李學(xué)學(xué)，曹亞楠，蘇宏娜，黃艷菲，李 瑩，楊正明，蔡曉霞，沈繼秀，劉 圓,7*

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610225

2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106

3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106

4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610225

5.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225

6.青藏高原民族藥用資源保護(hù)與利用國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225

7.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041

西南委陵菜PotentillafulgensWall.ex Hook.為薔薇科委陵菜屬多年生草本植物，以其干燥根入藥，是彝醫(yī)臨床常用藥材，別名管仲、翻白葉、地檳榔等[1-2]。西南委陵菜始載于《滇南本草》[3]，味苦、澀，性寒；主治血崩、大腸下血、面寒疼。彝醫(yī)臨床將其用于治療胃腸道疾病、痢疾、瘡、風(fēng)濕等[4-5]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)西南委陵菜具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、降血糖等藥理活性[6-9]。雖然西南委陵菜在彝醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛，但云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[2]僅對鑒別、檢查、浸出物做了要求，未有科學(xué)可靠的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)量控制，而質(zhì)量標(biāo)志物是目前評價藥材質(zhì)量的基本方法[10]，現(xiàn)有化學(xué)成分的研究結(jié)果尚不確定西南委陵菜所分離鑒定的成分是否為其提取物的主要成分并保證含量可測性[11-12]，因此，有必要篩選西南委陵菜的質(zhì)量標(biāo)志物，為西南委陵菜藥材質(zhì)量評價和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究通過UPLC-Q-Exactive-MS/MS 法定性分析西南委陵菜的化學(xué)成分組成，篩選質(zhì)量標(biāo)志物；采用HPLC 法建立不同批次西南委陵菜的指紋圖譜，定量分析質(zhì)量標(biāo)志物的含量；進(jìn)而通過主成分分析（PCA）和TOPSIS 分析綜合評價西南委陵菜藥材質(zhì)量，為西南委陵菜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高、質(zhì)量評價系統(tǒng)研究提供科學(xué)依據(jù)，同時為其他民族藥材的質(zhì)量評價研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑

ThermoFisher Scientific Vanquish 超高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；ThermoFisher Scientific Q Exactive Focus 超高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；安捷倫1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；KQ-259DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER AE240 電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

表兒茶素（批號MUST-20042012）、沒食子酸（批號 MUST-20032802）、紫云英苷（批號MUST-15080515）購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司；兒茶素（批號15080412）購自成都康邦生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；乙腈、甲醇、甲酸、磷酸（色譜純，DiKMA）；甲醇（分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司）；蒸餾水（屈臣氏）。

1.2 材料

西南委陵菜藥材均由課題組和四川省彝醫(yī)藥非物質(zhì)文化繼承人郝應(yīng)芬（阿子阿越）帶隊(duì)自采于四川省涼山州和攀枝花米易縣等地，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定為西南委陵菜P.fulgensWall.ex Hook.，標(biāo)本保存于西南民族大學(xué)民族藥材標(biāo)本館，樣品信息見表1。

表1 西南委陵菜藥材采集信息Table 1 Collection information of P.fulgens

2 方法

2.1 UPLC-Q-Exactive-MS/MS 分析

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters 公司），進(jìn)樣量2 μL，柱溫35 ℃，體積流量0.2 mL/min。檢測波長210～400 nm。流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3 min，6%A；3～10 min，6%～9%A；10～25 min，9%～10%A；25～34 min，10%～13%A；34～37 min，13%A；37～45 min，13%～15%A；45～50 min，15%～18%A；50～55 min，18%～20%A；55～60 min，20%～40%A。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI 源，負(fù)離子檢測模式：輔助氣體積流量 10 mL/min；輔助氣溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；錐孔氣流量40 L/h；噴霧電壓3.5 kV；掃描模式：Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1000。

2.1.3 對照品溶液的制備 分別精密稱量表兒茶素、兒茶素、沒食子酸、紫云英苷于25 mL 量瓶中，用50%甲醇溶解稀釋至刻度，得表兒茶素質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL，兒茶素質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL，沒食子酸質(zhì)量濃度0.40 mg/mL，紫云英苷質(zhì)量濃度0.40 mg/mL，即為混合對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取S10 樣品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流90 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得分析樣品。

2.2 HPLC 指紋圖譜及含量測定

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0～15 min，2%～10% A；15～25 min，10%～15% A；25～45 min，15%～20%A；45～65 min，20%～22% A；檢測波長為270 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取表兒茶素對照品適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶內(nèi)，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得1.022 mg/mL 對照品儲備。精密量取上述儲備液適量，用50%甲醇依次稀釋，得表兒茶素質(zhì)量濃度分別為0.204 4、0.153 3、0.102 2、0.051 1、0.020 4 mg/mL 系列混合對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 所有待測樣品按“2.1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備。

2.2.4 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確吸取一定量的對照品溶液，用50%甲醇稀釋至不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性分析，得回歸方程Y＝4 962.2X＋4.036 6，線性范圍0.204 4～2.044 0 mg/mL，r＝0.999 8。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取適量“2.2.2”項(xiàng)配制的對照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。結(jié)果顯示表兒茶素峰面積的RSD 值為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（S5）6 份，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得供試品溶液表兒茶素平均質(zhì)量濃度分別為10.43 mg/g，RSD 為1.48 %，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取“2.2.2”項(xiàng)下配好的對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，在放置0、6、12、18、24 h 后進(jìn)樣測定，根據(jù)表兒茶素峰面積計算其RSD 值。其RSD 結(jié)果為0.78%，說明供試品溶液在制備后24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品（S5）按照“2.1.4”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按照供試品濃度-對照品大致1∶1 的比例分別加入表兒茶素。表兒茶素的加樣回收率為93.51%，RSD 值為1.36%。

2.3 數(shù)據(jù)分析

利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版”對27 批西南委陵菜樣品進(jìn)行相似度分析，并生成西南委陵菜指紋圖譜。利用SPSS20.0軟件對西南委陵菜進(jìn)行TOPSIS 分析；以表兒茶素含量和采集地海拔為變量，對兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 UPLC-Q-Exactive-MS/MS 定性分析

對S10 號樣品進(jìn)行UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析，負(fù)離子模式基峰色譜圖見圖1。通過與對照品比對、對照品質(zhì)譜裂解規(guī)律結(jié)合SciFinder 等數(shù)據(jù)庫、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對的方式，從樣品中指認(rèn)了48 個化合物，包括原花青素類34 個、黃酮類12 個、酚類1 個、鞣質(zhì)類1 個，結(jié)果見表2。

圖1 樣品(S10)負(fù)離子模式基峰色譜圖Fig.1 Negative ion mode base peak chromatogram of sample(S10)

表2 西南委陵菜UPLC-Q-Exactive-MS/MS 化學(xué)成分鑒定結(jié)果Table 2 Results of UPLC-Q-Exactive-MS/MS identification of chemical constituents from P.fulgens

通過提取離子的方式與對照品比對確認(rèn)的4 個成分，保留時間2.96、13.93、22.83、54.83 min 依次為沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、紫云英苷。

續(xù)表2

以兒茶素、表兒茶素、阿福豆素聚合形成的原花青素為西南委陵菜樣品中的主要成分，以保留時間為12.61 min 的procyanidin B 為例說明解析過程。可見其準(zhǔn)分子離子m/z577.135 0[M-H]-，預(yù)測分子式C30H26O12，不飽和度18。二級質(zhì)譜中，與對照品兒茶素的質(zhì)譜裂解規(guī)律對比可知，m/z289.071 5為兒茶素特征峰，結(jié)合兒茶素對照品的特征碎片離子m/z245.081 2、231.028 3、203.070 1、187.039 5、179.034 0、151.038 9、137.023 1、125.023 1、109.028 2，故推測該化合物結(jié)構(gòu)母核為兒茶素。二級質(zhì)譜中，m/z577.135 0 與m/z289.071 5 相差288.063 5（C15H14O6），元素組成與脫氫兒茶素一致，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[18-19]，故推測該化合物可能是procyanidin B。黃酮類成分為西南委陵菜樣品中的另一類主要成分，除了通過對照品比對的3 個黃酮類成分，還指認(rèn)了9個黃酮類成分，以保留時間23.46 min 的化合物為例，說明黃酮類成分的解析過程。負(fù)離子模式一級質(zhì)譜顯示準(zhǔn)分子離子m/z449.108 6[M-H]-，預(yù)測分子式為C21H22O11，不飽和度為11。二級質(zhì)譜中，m/z287.055 6（C15H11O6）與m/z449.108 6 相差162.053 0（C6H10O5），推測由準(zhǔn)分子離子丟失葡萄糖基產(chǎn)生；m/z287.055 6 丟失1 分子水，產(chǎn)生m/z269.045 2[M-H-glu-H2O]，說明化合物含有羥基；m/z287.055 6丟失羰基產(chǎn)生m/z259.060 7[M-H-glu-CO]，說明化合物含有羰基；m/z287.055 6 脫去CO2產(chǎn)生m/z243.067 0[M-H-glu-CO2]；特征離子m/z178.997 9（1-2A-）和中性丟失108.057 7（1-2B）表明，該化合物為黃酮，且B環(huán)上有1個羥基；m/z107.012 1（0,4A-）表明A 環(huán)有2 個羥基。綜上推測，該化合物為二氫山柰酚葡萄糖苷。液質(zhì)分析研究結(jié)果表明，樣品基峰色譜圖中峰高較高的峰為表兒茶素、兒茶素聚合物、兒茶素和阿福豆素的聚合物，然而除了表兒茶素，其他成分也均與兒茶素或表兒茶素相關(guān)，從質(zhì)量標(biāo)志物的可測性來考慮，表兒茶素含量較高、在HPLC 中分離度好、色譜圖中峰純度高，故西南委陵菜的質(zhì)量評價研究可初步篩選表兒茶素作為質(zhì)量標(biāo)志物，結(jié)合指紋圖譜和多元統(tǒng)計分析，可科學(xué)評價西南委陵菜藥材質(zhì)量。

3.2 HPLC 指紋圖譜研究及含量測定

3.2.1 指紋圖譜建立與相似度分析 按“2.1.4”項(xiàng)下方法分別制備27 批西南委陵菜供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別記錄其HPLC 色譜圖。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 版）對西南委陵菜樣品指紋圖譜進(jìn)行全譜峰匹配，設(shè)定時間寬度為0.2，以S15藥材HPLC 圖譜作為參照圖譜進(jìn)行匹配，按照中位數(shù)法生成西南委陵菜對照指紋圖譜（圖2）。經(jīng)色譜峰匹配，西南委陵菜對照指紋圖譜有10 個共有峰，共有峰的峰面積均占總峰面積95%以上，符合特征圖譜的技術(shù)要求，指認(rèn)出6 號峰為表兒茶素。對27批西南委陵菜藥材指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，結(jié)果西南委陵菜相似度在0.960～0.998，見表3。表明不同產(chǎn)地西南委陵菜指紋圖譜相似度較高，藥材質(zhì)量較均一和穩(wěn)定。

圖2 西南委陵菜對照圖譜(A)與樣品指紋圖譜(B)Fig.2 Fingerprint map of control(A)and samples of P.fulgens(B)

表3 西南委陵菜指紋圖譜相似度Table 3 Fingerprint similarity table

3.2.2 含量測定結(jié)果 按照“2.2.1”項(xiàng)下條件測定西南委陵菜樣品，每個樣品平行測定3 次，從結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地和不同批次之間含量有差異。對27 批西南委陵菜藥材中的表兒茶素含量和采集地海拔進(jìn)行相關(guān)性分析，表兒茶素含量測定結(jié)果見表4，由此發(fā)現(xiàn)表兒茶素含量和海拔呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.705，P＜0.01），表兒茶素含量隨海拔高度變化見分析熱圖（圖3），熱圖結(jié)果進(jìn)一步表明，隨海拔的升高，西南委陵菜藥材中表兒茶素含量升高，說明表兒茶素含量受海拔高度影響。

表4 表兒茶素測定結(jié)果Table 4 Results of epicatechin determination

表4 表兒茶素測定結(jié)果Table 4 Results of epicatechin determination

編號 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g-1)編號 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g-1)S1 8.76±0.08 S15 6.47±0.03 S2 9.66±0.04 S16 16.50±0.03 S3 10.77±0.24 S17 9.88±0.10 S4 10.58±0.31 S18 8.76±0.79 S5 10.55±0.13 S19 8.32±0.33 S6 9.95±0.07 S20 6.78±0.02 S7 9.43±0.04 S21 6.01±0.05 S8 11.48±0.05 S22 14.42±0.08 S9 11.53±0.06 S23 9.11±0.22 S10 10.51±0.49 S24 20.22±1.59 S11 11.48±0.07 S25 6.75±0.07 S12 10.27±0.14 S26 16.55±0.08 S13 10.76±0.13 S27 8.28±0.11 S14 12.13±0.23

圖3 表兒茶素含量隨海拔高度變化分析熱圖Fig.3 Heat map analysis of epicatechin content with altitude

3.2.3 主成分分析 由于指紋的變量較多，PCA 被用于數(shù)據(jù)壓縮和樣本分類的信息提取。為了全面評價基于指紋圖譜數(shù)據(jù)的27 批西南委陵菜樣本的相似性和差異性，用檢測到的10 個共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，利用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行主成分分析，計算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻(xiàn)率（表5），以特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前3 個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為89.691%（＞80%），說明前3 個主成分反映了西南委陵菜中所有峰的情況，基本上可以表征西南委陵菜的HPLC 指紋圖譜特征。同時，本研究對各主成分的權(quán)重比例與各共有峰對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（表6）進(jìn)行分析。結(jié)果表明，指認(rèn)出的表兒茶素和其他未知成分均作為主要信息參與了西南委陵菜的質(zhì)量表達(dá)，其中第1 主成分主要反映了色譜峰3、6（表兒茶素）、7、8、9、10 的信息表達(dá)，第2 主成分主要反映了色譜峰1、4 的信息表達(dá)，第3 主成分主要反映了色譜峰5 的信息表達(dá)。

表5 西南委陵菜指紋圖譜主成分信息和方差貢獻(xiàn)率Table 5 Principal component information and variance contribution rate of fingerprint of P.fulgens

表6 主要因子載荷矩陣表Table 6 Main factor load matrix table

3.2.4 TOPSIS 分析 將檢測到的10 個共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，利用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行Zscore 標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行TOPSIS 分析，以分析和比較不同產(chǎn)地西南委陵菜的質(zhì)量差異，結(jié)果如表7所示。由表7 可知，S11 的質(zhì)量最佳，S9 的質(zhì)量最次，指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)可作為西南委陵菜藥材質(zhì)量評價的依據(jù)，TOPSIS 分析可用于西南委陵菜的質(zhì)量評價。

表7 TOPSIS 評價結(jié)果Table 7 TOPSIS evaluation results

4 討論

本研究通過UPLC-Q-Exactive-MS/MS 研究，詳細(xì)分析了西南委陵菜藥材中的化學(xué)成分，共指認(rèn)48個化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)原花青素類成分和黃酮類成分為西南委陵菜的主要成分，此外還有含有酚類和鞣質(zhì)類成分，研究結(jié)果較Choudhary 等[20]通過NMR 和LC-MS/MS 發(fā)現(xiàn)鑒定的西南委陵菜25 個化學(xué)成分有了更多發(fā)現(xiàn)。通過液質(zhì)分析初步篩選了含量高、可測性好、原花青素類成分基本組成單元的表兒茶素作為質(zhì)量標(biāo)志物，對西南委陵菜藥材進(jìn)行質(zhì)量評價研究?，F(xiàn)代藥理研究表明，表兒茶素具有抗炎、抗菌、抗氧化、調(diào)脂降糖、防治心血管疾病、提高免疫力等廣泛的生理活性[21]，與西南委陵菜藥理活性具有相關(guān)性，因此，選擇表兒茶素作為西南委陵菜的質(zhì)量標(biāo)志物具有一定科學(xué)意義。

通過指紋圖譜的定性定量分析，結(jié)合多元統(tǒng)計分析綜合評價彝藥材西南委陵菜的質(zhì)量評價研究方法，初步闡明了西南委陵菜藥材的化學(xué)成分，篩選了與生理活性具有一定相關(guān)性、可測性好的成分作為質(zhì)量標(biāo)志物，綜合評價西南委陵菜藥材，研究結(jié)果為西南委陵菜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善、科學(xué)合理用藥提供科學(xué)依據(jù)，同時為其他研究基礎(chǔ)薄弱的民族藥材質(zhì)量評價研究提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突