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      水溶性近紅外Ⅱ區(qū)熒光Ag2Te量子點(diǎn)的合成

      2021-06-29 06:02:08周潔瓊張志凌龐代文田智全
      關(guān)鍵詞:活體水溶性陽離子

      周潔瓊,黃 艷,張志凌,龐代文,田智全

      (武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢 430072)

      量子點(diǎn)(QDs)由于其一元激發(fā)多元發(fā)射、耐光漂和量子產(chǎn)率高等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1~3].近紅外窗口熒光,特別是近紅外Ⅱ區(qū)(NIR-Ⅱ區(qū),1000~1700 nm[4])窗口熒光,在生物組織及血液中的散射和衰減系數(shù)明顯降低,且受生物組織自發(fā)熒光的干擾顯著減弱,因此近紅外Ⅱ區(qū)量子點(diǎn)在活體成像時(shí)具有更深的穿透深度,能極大提高成像信號的信噪比,在活體成像應(yīng)用方面具有明顯的優(yōu)勢[5~7].

      Ⅰ-Ⅵ族量子點(diǎn)作為近紅外量子點(diǎn)家族中的一員,具有帶隙窄和不含有毒重金屬元素等優(yōu)勢,引起了研究者的廣泛關(guān)注.已有研究[8~14]表明,Ⅰ-Ⅵ族量子點(diǎn)生物毒性小,應(yīng)用前景大.Ⅰ-Ⅵ族量子點(diǎn)帶隙分別為:Ag2Te(0.06 eV),Ag2S(0.93 eV),Ag2Se(0.15 eV)[15,16],其中Ag2Te帶隙最窄,說明其熒光發(fā)射波長理論上能調(diào)節(jié)至更長的波段.當(dāng)溫度較低時(shí),Ag2Te 半導(dǎo)體材料表現(xiàn)為單斜相(β-Ag2Te);當(dāng)溫度升高至150 ℃時(shí),則會轉(zhuǎn)化為面心立方相(α-Ag2Te)[17].

      目前,Ag2Te量子點(diǎn)的合成主要有油相合成[18]和水相合成[19]2類方法.油相合成法可以將波長調(diào)至NIR-Ⅱb 區(qū)[20],但是要求嚴(yán)格的無氧條件,需要用到三正辛基膦(TOP)等有毒、價(jià)格昂貴的試劑[8,21,22],且必須經(jīng)過水溶性修飾才能進(jìn)一步應(yīng)用.目前,水溶性Ag2Te量子點(diǎn)的研究較少.Yang等[23]采用多齒巰基為配體,制得發(fā)射波長為995~1068 nm的Ag2Te量子點(diǎn).Jin等[24]以十二烷胺為配體制備Ag2Te量子點(diǎn),所得產(chǎn)物發(fā)射波長的調(diào)節(jié)范圍為930~1084 nm.Dong等[25]通過牛血清白蛋白生物礦化策略制備了熒光發(fā)射波長為1080 nm的多功能Ag2Te量子點(diǎn),用于CT成像引導(dǎo)的腫瘤光熱治療.Chen等[26]利用陽離子交換法制備了水溶性Ag2Te量子點(diǎn),但這是一種間接的合成方法,其過程較為復(fù)雜.然而,以上研究都是通過包覆殼層的方法來提高量子產(chǎn)率,不可避免地會增加其粒徑,從而限制其在生物體系中的進(jìn)一步應(yīng)用.綜上所述,水溶性Ag2Te 量子點(diǎn)的直接合成還處于萌芽階段,且發(fā)射波長在1100 nm 以下.因此,開展直接合成熒光發(fā)射波長更長的水溶性Ag2Te量子點(diǎn)的研究具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.本文在25 ℃及大氣氛圍條件下,以硝酸銀為銀源,N-乙酰-L-半胱氨酸為配體,利用硼氫化鈉還原亞碲酸鈉得到碲源,結(jié)合陽離子處理策略,簡單、便捷地制備了發(fā)射波長為1160 nm的水溶性Ag2Te量子點(diǎn)(Scheme 1),其量子產(chǎn)率高達(dá)8.0%(以IR26染料為參比),且該量子點(diǎn)具有良好的生物相容性,可用于生物體內(nèi)活體成像.

      Scheme 1 Strategy for preparing Ag2Te QDs with high quantum yield by cation handled

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 試劑與儀器

      硝酸銀(AgNO3,純度99.8%)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,純度99%)和亞碲酸鈉(Na2TeO3,純度99.9%)購自Aladdin公司;硼氫化鈉(NaBH4)、氫氧化鈉(NaOH)、濃硝酸(HNO3)、1,2-二氯乙烷(DCE)和雙氧水(H2O2)均為分析純,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)公司;IR26染料(C40H30Cl2O4S2)購自Extion 公司;吲哚菁綠(ICG,C43H47N2NaO6S2,純度90%)購自Sigma Aldrich公司.以上試劑均直接使用,未經(jīng)過進(jìn)一步純化;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率18 MΩ·cm).

      透射電子顯微照片和高分辨透射電子顯微照片通過JEOL 公司JEM2100-JEOL 型透射電子顯微鏡(TEM,200 kV)得到;采用Nano ZS ZEN3600型納米粒度及表面電位分析儀(Malvern公司)測量材料的水合粒徑;利用D8型X射線衍射儀(XRD,Bruker AXS公司)獲得元素的X射線衍射圖譜;XPS圖譜通過ESCALAB250Xi 型X 射線光電子能譜儀(XPS,Thermo Fisher Scientific 公司)表征得到;通過IRIS Intrepid II XSP型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES,Thermo Elemental公司)對元素含量進(jìn)行定量分析;采用UV-3600型紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(日本Shimadzu 公司)和Fluorolog-3型熒光分光光度計(jì)(HORIBA Jobin Yvon 公司)分別測量紫外-可見-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜;利用配備了OMA-V 型近紅外檢測器(InGaAs,Princeton 公司)的10×Mitutoyo Plan Apo 型近紅外Ⅱ區(qū)小動物活體成像儀(Edmund Optics 公司)對小鼠或者材料進(jìn)行近紅外熒光成像;iS50 型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR),美國Nicolet公司.

      1.2 實(shí)驗(yàn)部分

      1.2.1 水溶性NIR-Ⅱ區(qū)Ag2Te量子點(diǎn)的合成 在10.0 mL反應(yīng)體系中,先加入100 μL 0.624 mol/L 硝酸銀溶液和500 μL 0.150 mol/LN-乙酰-L-半胱氨酸溶液,攪拌后加入150 μL 1.00 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,得到澄清透明溶液,再依次加入500 μL 0.0620 mol/L 亞碲酸鈉溶液和0.0013 g硼氫化鈉,攪拌后得到棕黑色的溶液.

      1.2.2 陽離子處理 按摩爾比為1∶1.25 將硝酸銀溶液與N-乙酰-L-半胱氨酸溶液混合,調(diào)節(jié)pH 至7~8,得到澄清透明溶液.將上述溶液滴入量子點(diǎn)溶液中,振蕩.

      1.2.3 量子點(diǎn)的洗滌與保存 先使用220 nm 尼龍水系濾頭過濾除去灰塵等雜質(zhì),再用10 kDa 超濾管超濾洗滌量子點(diǎn),并將純化的量子點(diǎn)保存在4 ℃低溫環(huán)境中,待用.

      2 結(jié)果與討論

      2.1 Ag2Te QDs的形貌及結(jié)構(gòu)

      對最終產(chǎn)物進(jìn)行了一系列表征實(shí)驗(yàn).TEM和HRTEM照片如圖1所示,從TEM照片[圖1(A)]可以看出,產(chǎn)物形狀為球形,粒徑分布均勻;由HRTEM照片[圖1(B)]可觀察到材料明顯的晶格,晶格間距為0.196 nm,與單斜相Ag2Te(2ˉ21)晶面吻合.

      Fig.1 TEM(A)and HRTEM(B)images of Ag2Te QDs

      圖2為產(chǎn)物的粒徑統(tǒng)計(jì)圖,通過統(tǒng)計(jì)250個顆粒的粒徑,得出其平均粒徑為(1.6±0.4)nm.利用納米粒度分析儀測得產(chǎn)物的水合粒徑為4.3 nm(圖3),結(jié)合統(tǒng)計(jì)得出的產(chǎn)物的平均粒徑,說明產(chǎn)物具有超小粒徑.量子點(diǎn)的X 射線衍射譜圖如圖4 所示,雖然未觀察到明顯的衍射峰信號,但仍可看出其衍射譜圖與單斜相β-Ag2Te晶體(JCPDS 81-1820)基本吻合,與已報(bào)道的銀系(Ag2X,X=S,Se,Te)量子點(diǎn)的X 射線衍射表征結(jié)果一致[27].

      Fig.2 Size distribution of Ag2Te QDs

      Fig.3 Hydrodynamic diameter characterization of QDs

      Fig.4 Powder XRD pattern of QDs

      利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀和X 射線光電子能譜儀分析了產(chǎn)物的元素組成.圖5為量子點(diǎn)的XPS譜圖,以C1s的結(jié)合能(284.8 eV)為基準(zhǔn),對各元素的結(jié)合能進(jìn)行校準(zhǔn).通過對樣品進(jìn)行全掃描可得到全譜圖,根據(jù)圖5(A)所示結(jié)合能的數(shù)值可以判斷產(chǎn)物中含有Ag,Te,S,C,O和N元素.再對樣品進(jìn)行窄區(qū)掃描,得到XPS高分辨譜圖,如圖5(B)~(E)所示,通過對比結(jié)合能數(shù)值,并結(jié)合自旋軌道偶合分裂譜線的特點(diǎn)來判斷元素的價(jià)態(tài)和化學(xué)環(huán)境.其中,373.9和367.8 eV處的能譜峰分別歸屬于+1價(jià)Ag元素3d3/2和3d5/2的特征譜線[圖5(B)],582.6和572.3 eV處的能譜峰分別歸屬于-2價(jià)Te元素3d3/2和3d5/2的特征譜線[圖5(C)],說明Ag和Te分別以+1價(jià)和-2價(jià)的形式存在[8,21].由于游離巰基的結(jié)合能約為164 eV[28~30],因此162.1和161.2 eV處的能譜峰可分別歸屬于硫與金屬鍵合后S2p1/2和S2p3/2的特征譜線[圖5(D)],這說明產(chǎn)物是以NAC為配體,并且NAC中的巰基是與銀進(jìn)行配位的.C1s的結(jié)合能可擬合成2 個峰,分別為284.8 和287.9 eV[圖5(E)].其中,284.8 eV 處的峰歸屬于亞甲基中的碳元素,287.9 eV處的峰歸屬為C=O中的碳元素[13,31],這說明NAC中的羧基是裸露的,因此產(chǎn)物可以穩(wěn)定地分散于水溶液中.此外,利用ICP-AES對元素含量進(jìn)行了定量分析,結(jié)果表明,經(jīng)陽離子處理前后,Ag/Te物質(zhì)的量之比分別為2.7∶1和5.4∶1,說明經(jīng)陽離子處理后Ag含量顯著增加,符合預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.需要指出的是,經(jīng)陽離子處理前后Ag/Te比均高于其化學(xué)計(jì)量數(shù)之比,這可能是由于Ag2Te量子點(diǎn)的粒徑太小,因此比表面積大,其表面大量的銀原子與巰基結(jié)合導(dǎo)致的[32,33].

      Fig.5 XPS survey(A),high-resolution XPS spectra of Ag3d(B),Te3d(C),S2p(D)and C1s(E)of Ag2Te QDs

      圖6給出N-乙酰-L-半胱氨酸配體和產(chǎn)物的紅外光譜.可見二者的紅外光譜存在顯著差別.其中,N-乙酰-L-半胱氨酸在2552 cm-1處有明顯的吸收峰,歸屬為游離巰基的特征吸收峰;而在Ag2Te 量子點(diǎn)中并未出現(xiàn)游離巰基的特征吸收峰,且在1640和1400 cm-1處可觀察到明顯的吸收峰,歸屬于羧酸根的特征吸收峰[11].上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,Ag2Te量子點(diǎn)以N-乙酰-L-半胱氨酸為配體,且配體中的巰基與銀發(fā)生了配位,配體中的羧基是裸露的.這與X射線光電子能譜儀表征結(jié)果相吻合.

      Fig.6 FTIR spectra of NAC(a)and Ag2Te QDs(b)

      2.2 Ag2Te QDs的光學(xué)性質(zhì)

      Fig.7 Normalized fluorescence emission spectra(A),absorption spectra(B) and fluorescence emission spectra(C)of QDs

      對陽離子處理前后產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜與紫外-可見-近紅外吸收光譜進(jìn)行了測定.圖7(A)為產(chǎn)物的歸一化熒光發(fā)射光譜,圖7(B)為產(chǎn)物的紫外-可見-近紅外吸收光譜,圖7(C)為產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜.圖7(A)中,陽離子處理前產(chǎn)物的發(fā)射峰位于1289 nm,經(jīng)陽離子處理后,產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長為1160 nm.圖7(B)中,經(jīng)陽離子處理前后,產(chǎn)物的吸收峰分別位于1026和1013 nm.圖7(C)中,經(jīng)陽離子處理后,產(chǎn)物熒光強(qiáng)度顯著增加,約為處理前的6.2倍.與處理前相比,經(jīng)陽離子處理后產(chǎn)物的吸收峰和發(fā)射峰均出現(xiàn)藍(lán)移,這是因?yàn)殛栯x子的加入鈍化了產(chǎn)物的表面缺陷,抑制了缺陷發(fā)光,從而使光譜發(fā)生藍(lán)移且熒光增強(qiáng)[32,34].圖8(A)為利用近紅外Ⅱ區(qū)小動物活體成像儀獲得的產(chǎn)物近紅外成像圖,圖8(B)是用手機(jī)拍攝的數(shù)碼照片.樣品Ⅰ指陽離子處理前的產(chǎn)物,樣品Ⅱ指陽離子處理后的產(chǎn)物,二者濃度相同.從圖8可以看出,樣品Ⅱ的熒光性能顯著優(yōu)于樣品Ⅰ,與其熒光光譜圖結(jié)果相吻合,說明陽離子處理可增強(qiáng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度.以分散在1,2-二氯乙烷中的IR26染料(量子產(chǎn)率為0.5%[20,26])為參照,測得經(jīng)陽離子處理后產(chǎn)物的量子產(chǎn)率高達(dá)8.0%,高于之前的部分報(bào)道[20,21,26].綜上,所合成產(chǎn)物為粒徑均一且分散性好的超小粒徑Ag2Te量子點(diǎn),具有進(jìn)一步生物應(yīng)用的潛能.

      Fig.8 NIR-ⅡFL image(A)and digital photograph(B)of QDs samples

      2.3 Ag2Te QDs的穩(wěn)定性

      Fig.9 Photostability of Ag2Te QDs(A),stabilities of Ag2Te QDs in PBS and FBS(B),at different temperatures(4 ℃,25 ℃and 37 ℃)(C,D)and in BR buffers with different pH values(pH=2,5,7,9,12)(E,F)

      以50 W汞燈為光源,將Ag2Te量子點(diǎn)和ICG染料共同置于汞燈下照射不同時(shí)間后,分別測定其熒光光譜,重復(fù)3 次,得到Ag2Te 量子點(diǎn)的光照穩(wěn)定性結(jié)果.如圖9(A)所示,相比于ICG 染料,制備的Ag2Te量子點(diǎn)具有良好的光穩(wěn)定性,當(dāng)汞燈照射100 min時(shí),ICG染料的熒光降為原來的約30%,而量子點(diǎn)的熒光則保持原來的86%,說明量子點(diǎn)具有較好的光穩(wěn)定性,與之前報(bào)道的油相合成的Ag2Te 量子點(diǎn)穩(wěn)定性相當(dāng)[8].此外,還考察了制備的Ag2Te量子點(diǎn)在不同介質(zhì)、不同溫度及不同pH值下的穩(wěn)定性.將Ag2Te 量子點(diǎn)分別分散在1×PBS 緩沖液和未稀釋的胎牛血清(FBS)中,結(jié)果如圖9(B)所示,可見Ag2Te 量子點(diǎn)在PBS 緩沖液中有較好的穩(wěn)定性;在未稀釋的胎牛血清中,Ag2Te 量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度為PBS緩沖液中熒光強(qiáng)度的60%,且具有較好的穩(wěn)定性.由于未稀釋的胎牛血清中含有大量的蛋白質(zhì)等物質(zhì),量子點(diǎn)容易被吸附[35],導(dǎo)致量子點(diǎn)團(tuán)聚,熒光強(qiáng)度下降.圖9(C)為將Ag2Te 量子點(diǎn)分別保存于4,25 和37 ℃時(shí)獲得的量子點(diǎn)的初始熒光強(qiáng)度對比圖;圖9(D)為分別將Ag2Te 量子點(diǎn)在4,25 和37 ℃下保存不同時(shí)間獲得的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化圖.可見,將Ag2Te量子點(diǎn)保存于不同溫度時(shí),其初始熒光強(qiáng)度幾乎不變;在不同溫度保存時(shí)間長達(dá)60 h時(shí),Ag2Te量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均無明顯變化,說明量子點(diǎn)在不同溫度下具有良好的穩(wěn)定性.圖9(E)為分別將Ag2Te量子點(diǎn)保存在不同pH值(pH=2,5,7,9,12)的BR緩沖溶液中獲得的量子點(diǎn)初始熒光強(qiáng)度對比圖;圖9(F)為分別將Ag2Te量子點(diǎn)在不同pH值的BR緩沖溶液中保存不同時(shí)間獲得的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化圖.可見,量子點(diǎn)在不同pH值下也具有良好的穩(wěn)定性.將Ag2Te量子點(diǎn)保存在不同pH值的環(huán)境中,初始時(shí)其熒光強(qiáng)度無明顯變化,但是隨著時(shí)間的延長,在酸性較強(qiáng)(pH=2)的環(huán)境中保存60 h時(shí),其熒光強(qiáng)度下降至之前的約80%,這可能是因?yàn)樗嵝暂^強(qiáng)時(shí),量子點(diǎn)易發(fā)生團(tuán)聚,使其熒光強(qiáng)度降低[36].在弱酸性、中性及堿性環(huán)境中保存時(shí),量子點(diǎn)均能較好地保持其熒光.綜上,制備的Ag2Te量子點(diǎn)具有良好的穩(wěn)定性,有利于其進(jìn)一步應(yīng)用.

      2.4 Ag2Te QDs的毒性

      研究表明,不含Cd等重金屬元素的量子點(diǎn)具有較低的生物毒性[37].采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測了Ag2Te量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性.由圖10可見,在5 個不同Ag2Te 量子點(diǎn)濃度(0,27,53,110 和220 nmol/L)下,將MDCK 細(xì)胞與Ag2Te 量子點(diǎn)共孵育48 h 后,細(xì)胞仍具有較好的活性.即使孵育時(shí)間長達(dá)48 h(含Pb量子點(diǎn)孵育時(shí)間通常為12 h[38]),濃度高達(dá)220 nmol/L 時(shí),細(xì)胞仍能維持94%的活性,與其它Ag 系材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近[11],說明合成的Ag2Te 量子點(diǎn)具有良好的生物相容性,有望在生物體系中進(jìn)一步應(yīng)用.

      Fig.10 Cell viabilities of MDCK cells incubated with Ag2Te QDs after cation handled for 48 h at various concentrations(0,27,53,110 and 220 nmol/L)

      2.5 Ag2Te QDs的體內(nèi)近紅外熒光成像

      Fig.11 In vivo NIR-Ⅱfluorescence images after tail vein injection of Ag2Te QDs

      基于水溶性Ag2Te量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光性能,考察了其用于活體內(nèi)近紅外熒光成像的可行性.所用老鼠為6周齡的balb/c雌鼠,通過尾靜脈注射將200 μL 0.069 mmol/L Ag2Te量子點(diǎn)注入小鼠體內(nèi),利用近紅外Ⅱ區(qū)小動物活體成像儀對小鼠成像.圖11(A)為未注射量子點(diǎn)的小鼠成像圖;圖11(B)~(D)為注射量子點(diǎn)后不同方位的小鼠成像圖.可見,小鼠的肝臟[圖11(B)-1和(D)-1]、膀胱[圖11(B)-2]及脾臟[圖11(C)-3 和(D)-3]有明顯的近紅外熒光,并且從背部[圖11(C)]也可觀察到明顯的近紅外熒光,說明Ag2Te量子點(diǎn)的近紅外熒光可以穿透小鼠的整個身體,具有較深的成像深度,能提高成像信噪比[12],有望用于高分辨活體成像.

      3 結(jié) 論

      在室溫下制備了熒光發(fā)射波長為1160 nm 的水溶性Ag2Te 量子點(diǎn),采用的陽離子處理策略可以鈍化量子點(diǎn)的表面缺陷并提高其量子產(chǎn)率;以分散在1,2-二氯乙烷的IR26染料為參照,測得其量子產(chǎn)率為8.0%.CCK-8法和活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ag2Te量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性低、生物相容性好,可用于活體熒光成像.該合成方法條件溫和、易于操作、不涉及有毒有機(jī)試劑,為量子點(diǎn)的合成提供了新思路.在活體成像及納米生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景.

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