王 晴，邵 珺，李勇勇，石 娟，周麗萍，李超群，婁永江*

（1.寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波315211；2.寧波南衡進出口有限公司，浙江 寧波315000）

鮐魚，俗稱鮐巴魚、青花魚，為中上層魚類。目前鮐魚主要被加工成罐頭食品[1]，加工過程有10%左右暗色肉被剔除。鮐魚暗色肉營養(yǎng)豐富[2-4]，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[5]，但目前鮐魚暗色肉資源僅作為飼料魚粉的加工原料，幾乎無高值化利用。以鮐魚暗色肉為原料制備了相對分子質(zhì)量小于3 000的鮐魚暗色肉蛋白肽，為研究提了充足的原料。

鋅是人體必需的微量金屬元素，在人體生長發(fā)育、生殖遺傳、維持上皮細胞正常形態(tài)[6]、蛋白質(zhì)合成及代謝等方面有至關(guān)重要的作用。鋅缺乏會導致生殖功能障礙、性成熟延遲[7]、異食癖，并會影響神經(jīng)、精神、味覺、血糖等方面，且與缺鐵性貧血、原發(fā)性高血壓、動脈粥樣硬化、消化性潰瘍、神經(jīng)性耳聾等都有著密切關(guān)系[8]。從飲食中攝入的鋅元素容易與植酸形成不溶性絡合物，從而導致鋅的生物利用度降低[9]。我國不同年齡組居民鋅缺乏情況較為普遍，尤其是兒童、孕婦。因此必須采用有針對性的方法來改善鋅缺乏。而小分子寡肽與微量元素螯合可提高機體對微量元素的吸收利用率且無副作用[10]。趙洪雷等[11]以小鼠為實驗材料，研究出鰱魚蛋白螯合鋅有生物活性且能促進機體吸收；顧冰飛等[12]以杏鮑菇為原料，通過水提法提取杏鮑菇多糖，研究了杏鮑菇多糖鋅螯合物的制備工藝并發(fā)現(xiàn)其抗氧化性。

螯合反應有反應溫度高、周期長等缺點，而用超聲螯合能有效提高化學反應速率，縮短反應時間，同時超聲技術(shù)已在食品工業(yè)領(lǐng)域被廣泛研究[13]。相對分子質(zhì)量小于3 000的蛋白肽具有小分子寡肽的特性：膠原蛋白活性較強，好吸收且酶解產(chǎn)物中有最豐富的相對分子質(zhì)量小于3 000的組分，生產(chǎn)成本較低。因此本研究以相對分子質(zhì)量小于3 000的鮐魚暗色肉蛋白肽為原料，通過超聲法制備肽鋅螯合物，以期獲得同時具有鋅和寡肽雙重功能的新產(chǎn)品，促進水產(chǎn)品深加工業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為99%的鮐魚暗色肉小分子寡肽粉末（相對分子質(zhì)量小于3 000）、硫酸鋅、EDTA、HCl、NaOH、鉻黑T、NH3-NH4Cl緩沖溶液：均購于阿拉丁試劑公司（上海）。

1.2 試驗儀器

Biosafer SB-4200DTS超聲槽：購自南京賽飛生物科技有限公司；3H16RH智能高速冷凍離心機：購自湖南赫西儀器裝備有限公司；Spectramax i3x酶標儀：購自美谷分子儀器（上海）有限公司；X射線能譜儀（EDS）：購自日本電子株式會社；日立L-8900全自動氨基酸分析儀：購自沈陽奇特爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小分子寡肽與硫酸鋅的超聲螯合反應

1）螯合工藝鮐魚暗色肉小分子寡肽（相對分子質(zhì)量小于3 000）→溫水溶解→加硫酸鋅溶液→調(diào)pH→調(diào)超聲溫度→超聲螯合反應→濃縮→乙醇析出→離心→干燥→肽鋅螯合物

2）螯合得率測定取凍干后的肽粉，加去離子水充分溶解，分別用少量蒸餾水溶解，配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的肽溶液，按一定體積比加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的硫酸鋅溶液，調(diào)pH后，開始在一定溫度下進行一定時間的螯合，待反應完畢，進行冷卻，加入8倍體積的無水乙醇，在4 500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，除去上清液，并用無水乙醇洗滌離心1～2次。將沉淀物置于45℃電熱鼓風干燥箱中烘干，得肽鋅螯合物，測定其螯合物得率。

式（1）中：W1為初始反應物的總質(zhì)量，g；W2為反應后肽鋅螯合物的總質(zhì)量，g。

3）螯合率測定采用EDTA滴定法[14]。稱量每份肽鋅復合物，加入10 mL NH3-NH4Cl緩沖溶液溶解，再滴2滴鉻黑T指示劑，用濃度為0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉滴定，當溶液由紫色變?yōu)榈{色時停止滴定，記錄消耗乙二胺四乙酸二鈉的體積，按式（2）、（3）計算鋅的螯合率。

式（2）中：X為肽鋅復合物質(zhì)量分數(shù)，%；M為鋅的摩爾質(zhì)量，g/mol；C為乙二胺四乙酸二鈉的摩爾濃度，mol/L；V為滴定乙二胺四乙酸二鈉的體積，L；m為稱取肽鋅復合物的質(zhì)量，g。

1) 零點驗證。儀表零點值是影響計量準確性的重要指標，該系統(tǒng)提供儀表零點核查功能，可實時獲取到測量管振動頻率、左檢測線圈電壓、右檢測線圈電壓、驅(qū)動增益、活零點等信息，開展零點驗證核查?；盍泓c是在一定時間范圍內(nèi)用平均值和流量計的零點穩(wěn)定性指標進行比較，如果零點核查通過，說明目前是一個好的零點，不需要標定零點；如果零點核查通不過，需要標定零點。

式（3）中：Y為鋅的螯合率，%；X為肽鋅復合物的質(zhì)量分數(shù)，%；m為肽鋅復合物的質(zhì)量，g；n為鋅的投入量，g。

式（4）中：W3為螯合物中鋅的質(zhì)量，mg；W4為初始反應體系的鋅及寡肽的質(zhì)量，mg。

4）超聲螯合反應的單因素試驗主要將鮐魚暗色肉小分子寡肽與硫酸鋅在一定的螯合肽質(zhì)量分數(shù)、時間、溫度、pH、肽與硫酸鋅質(zhì)量比水平下，以螯合率、螯合得率為指標，在超聲功率為250 W，頻率為40 000 Hz的超聲槽內(nèi)進行螯合[15]。

5）超聲螯合反應的響應面優(yōu)化試驗在單因素試驗的基礎上，選取時間、溫度、pH、肽質(zhì)量分數(shù)為試驗因素，以螯合物得率、螯合率為評價指標，采用Box-Behnken方法設計四因素三水平響應面試驗，試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Design factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3.2 能譜分析 用雙面膠將肽與肽鋅螯合物粉末分別粘貼于鋁制樣品臺上，然后獲取檢測微區(qū)，用EDX儀測定微區(qū)主要元素的質(zhì)量分數(shù)和原子數(shù)百分含量，重復3次。EDX儀技術(shù)指標：電壓10 000 V，電子束6.0 eV，工作距離10.0 mm[16]。

1.3.3 氨基酸成分分析 取適量鮐魚暗色肉酶解液冷凍干燥產(chǎn)品及鮐魚暗色肉肽鋅螯合物，加入摩爾濃度為6 mol/L的HCl，充氮氣后，熱融密封，110℃烘箱中水解24 h，脫酸后用水定容至適宜濃度，上樣，用L-8900全自動氨基酸分析儀測定[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗平行3次，使用Origin8.0及SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮐魚暗色肉鋅螯合物制備的單因素試驗

2.1.1 螯合pH值對寡肽鋅螯合得率及螯合率的影響由圖1可知，螯合反應開始，隨著pH的不斷增加，肽鋅螯合能力逐漸增強，在pH值為8時，其螯合能力達最大值，其螯合得率和螯合率達到最高值分別為53.32%、63.35%，隨后緩慢下降。這是因為:氫離子與金屬離子為競爭關(guān)系，體系中的氫離子解離較多，寡肽解離的氫離子較少，能與金屬陽離子結(jié)合的位點就少，螯合率低。隨pH加大，酸性減弱，體系中寡肽解離產(chǎn)生的氫離子增加，螯合率上升，當pH繼續(xù)加大，堿性提高，氫氧根離子增多，就產(chǎn)生了氫氧化鋅沉淀，螯合率下降[18-21]。

圖1 pH對螯合能力的影響Fig.1 Effect of pH on the chelating ability

2.1.2 螯合時間對寡肽鋅螯合得率及螯合率的影響從圖2可知，隨著螯合時間增長，肽鋅螯合能力有所提高（P＜0.05），當反應時間達到50 min左右時，肽鋅螯合能力達最大值，隨著反應時間繼續(xù)延長，其螯合得率基本穩(wěn)定（P＞0.05）。主要是因為：隨著時間延長，螯合反應基本達到平衡，螯合得率基本保持穩(wěn)定，但是隨著時間延長，體系的穩(wěn)定性被破壞，其副反應的發(fā)生率提高，導致部分配合物開始解離，螯合率下降[22]。

圖2 螯合時間對螯合能力的影響Fig.2 Effect of chelating time on chelating ability

2.1.3 螯合肽質(zhì)量分數(shù)對寡肽鋅螯合得率及螯合率的影響 由圖3可知，肽質(zhì)量分數(shù)為5%時，螯合得率及螯合率達最大值，之后趨于穩(wěn)定（P＞0.05）。主要是因為：肽與鋅濃度低，由熱運動引起的螯合碰撞少，隨著肽質(zhì)量分數(shù)增加，蛋白肽分子與鋅離子分布密集，碰撞概率提升，從而減弱螯合效果。

圖3 肽質(zhì)量分數(shù)對螯合能力的影響Fig.3 Effect of peptide concentration on chelating ability

2.1.4 螯合溫度對寡肽鋅螯合得率及螯合率的影響由圖4可知，螯合能力隨著反應溫度的上升出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在反應溫度達到70℃時，其螯合能力達到最大，隨后開始下降（P＜0.05）。這是因為：溶液中的鋅離子會隨著溫度升高而加速溶出，這增大了鋅離子與肽的碰撞頻率[23]，有利于螯合反應的進行，但高溫易破壞肽類結(jié)構(gòu)[24-25]，使反應活性位點不易暴露，寡肽鋅的結(jié)合位點減少，不利于螯合能力提升。

圖4 溫度對螯合能力的影響Fig.4 Effect of temperature on the chelating ability

2.1.5 硫酸鋅與肽質(zhì)量比對寡肽鋅螯合得率及螯合率的影響 由圖5可知，硫酸鋅與肽的質(zhì)量比為2∶1時，螯合效果最佳。原因是：當硫酸鋅與肽的質(zhì)量比過小時，寡肽團聚暴露點減少，肽的有效利用率下降，過量的寡肽不利于螯合反應的發(fā)生，還會造成資源浪費；當硫酸鋅與肽的質(zhì)量比過大時，鋅離子濃度占優(yōu)勢，有較強的爭奪供電基團能力，而溶液中的寡肽無法生成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)且肽濃度低，大量的鋅離子未參與螯合反應[26]，螯合效果下降，故曲線呈現(xiàn)先逐漸上升后下降的趨勢。

圖5 硫酸鋅與肽質(zhì)量比對螯合能力的影響Fig.5 Effect of the mass ratio of zinc sulfate to peptide on the chelating ability

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 響應試驗模型的建立與試驗結(jié)果分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的螯合得率（%）、螯合率（%）對時間A（min）、溫度B（℃）、pHC、肽質(zhì)量分數(shù)D（%）的四元二次回歸方程分別為：Y螯合得率=56.20-1.75A-1.50B+2.75C+1.67D-0.25AB+3.75AC-2.75AD+1.00BC+3.25BD+2.00CD-4.47A2-3.60B2-4.73C2-4.10D2；Y螯合率=65.40-0.50A-0.42B+2.17C+2.25D+1.25AB+1.5AC-3.25AD+1.50BC+4.00BD-2.00CD-5.62A2-3.49B2-4.37C2-3.47D2。

由表3和表4可知，對該回歸方程進行方差分析，模型項達到極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型構(gòu)建成功。螯合得率模型的決定系數(shù)R2=0.836 5，螯合率模型的決定系數(shù)為R2=0.824 1，這證明響應面回歸模型與實際試驗擬合度較高，模型的精密度較高，可用此回歸方程對螯合得率和螯合率進行理論預測。表3中4個試驗因素對螯合得率的影響從小到大依次為：溫度（B）、肽質(zhì)量分數(shù)（D）、時間（A）、pH（C）。一次項C和二次項A2、B2、C2、D2對螯合得率的影響極顯著（P＜0.01）；交互項AC、BD對螯合得率的影響顯著（P＜0.05），其余項對指標影響不顯著。表4中4個試驗因素對螯合率的影響從小到大依次為：溫度（B）、時間（A）、pH（C）、肽質(zhì)量分數(shù)（D）。二次項A2、C2對螯合率的影響極顯著（P＜0.01）；一次項C、D、交互項AD、BD及二次項B2、D2對螯合率的影響顯著（P＜0.05），其余項對指標影響不顯著。

表2 Box－Behnken試驗設計及響應值Table 2 Box-Behnken test design and response value

表3 螯合得率回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of chelation yield regression model

2.2.2 響應面分析 響應面交互作用分析通過響應面圖和等高線圖可以直觀反映研究因素及其交互作用對螯合得率及螯合率的影響，響應面圖6、7、8、9、10、11中曲線越彎曲說明對研究因素影響越大，等高線呈橢圓形說明試驗因素之間的交互作用顯著，等高線呈圓形說明試驗因素之間的交互作用不顯著。從等高線形狀看，pH值和溫度沿著彎曲表面上升的斜率陡峭，并且軸向輪廓致密，故反應pH值和反應溫度存在顯著的交互作用，且明顯可以看出反應pH值對肽鋅螯合能力的影響相比溫度較大?？赡苁且驗殡S著溫度升高，分子運動活躍，碰撞機會多，且相互之間團聚的可能性變大，螯合物就會絮凝下來。pH值較低時，溶液中的H+較多，易于與寡肽中的羧基或氨基結(jié)合；值較高時，容易形成氫氧化鋅溶液中的Zn2+減少，也不利于膠原寡肽螯合鋅的生成。

根據(jù)Design Expert試驗設計軟件分析得到佳螯合條件為肽鋅質(zhì)量比為1∶2、反應溫度72.37℃、反應pH 7.85、肽質(zhì)量分數(shù)5.35%、反應時間51.33 min，此時得到的響應預測螯合得率與螯合率分別56.98%、66.00%。

2.2.3 驗證試驗 結(jié)合實驗的可行性，驗證試驗采取的工藝條件適當調(diào)整為：螯合時間51min、螯合溫度72℃、肽鋅質(zhì)量比1∶2、肽質(zhì)量分數(shù)5.35%、螯合pH值7.9，在該工藝條件下測得肽鋅螯合得率與螯合率分別為55.86%、65.12%，與預測值相比，誤差較小，說明該模型可行。

表4 螯合率回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of chelation rate regression model

2.3 氨基酸成分分析

圖6 時間和pH的交互作用對螯合率和螯合得率的響應面Fig.6 Response surface diagram of the interaction between time and pH on chelation rate and chelation yield

圖7 溫度和pH的交互作用對螯合率和螯合得率的響應面Fig.7 Response surface diagram of the interaction between temperature and pH on chelation rate and chelation yield

圖8 肽質(zhì)量分數(shù)和p H的交互作用對螯合率和螯合得率的響應面Fig.8 Response surface diagram of the interaction between peptide concentration and pH on chelation rate and chelation yield

圖9 時間和溫度的交互作用對螯合率和螯合得率的響應面Fig.9 Response surface diagram of the interaction between time and temperature on chelation rate and chelation yield

圖10 時間和肽質(zhì)量分數(shù)的交互作用對螯合率和螯合得率的響應面Fig.10 Response surface diagram of the interaction between time and peptide concentration on chelation rate and chelation yield

圖11 溫度和肽質(zhì)量分數(shù)的交互作用對螯合率和螯合得率的響應面Fig.11 Response surface diagram of the interaction between temperature and peptide concentration on chelation rate and chelation yield

由表5可知，鮐魚暗色肉蛋白寡肽與鮐魚暗色肉肽鋅螯合物共檢出17種氨基酸，與鮮味氨基酸有關(guān)的氨基酸如谷氨酸、天門冬氨酸，這兩者的質(zhì)量分數(shù)均較高。其中呈中性、堿性的氨基酸兩者均占了較大的比例。但各種氨基酸的質(zhì)量分數(shù)有所變化。此外，構(gòu)成膠原蛋白的脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸和精氨酸的質(zhì)量分數(shù)之和在鮐魚暗色肉蛋白寡肽與其肽鋅螯合物中分別為43.78%和35.35%。研究表明，肽的氨基酸組成、羧基和酸性氨基酸的側(cè)鏈氨基與肽的金屬離子螯合能力有關(guān)且賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、脯氨酸（Pro）等有較高的金屬螯合活性[15]，尤其是金屬離子Cu2+、Zn2+、Ni2+等易與肽或蛋白質(zhì)表面的組氨酸咪唑基結(jié)合，且組氨酸殘基越多，肽的鋅螯合率越大[27]。

表5 氨基酸成分分析Table 5 Amino acid composition analysis

2.4 能譜分析

對制備的樣品用能譜儀進行面掃描，見圖12。由表6可知，鮐魚暗色肉寡肽無Zn原子，肽鋅螯合物中Zn原子數(shù)百分含量為15.59%，Zn質(zhì)量分數(shù)增至44.94%。C的原子數(shù)百分含量和質(zhì)量分數(shù)分別從67.82%、60.14%降至40.48%、21.44%，O的原子數(shù)百分含量由28.6%提升至40.21%，而O的質(zhì)量分數(shù)從33.78%下降至28.37%。此外肽鋅螯合物中多了S元素，這可能是因為寡肽在螯合過程中，添加了硫酸鋅，繼而導致螯合物中有硫酸根離子的殘留。肽鋅螯合物酶解液寡肽能譜圖中，沒有Zn峰，而肽鋅螯合物能譜圖（b）中有3個Zn峰，這說明Zn2+與寡肽在3個位點發(fā)生了螯合，能譜分析結(jié)果表明：大量Zn2+與鮐魚暗色肉寡肽發(fā)生了螯合。

圖12 鮐魚暗色肉蛋白肽及肽鋅螯合物的能譜分析Fig.12 Energy spectrum analysis diagram of mackerel dark meat protein peptide and peptide zinc chelate

表6 鮐魚暗色肉蛋白肽及肽鋅螯合物的能譜分析結(jié)果Table 6 Energy spectrum analysis results of mackerel dark-colored meat protein peptide and peptide zinc chelate

3 結(jié) 語

本研究將酶解后的鮐魚暗色肉與鋅離子進行螯合，以螯合得率和螯合率為指標，考察反應時間、溫度、pH、肽質(zhì)量分數(shù)、硫酸鋅與肽的質(zhì)量比對螯合能力的影響。通過響應面結(jié)合實際應用得出最佳工藝條件為螯合時間51 min、螯合溫度72℃、肽鋅質(zhì)量比1∶2、肽質(zhì)量分數(shù)5.35%、螯合pH值7.9，螯合得率與螯合率分別為55.86%、65.12%，這為鮐魚暗色肉肽鋅螯合物制備提供了較為理想的工藝模型。對鮐魚暗色肉肽鋅螯合物進行氨基酸、能譜分析，結(jié)果表明肽與鋅結(jié)合后，形成了含鋅量較高的物質(zhì)，為鮐魚暗色肉的高值化利用提供了依據(jù)。