)動物分為正常對照組、模型組及玉米須多糖組，每組6只。玉米須多糖組給藥劑量為500 mg/(kg·d)，正常組和模型組大鼠灌服去離子水，所有大鼠灌藥體積均為1 mL/100 g體重，灌胃1次/天，連續(xù)給藥5周，固定同一時(shí)間。給藥期間，所有大鼠自由飲水及進(jìn)食正常飼料。

1.5 血液樣品的制備與指標(biāo)檢測

給藥后每隔一周測量一次BW及尾靜脈采血測定FBG。第5周禁食不禁水12小時(shí)，測大鼠空腹血糖作為0分鐘血糖，按2 g/kg給大鼠灌胃50%葡萄糖溶液進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance，OGTT)，測定30 分鐘、60 分鐘、120 分鐘血糖，計(jì)算曲線下面積[公式：AUC = 0.5×(Bg 0 min +Bg 30 min)/2 + 0.5×(Bg 30 min+Bg 60 min)/2 + 1×(Bg 60 min + Bg 120 min)/2]。

給藥5周后，禁食不禁水12小時(shí)，1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，3000 rpm、 4℃離心15分鐘，取上清，檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量?？焖偈占闻K組織，部分液氮冷凍，用于蛋白含量測定；部分4%多聚甲醛固定，用于肝臟形態(tài)學(xué)觀察。

1.6 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

新鮮肝臟組織4%多聚甲醛固定24小時(shí)后，石蠟包埋，3～5 μm切片，根據(jù)HE和PAS染色試劑盒使用說明書步驟進(jìn)行，常規(guī)光學(xué)顯微鏡高倍鏡鏡檢，觀察肝臟組織形態(tài)及糖原分布，并拍照保存圖片。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測糖異生相關(guān)蛋白PGC-1α、FoxO1及其磷酸化形式、PEPCK、G6Pase的表達(dá)

取凍存的肝臟組織黃豆粒大小，按照活性蛋白提取試劑盒提取肝臟總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量，100℃沸水煮5分鐘變性。制10%膠，上樣量15 μg，電泳：80V，30分鐘，100V 1小時(shí)，轉(zhuǎn)膜：100V 1小時(shí)，搖床常溫封閉1小時(shí)，加入配置好的一抗4℃過夜孵育，TBST漂洗三次，二抗常溫孵育1小時(shí)，TBST漂洗三次，加ECL 超敏發(fā)光液反應(yīng)1分鐘，BIO-RAD凝膠成像儀顯影，Image J 6.0分析灰度值，蛋白表達(dá)水平用目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值來表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 玉米須多糖對ZDF大鼠一般情況的影響

正常組大鼠精神良好，活動自如，皮毛光澤。與正常組相比，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動度減低，伴多飲、多食、多尿等現(xiàn)象，皮毛光澤度低。與模型組比較，玉米須多糖組有類似表現(xiàn)，但多飲、多食、多尿程度較低，皮毛光澤度偏高。

2.2 玉米須多糖對ZDF大鼠體質(zhì)量的影響

與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著偏高(P<0.05)；給藥后，與模型組相比，玉米須多糖組體質(zhì)量有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具體見表1。

表1 玉米須多糖對ZDF大鼠體質(zhì)量的影響

2.3 玉米須多糖對ZDF大鼠空腹血糖的影響

第0周，與正常組相比，模型組大鼠的血糖具有差異(P<0.05)，模型組和給藥組無差異(P>0.05)；從第4周開始至用藥結(jié)束，玉米須多糖組與模型組血糖出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，具體見表2。

表2 玉米須多糖對ZDF大鼠空腹血糖的影響

2.4 玉米須多糖對ZDF大鼠糖耐量的影響

與正常組相比，模型組大鼠的血糖的0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘的血糖及AUC均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，玉米須多糖組0分鐘、30分鐘、60分鐘血糖及AUC均顯著下降(P<0.05)，具體見表3。

表3 玉米須多糖對ZDF大鼠糖耐量的影響

2.5 玉米須多糖對ZDF大鼠血脂的影響

與正常組相比，模型組的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平明顯升高(P<0.05)；給藥5周后，與模型組相比，玉米須多糖組LDL-C顯著下降(P<0.05)，TC、TG有下降趨勢，HDL-C有上升趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具體見表4。

表4 玉米須多糖對ZDF大鼠血脂的影響

2.6 各組ZDF大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察

2.6.1 HE 正常組肝細(xì)胞大小、形態(tài)均勻正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為中心，向四周呈索狀排列，內(nèi)未見脂質(zhì)沉積；模型組肝小葉肝索結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞腫大變性，存在大量脂肪空泡及脂質(zhì)沉積。與模型組相比，玉米須多糖組肝小葉呈索狀排列，結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)大致正常，存在輕度脂肪病變，但無明顯大脂滴形成(見圖1)。

注：A：正常組B：模型組C：玉米須多糖組。

2.6.2 PAS 正常組肝臟PAS染色明顯飽滿，均勻，呈紫色；與正常組比較，模型組肝臟見大量脂肪空泡，細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)PAS染色明顯稀薄，不均勻；與模型組比較，玉米須多糖組大鼠肝組織糖原含量明顯增多，脂肪空泡明顯減少，圍繞肝小葉均勻分布(見圖2)。

注：A：正常組B：模型組C：玉米須多糖組。

2.7 各組大鼠肝臟組織糖異生通路PGC-1α、FoxO1、PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)的比較

如圖3、表5所示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織PGC-1α、PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)量升高(P<0.05), FoxO1蛋白表達(dá)量升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);pFoxO1/FoxO1比值顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，玉米須多糖組大鼠肝臟組織PGC-1α、PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，F(xiàn)oxO1蛋白表達(dá)量減少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，pFoxO1/FoxO1比值顯著升高(P<0.05)。

表5 玉米須多糖對ZDF大鼠肝組織糖異生通路PGC-1α相關(guān)靶蛋白的影響

注：A：正常組B：模型組C：玉米須多糖組。

3 討論

近年來，2型糖尿病由于其高發(fā)病率、高致殘率逐漸成為威脅人類健康的主要慢性病之一，造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9-10]，探索天然有效的降糖藥成為研究熱點(diǎn)。玉米須作為傳統(tǒng)藥食兩用的中藥，大量實(shí)驗(yàn)表明其能夠有效降低糖尿病大鼠血糖。本研究結(jié)果顯示，玉米須多糖干預(yù)5周后可顯著降低ZDF大鼠的FBG、OGTT-AUC、LDL-C，對TC、TG具有降低趨勢，HDL-C有升高趨勢，說明玉米須多糖可以降低血糖，改善糖耐量，促進(jìn)肝糖原合成及調(diào)節(jié)糖異生。

肝臟作為控制身體能量代謝的關(guān)鍵器官，對維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，約有90%內(nèi)源葡萄糖由肝臟合成，肝臟糖異生決定空腹血糖水平，在調(diào)節(jié)血糖中起關(guān)鍵作用[11]。正常情況下，進(jìn)食后胰腺β細(xì)胞釋放胰島素以抑制肝臟中糖異生和糖原分解， 從而降低血糖水平； 空腹時(shí)， 胰腺α細(xì)胞釋放胰高血糖素，增加肝糖異生，升高血糖。肝臟糖異生活躍，內(nèi)源性葡萄糖輸出增多，亦是肝臟胰島素抵抗的主要表現(xiàn)，同時(shí)也是促進(jìn)糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素。 因此， 糖異生也是目前臨床治療2型糖尿病的主要靶點(diǎn)。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)是一種多功能調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)控生物過程如線粒體生物發(fā)生和呼吸、糖異生和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原分解、氧化磷酸化等[12]。PGC-1α禁食后在肝臟中被誘導(dǎo)，在一些糖尿病或胰島素信號缺乏的模型中升高[13]，尤其在糖異生增高的幾種糖尿病模型中上調(diào)[14]。PGC-1α可通過PGC-1α/雌激素受體相關(guān)受體α(estrogenreceptor-relatedreceptorα,ERRα)負(fù)反饋、肝細(xì)胞核因子4α(hepatic nuclear factor 4 alpha,HNF4α)的共激活等多條通路調(diào)節(jié)糖異生過程[12]。近年來，PGC-1α作為糖尿病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)而逐漸被關(guān)注。糖異生主要由PEPCK和G6Pase調(diào)節(jié)，它們是將丙酮酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)水平受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如FoxO1、PGC-1α、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)等[15]。胰高血糖素通過轉(zhuǎn)錄激活因子CREB-CRTC2和FoxO1-PGC-1α復(fù)合物上調(diào)糖異生基因G6Pase和PEPCK的表達(dá)，以維持空腹血糖水平。研究證實(shí)，胰島素-AKT途徑可以通過FoxO1的磷酸化分離PGC-1α-FoxO1復(fù)合物[13]。FoxO1被證明也可直接與葡萄糖生成基因的啟動子結(jié)合，并激活葡萄糖產(chǎn)生[13]。肝細(xì)胞特異性缺失FoxO1可降低禁食小鼠糖原分解和糖異生，導(dǎo)致低血糖[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過玉米須多糖治療后，糖尿病大鼠的PGC-1α、PEPCK、G6Pase水平均明顯下降，pFoxO1/FoxO1水平明顯上升，說明玉米須可能通過促進(jìn)FoxO1磷酸化表達(dá)，阻止FoxO1與PGC-1α結(jié)合，減少PEPCK及G6Pase的表達(dá)，從而抑制大鼠的肝臟糖異生過程，達(dá)到降低血糖的目的。

本實(shí)驗(yàn)采用瘦素受體敲除的自發(fā)型ZDF大鼠，其進(jìn)食量明顯增加，同時(shí)存在代謝綜合征的表現(xiàn)，是研究糖尿病的良好動物模型[17]。給藥5周后，糖尿病大鼠的血糖、OGTT AUC以及LDL-C顯著降低，肝臟的脂肪沉積及糖原分布亦有了明顯改善，實(shí)驗(yàn)機(jī)制表明其可能通過促進(jìn)FoxO1的磷酸化表達(dá)，抑制PGC-1α對糖異生的調(diào)節(jié)作用，從而降低血糖，但玉米須對糖異生過程中其他轉(zhuǎn)錄因子是否有影響，及其可能的上游通路，有待進(jìn)一步探索。