李豐茂,楊 浩,2,傅玉凡,陳曉玲,唐云明
1.西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/重慶市甘薯工程研究中心,重慶 400715;2.重慶市潼南中學(xué)校,重慶 潼南 402660;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081
多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO,EC 1.10.3.1)是一類(lèi)由核基因編碼含銅質(zhì)體能催化酚類(lèi)物質(zhì)氧化的金屬酶.最早由Yoshida在研究漆樹(shù)液汁凝固現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種活性物質(zhì),隨后Keilin和Mann 報(bào)道了多酚氧化酶的分離純化方法,公布了多酚氧化酶的理化性質(zhì)及酶學(xué)特征[1],開(kāi)啟了對(duì)多酚氧化酶的系統(tǒng)性研究.國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合命名委員會(huì)根據(jù)酶的催化特性將PPO 分為兩大類(lèi):1) 單酚酶(EC 1.14.18.1);2) 二酚酶(EC 1.10.3),包括兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)和漆酶(EC 1.10.3.2)[2].目前在植物體中多酚氧化酶主要以可溶性多酚氧化酶(soluble polyphenol oxidase,sPPO)和膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶(membrane-bound polyphenol oxidase,mPPO)兩種形式存在,其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中[3].多酚氧化酶參與植物光合作用[4]、逆境脅迫[5]、抗病蟲(chóng)害[6]、花色形成[7]、生物組織修復(fù)[8],對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起到了積極的作用.目前,該酶在茶葉發(fā)酵[9]、造紙工業(yè)[10]、污水處理[11]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.
甘薯(Ipomoeabatatas(L.) Lam)又名紅薯,是我國(guó)主要糧食經(jīng)濟(jì)作物之一,產(chǎn)量居全球之首,而西南地區(qū)甘薯種植面積居全國(guó)第一.據(jù)研究報(bào)道,甘薯潛在的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值非常高,甘薯富含淀粉[12]、蛋白質(zhì)、膳食纖維[13]、維生素[14]、酚類(lèi)[15]、黃酮[16]、胡蘿卜素[17],具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗心血管疾病和抗腫瘤等藥理作用[18-20];而在工業(yè)能源方面,甘薯淀粉作為原料發(fā)酵和生產(chǎn)燃料酒精和酒精汽油[21],以緩解目前的能源危機(jī).近年來(lái),鮮切甘薯因營(yíng)養(yǎng)豐富、便捷以及高利用率等特點(diǎn)迅速得到廣大消費(fèi)者的青睞[22].但是鮮切甘薯在生產(chǎn)過(guò)程中容易受到機(jī)械力的傷害,多酚氧化酶與酚類(lèi)化合物原本的細(xì)胞區(qū)域被破壞,在氧氣作用下甘薯表面生成棕色或黑色聚合物導(dǎo)致甘薯表面出現(xiàn)褐變,褐變不僅會(huì)影響甘薯外觀,降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,還能導(dǎo)致甘薯變質(zhì)腐爛和浪費(fèi),從而制約著甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.目前有研究顯示PPO是導(dǎo)致果蔬褐變的主要物質(zhì)[22-23],而mPPO是甘薯中主要的多酚氧化酶,當(dāng)甘薯組織受到損傷后,其編碼基因被誘導(dǎo)表達(dá),mPPO活性逐漸增加,加速果蔬褐變腐爛,然而有關(guān)mPPO導(dǎo)致褐變的分子機(jī)制尚不明確,因此本研究主要利用同源建模和分子對(duì)接手段快速得到mPPO三維結(jié)構(gòu)以及與底物結(jié)合的潛在位點(diǎn),為篩選和設(shè)計(jì)抑制劑以及深入理解褐變機(jī)理提供了新的理論基礎(chǔ).
生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù),如Uniprot(Universal Protein:https://www.uniprot.org/),PDB(Protein Date Bank:https://www.rcsb.org/);在線(xiàn)軟件,如SWISS-MODELL,PISPRED,PROCHECK,ERRAT,SYBYL-X 2.0;本課題研究的甘薯膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶氨基酸序列來(lái)自Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào):Q9MB14).
1.2.1 同源建模
先從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中下載甘薯膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶氨基酸序列,然后在蛋白質(zhì)自動(dòng)同源建模軟件SWISS-MODELL中輸入相應(yīng)序列構(gòu)建甘薯mPPO三維結(jié)構(gòu),通過(guò)建模反饋信息,獲得了4個(gè)模板和1個(gè)目標(biāo)模型(即mPPO三維結(jié)構(gòu)),并將mPPO的三維結(jié)構(gòu)保存為PDB格式以用于后續(xù)分子對(duì)接分析.
1.2.2 模型評(píng)估
利用在線(xiàn)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)評(píng)估軟件PROCHECK和ERRAT對(duì)所獲得的甘薯mPPO模型進(jìn)行評(píng)估以及對(duì)氨基酸殘基(aa)整體性進(jìn)行分析.
1.2.3 分子對(duì)接分析
從TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://tcmspw.com/molecule.php?qn=415)下載底物鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、表兒茶素等酚類(lèi)化合物3D結(jié)構(gòu),并保存為mol2格式,然后利用分子對(duì)接軟件SYBYL-X 2.0以銅質(zhì)體區(qū)域?yàn)閷?duì)接位點(diǎn),采用半柔性對(duì)接方式進(jìn)行分子對(duì)接分析,探究mPPO與酚類(lèi)化合物的潛在結(jié)合位點(diǎn)以及相互作用方式[24].
同源建模是利用具有同源性的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)作為模板,對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).由于蛋白中的三維結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)更加保守,氨基酸的突變和替換通常發(fā)生在蛋白質(zhì)表面回折區(qū)域,蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)、疏水核心結(jié)構(gòu)受序列變異影響很小.因此用同源建模預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是比較可靠、快速的方法.任何一對(duì)蛋白質(zhì),只要序列長(zhǎng)度達(dá)到一定程度,序列相似性超過(guò)30%,則具有相似的三維結(jié)構(gòu)[25].由于甘薯mPPO研究仍處于轉(zhuǎn)錄水平,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中也無(wú)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息.利用SWISS-MODELL對(duì)甘薯mPPO同源建模,一共獲得了4個(gè)多酚氧化酶三維結(jié)構(gòu)模板,其在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)分別為6ELS(Latent apple tyrosinase),4Z11(Latent aurone polyphenol oxidase),6R83(squid hemocyanin),4D87(Bacillus megaterium tyrosinase),氨基酸序列相似性分別為54.49%,44.02%,21.23%,23.57%.由于序列相似性越高,獲得的三維結(jié)構(gòu)越可靠,因此選取了序列相似性最高的6ELS作為模板建模(圖1),使獲得的模型最佳,其甘薯mPPO模型如圖2.
圖1 甘薯mPPO與模板6ELS序列比對(duì)
圖2 模板6ELS和甘薯mPPO三維結(jié)構(gòu)
通過(guò)甘薯mPPO與模板6ELS序列比對(duì)以及利用PISPRED對(duì)mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)含有18個(gè)α-螺旋、9個(gè)β-轉(zhuǎn)角、18個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(圖3),其1~50 aa和51~88 aa為2段跨膜信號(hào)序列,說(shuō)明葉綠體內(nèi)的mPPO會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)移肽轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用.結(jié)合圖2可以看出甘薯mPPO活性區(qū)域含有3個(gè)CuA和3個(gè)CuB,并被His178,His199,His208,His330,His334,His366包圍.Cys99→Cys116,Cys115→Cys179,Cys182→Cys199組成了mPPO鏈間二硫鍵穩(wěn)定著酶的結(jié)構(gòu).
圖3 甘薯mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)
將SWISS-MODEL建模后序列相似性最高的mPPO模型通過(guò)PROHECK和ERRAT進(jìn)行評(píng)估,圖4(a)顯示了mPPO拉式構(gòu)象圖中有92%殘基位于允許區(qū)[A,B,L],7.2%殘基位于最大允許區(qū)域[a,b,l,p],0.5%殘基位于扭轉(zhuǎn)角禁止區(qū)域[~a,~b,~l,~p],一般認(rèn)為允許區(qū)域超過(guò)90%,模型中蛋白質(zhì)殘基的二面角都在合理的區(qū)間,則符合立體化學(xué)能量規(guī)則,表明其模型的可靠性較高[26].圖4(b),圖4(c)顯示mPPO的 QMEAN為0.67(QMEAN值在 0~1 之間,數(shù)值越大,獲得理想模型的可能性越大[27]),且Z值均大于2,反映出模型質(zhì)量可靠.ERRAT對(duì)mPPO整體三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估,有95.15%的殘基在95%誤差值以外,綜上所述甘薯mPPO模型合格(圖4d),可以用于后續(xù)分析計(jì)算.
圖4 mPPO模型評(píng)估
分子對(duì)接是在分子水平上通過(guò)化學(xué)計(jì)算研究分子的幾何結(jié)構(gòu)、分子間相互作用的方法,其理論基礎(chǔ)來(lái)源于E.Fisher 提出的“鎖鑰模型”,該模型描述了酶與底物專(zhuān)一性的結(jié)合,但存在一定局限性.Koshland提出了“誘導(dǎo)契合原理”,該理論認(rèn)為受體和配體在相互結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[28].利用分子模擬軟件SYBYLX-2.0分別將鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、表兒茶素與mPPO進(jìn)行分子對(duì)接,在對(duì)接過(guò)程中蛋白受體和小分子配體的構(gòu)象是可柔性可變化的,以滿(mǎn)足空間形狀和能量匹配.結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活性位點(diǎn)附近,Gln197,Leu212,Phe204,His365,Phe362,Phe205,Arg209,Thr331以氫鍵的方式與5種酚類(lèi)化合物結(jié)合(表1),說(shuō)明這幾個(gè)殘基都是潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖5).
表1 甘薯mPPO與不同底物結(jié)合位點(diǎn)
圖5 甘薯mPPO與酚類(lèi)化合物分子對(duì)接結(jié)果
蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)承擔(dān)者,其具有的功能很大程度上與自身的空間結(jié)構(gòu)有關(guān),因此,對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究有助于了解其工作機(jī)理.目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)量不斷增加,但是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定仍然落后于基因測(cè)序[29].X-射線(xiàn)晶體衍射和核磁共振技術(shù)是獲取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的重要手段,但蛋白質(zhì)晶體表達(dá)、提純與結(jié)晶增加了測(cè)定的難度.為了加快蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定速度,發(fā)展理論蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)序方法顯得尤為重要.因此,利用蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析不僅可以快速了解、認(rèn)識(shí)目標(biāo)蛋白質(zhì),還可以快速、高效地解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,以研究蛋白質(zhì)與配體的相互作用及其分子機(jī)制.
通過(guò)分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn),mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)含有18個(gè)α-螺旋、9個(gè)β-轉(zhuǎn)角、18個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲,其中1~50 aa,51~88 aa為2段跨膜信號(hào)序列,這與茄子(81 aa),蘋(píng)果(89 aa),土豆(86 aa),番茄(99 aa)mPPO跨膜轉(zhuǎn)移肽不同[30],植物mPPO N-端轉(zhuǎn)移肽差異可能與不同物種mPPO轉(zhuǎn)運(yùn)方式有關(guān).銅質(zhì)體區(qū)域是甘薯mPPO活性部位,受His178,His199,His208,His330,His334,His366包圍,而在單亞基甘薯多酚氧化酶中,只存在單個(gè)銅質(zhì)體,并被His240,His244,His274包圍,葡萄PPO中活性區(qū)域受His211,His220,His342,His346,His375包圍[31],這表明PPO活性區(qū)域差異與所編碼的基因以及所在區(qū)域的執(zhí)行功能有關(guān).
分子對(duì)接結(jié)果顯示,甘薯mPPO中Gln197,Leu212,Phe204,His365,Phe362,Phe205,Arg209,Thr331等殘基與鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、表兒茶素相互作用,表明甘薯mPPO不僅催化區(qū)域廣,而且催化底物種類(lèi)多,而甘薯組織受到機(jī)械傷害時(shí),能與各種酚類(lèi)物質(zhì)反應(yīng),驗(yàn)證了多酚氧化酶是導(dǎo)致果蔬褐變的主要氧化酶.氫鍵驅(qū)動(dòng)mPPO和底物結(jié)合,正是由于他們之間的這種分子相互作用,使得甘薯mPPO與底物結(jié)合的親和力高,促進(jìn)了甘薯mPPO催化效率.因此,可以通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)抑制劑屏蔽掉相關(guān)氨基酸殘基上的官能團(tuán),削弱與酶的結(jié)合能力,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以通過(guò)基因敲除或者RNA干擾技術(shù)培育無(wú)褐變甘薯品種,擴(kuò)大甘薯物種豐富度,降低因褐變?cè)斐傻慕?jīng)濟(jì)損失.
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)挖掘甘薯mPPO相關(guān)數(shù)據(jù)掌握了其結(jié)構(gòu)特征以及潛在催化靶點(diǎn),為進(jìn)一步揭示甘薯褐變分子機(jī)制和篩選高效無(wú)毒害抑制劑提供了新的思路.
西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2021年6期