豐葉青 姚亞楠 杜娟 楊藝萌 徐玉梅 趙增旗 王建明

摘要 ：本文采用傳統(tǒng)形態(tài)學與分子生物學相結合的方法，對采自山西省窖藏馬鈴薯和薯蕷塊莖中的短體線蟲進行了種類鑒定。結果表明，從馬鈴薯塊莖中分離出的短體線蟲形態(tài)學特征與斯克里布納短體線蟲Pratylenchus scribneri一致，其SSU序列與P.scribneri美國群體相似性達99.8%。從薯蕷塊莖中分離出的短體線蟲形態(tài)學特征與咖啡短體線蟲P.coffeae一致，其ITS序列與P.coffeae浙江群體相似性達98.8%。斯克里布納短體線蟲首次在我國馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)，咖啡短體線蟲首次在山西省薯蕷塊莖中發(fā)現(xiàn)。

關鍵詞 ：山西; 馬鈴薯; 薯蕷; 斯克里布納短體線蟲; 咖啡短體線蟲; 鑒定

中圖分類號：

S 432.45

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020036

Identification of two species of Pratylenchus （Nematoda： Pratylenchidae） from

the tubers of potato and yam in storage in Shanxi province

FENG Yeqing1， YAO Yanan1， DU Juan1， YANG Yimeng1， XU Yumei1*， ZHAO Zengqi1，2， WANG Jianming1

（1. College of Plant Protection， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801， China;

2. Manaaki Whenua-Landcare Research， Auckland 1072， New Zealand）

Abstract

Two species of Pratylenchus， collected from the tubers of potato and yam in storage in Shanxi province， were identified based on morphological and molecular analyses in this study. The results showed that the morphological characteristics of the nematode population extracted from potato tubers were consistent with those of P.scribneri. It had 99.8% nucleotide similarity in SSU gene sequence with an American P.scribneri population. The morphological characteristics of the nematode population extracted from yam tubers were consistent with those of P.coffeae， with a 98.8% nucleotide similarity in ITS gene sequence with a Zhejiang Pcoffeae population. P.scribneri was first reported in potato tubers in China and P.coffeae was first found in yam tubers in Shanxi.

Key words

Shanxi province; potato; yam; Pratylenchus scribneri; Pratylenchus coffeae; identification

短體屬線蟲Pratylenchus Filipjev是一類根部遷移性、內寄生的植物病原線蟲，可引起多種作物的根腐線蟲病，其寄主范圍和地理分布廣泛，對寄主作物具有嚴重的經(jīng)濟危害性[1]，可給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的損失[2]。

目前全球范圍內已報道的短體線蟲有效種為106種[36]，我國報道的有30余種，其中有些種類因缺乏詳細的形態(tài)學或分子生物學數(shù)據(jù)而暫不列為有效種[79]。目前將咖啡短體線蟲P.coffeae、穿刺短體線蟲P.penetrans、傷殘短體線蟲P.vulnus、玉米短體線蟲P.zeae、蒿短體線蟲P.artemisiae和薯蕷短體線蟲P.dioscoreae共6種列為中國種。

2017年-2019年，在對山西省薯類線蟲病害進行調查的過程中，從窖藏馬鈴薯和薯蕷塊莖中各分離到一種短體線蟲。為明確其種類，本文采用了形態(tài)學和分子生物學相結合的方法，對馬鈴薯和薯蕷塊莖中分離到的短體線蟲進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 線蟲樣本的采集和分離

2019年4月自山西省晉中市太谷區(qū)桑梓村（112°37′46″E，37°26′54″N，海拔817 m）采集馬鈴薯Solanum tuberosum和薯蕷Dioscorea polystachya窖藏塊莖樣本，裝入自封袋帶回實驗室。將2種塊莖用自來水沖洗干凈，晾干，切成約1 cm3的小塊，采用淺盤法[10]分離，12 h后收集線蟲。

1.2 線蟲的殺死固定、形態(tài)觀察和測量

挑取若干條線蟲制成臨時玻片，在體視顯微鏡（Motic SMZ-168，中國）下初步觀察其形態(tài)特征。然后用4%甲醛熱殺死固定，采用改進的甘油乙醇法[11]脫水，用脫水后的線蟲制作永久玻片[12]。利用微分干涉光學顯微鏡（Nikon 80i，日本）觀察、拍照并測量。采用de Man公式分析數(shù)據(jù)，并參照Castillo等[13]的方法進行種類鑒定。

1.3 線蟲的DNA提取、PCR擴增測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

線蟲DNA提取采用蛋白酶K法[1415]。

SSU PCR擴增采用2對引物：分別為上游引物1096F（5′-GGTAATTCTGGAGCTAATAC-3′）和下游引物1912R（5′-TTTACGGTCAGAACTAGGG-3′）;上游引物1813F（5′-CTGCGTGAGAGGTGAAAT-3′） 和下游引物2646R（5′-GCTACCTTGTTACGACTTTT-3′）[16]。ITS PCR擴增采用上游引物FerF（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′）和下游引物rDNA2（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[1718]。

20 μL反應體系：2×Easy Taq PCR SuperMix 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。擴增程序：95℃預變性3 min;94℃變性60 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán);最后72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。用Sequencher 5.2.2軟件檢查測序結果并進行序列拼接。將獲得的序列在GenBank中進行同源性比對，采用MrBayes 3.2.7構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用FigTree V 1.4.3軟件讀取結果。

2 結果與分析

通過形態(tài)學和分子生物學特征，將從窖藏馬鈴薯和薯蕷塊莖中分離到的短體線蟲分別鑒定為斯克里布納短體線蟲P.scribneri和咖啡短體線蟲P.coffeae。具體鑒定結果如下：

2.1 斯克里布納短體線蟲Pratylenchus scribneri Steiner in Sherbakoff & Stanley， 1943

2.1.1 形態(tài)特征描述

馬鈴薯塊莖癥狀（圖1a， b）：塊莖表皮有凹陷斑點且皺縮變黑，切開薯塊，皮下組織顆粒狀干腐，內部組織出現(xiàn)腐爛變黑。

雌蟲（圖1）：唇區(qū)稍縊縮，唇環(huán)2條，第1條唇環(huán)比第2條唇環(huán)略窄;口針發(fā)達，基部球高度骨化，圓形。中食道球卵圓形，直徑約占該處體寬的2/3。食道腺腹面覆蓋腸前端，覆蓋長度為30.3（19.4～38.6）μm。神經(jīng)環(huán)距離體前端68.4（60.7～75.6）μm;排泄孔距離體前端85.9（82.6～90.1）μm;半月體在排泄孔前，距離體前端83.4（80.4～87.0）μm;半月小體在半月體后13.5（12.4～14.2）μm處。側線4條。單個卵巢向體前端延伸，受精囊退化，卵圓形或近圓形，內有5～9個精子;后陰子宮囊長27.9（24.8～30.4）μm;陰門橫裂，陰道長8.4（6.9～10.1）μm。尾部錐形或亞圓柱形，尾部有環(huán)紋15～24條，末端無環(huán)紋;側尾腺口位于尾的中前部。

雄蟲：未見。

2.1.2 形態(tài)測計值

測量結果見表1。

1） 本研究所得數(shù)據(jù)為平均值±SD。n： 樣本數(shù); L： 體長; a： 體長與最大體寬之比; b： 體長與體前端至食道與腸連接處的距離之比; b′： 體長與體前端至食道腺末端的距離之比; c： 體長與尾長之比; c′： 尾長與肛門處體寬之比; V： 體前端至陰門的距離與體長之比×100; M： 口針針錐部長與口針長之比; G1： 陰門至前生殖腺末端的距離與體長之比×100; St.： 口針長度; DGO： 口針基部球末端至背食道腺開口的距離; N/A： 原文中未提供數(shù)據(jù)。下同。

Data in this study are given as mean ±SD. n： Number of specimens; L： Total body length; a： Body length/widest body width; b： Body length/distance from anterior end to junction of pharynx and intestine; b′： Body length/distance from anterior end to pharyngeal glands end; c： Body length/tail length; c′： Tail length/body width at anus; V： Distance from anterior end to vulva/body length×100; M： Stylet conus/stylet length; G1： Distance from vulva to end of anterior gonads/body length×100; St.： Length of stylet; DGO： Distance from dorsal pharyngeal gland opening to stylet knobs; N/A： Not available in the original paper. The same applies below.

2.1.3 分子生物學鑒定

從馬鈴薯塊莖分離的線蟲SSU基因序列長度為1 488 bp，提交到NCBI獲得基因序列號MT379647，與NCBI上序列比對結果顯示其與P.scribneri美國群體（MK292133）相似性達99.8%。

以大豆孢囊線蟲Heterodera glycines（KF241988）為外群，采用TIM2+I+G模型構建SSU系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。本試驗分離的線蟲與P.scribneri（EU669927，EU130811-12，MK292133）和P.agilis（EU130794）在同一分支上，置信度為100%。而P.agilis是P.scribneri的同物異名[13， 22]。

2.1.4 鑒定結果

本研究分離的線蟲鑒定代碼：A1-B2-C2-D3-E2-F4-G3-H1-I2-J1-K1與P.scribneri模式種代碼一致[13]。根據(jù)以上形態(tài)學特征和分子生物學分析，將馬鈴薯塊莖中的線蟲鑒定為斯克里布納短體線蟲P.scribneri。

2.2 咖啡短體線蟲Pratylenchus coffeae （Zimmermann， 1898） Filipjev & Schuurmans Stekhoven， 1941

2.2.1 形態(tài)特征描述

薯蕷塊莖癥狀（圖3a）：發(fā)病塊莖產(chǎn)生淺黃色至褐色的壞死病斑，剖開表皮，病組織呈紅褐色，嚴重時呈褐色干腐狀。塊莖變脆，易斷。

雌蟲（圖3）：唇區(qū)稍縊縮，唇環(huán)2條，偶有一側2條，另一側1或3條。頭架骨化，口針發(fā)達，口針基部球圓形或橢圓形;背食道腺開口距口針基部2.6（2.1～3.3）μm。中食道球卵圓形。食道腺從腹面覆蓋腸的前端，覆蓋長度38.7（28.2～52.5）μm。排泄孔距離體前端88.1（78.1～93.7）μm，半月體距離體前端85.0（77.2～91.8）μm，半月小體在半月體后12.3（11.0～13.9）μm。側線4條，偶爾5條或6條。單卵巢，卵母細胞單行排列，受精囊明顯，卵圓形或圓形，有精子。后陰子宮囊長37.2（30.4～448）μm。尾端亞圓柱形、平截或有缺刻，尾部有環(huán)紋22～31條。側尾腺孔小，位于尾部的中前部。

雄蟲（圖3）：交合刺細長，18.7（17.1～21.0）μm。引帶長4.6（3.6～5.8）μm。交和傘發(fā)達，長38.8（33.6～44.8）μm，從泄殖腔口前包到尾部末端。

2.2.2 形態(tài)特征測計值

測量結果見表2。

2.2.3 分子生物學鑒定

從薯蕷塊莖分離線蟲的ITS基因序列長度為1 009 bp，提交到NCBI獲得的基因序列號為MT379651，與NCBI上相關序列比對結果顯示其與P.coffeae中國浙江群體（KC490927）相似性達98.8%。

以大豆孢囊線蟲（LC030369）為外群，采用TPM2uf+I+G模型構建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），本研究分離的線蟲與P.coffeae（FJ827744，KC490927和MH134508）聚在一個分支上，置信度為100%。

2.2.4 鑒定結果

本研究從薯蕷塊莖分離的線蟲鑒定代碼：A1-B2-C2-D3-E3-F6-G2-H1-I2-J1，2，3-K1與P.coffeae模式種代碼一致[13]。根據(jù)以上形態(tài)學特征和分子生物學分析，將薯蕷塊莖中的線蟲鑒定為咖啡短體線蟲P.coffeae。

3 討論

最初報道斯克里布納短體線蟲P.scribneri來自美國馬鈴薯塊莖，目前，P.scribneri廣泛分布于世界多地和多種寄主上[13]。在中國，最早是1985年黎少梅等[24]在河南的高粱、梨、菠菜、番茄、茄子上發(fā)現(xiàn)P.scribneri，隨后張紹升[25]在福建香蕉上發(fā)

現(xiàn)該線蟲，但是均以名錄形式列出，未有詳細特征描述;孫嚴等[26]在新疆的葡萄上發(fā)現(xiàn)該線蟲并對其形態(tài)特征進行了簡單描述;高學彪等[21]在冀、晉、豫、魯、蘇5省調查發(fā)現(xiàn)該線蟲引起一種玉米新病害，并對該線蟲的形態(tài)特征進行了詳細描述，這是在國內首次發(fā)現(xiàn)P.scribneri具有危害性;隨后安徽、北京、廣東、廣西、貴州、海南、黑龍江、湖北、湖南、江西、吉林、遼寧、內蒙古、青海、四川、上海、天津、西藏、云南、浙江等地[9， 2736]陸續(xù)報道了該線蟲。但是在馬鈴薯上未見報道，僅高學彪等[37]用室內盆栽試驗證明P.scribneri對馬鈴薯有致病性。本研究首次在我國馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)P.scribneri，其形態(tài)特征與文獻報道基本相符[1921]，但有些特征不同，如口針較短，有半月小體，受精囊中有少量精子。這可能是不同地理和寄主環(huán)境造成的差異。

薯蕷根腐線蟲病是一種廣泛分布的世界性病害，目前國內報道引起該病的短體線蟲有3種：咖啡短體線蟲 [23，3840]、穿刺短體線蟲[41]和薯蕷短體線蟲 [42]。黃文華等[23]在江蘇沛縣的調查表明，薯蕷普遍受短體線蟲危害，田間一般發(fā)病率為30%～80%，嚴重時高達100%。賀哲等[40]在江西瑞昌發(fā)現(xiàn)由P.coffeae引起的根腐線蟲病發(fā)生十分普遍，嚴重影響薯蕷的產(chǎn)量和品質。本研究是首次在山西發(fā)現(xiàn)咖啡短體線蟲危害薯蕷，其形態(tài)描述和測量值與Loof[20]對咖啡短體線蟲的描述一致;與黃文華等[23]的描述除b值和口針長度略小外，其他描述一致。

本研究報道的P.scribneri首次在中國馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)，P.coffeae首次在山西薯蕷塊莖中發(fā)現(xiàn)，兩者均是在儲藏期發(fā)現(xiàn)。其中P.scribneri是我國進境植物檢疫性線蟲，后期將進一步跟蹤調查其田間危害，并對其發(fā)生區(qū)域進行深入調查研究。

參考文獻

[1] PERRY R N， MOENS M. Plant nematology [M]. Wallingford， UK： CABI Publishing， 2006.

[2] 劉海璐， 王暄， 李紅梅， 等. 我國黃淮麥區(qū)10個短體線蟲樣品種類的分子鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2018， 51（15）： 7892.

[3] 王倩倩， 顧建鋒， 李紅梅， 等. 荷蘭進境鈴蘭苗中鈴蘭短體線蟲的鑒定[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報， 2019， 42（5）： 835841.

[4] 杜宇， 鄧宗漢， 丁元明， 等. 四種短體線蟲的形態(tài)和分子生物學鑒定[J]. 植物病理學報， 2020， 50（1）： 2839.

[5] XUE Qing， BERT W， GAMLIEL A， et al. Phylogeography and molecular species delimitation of Pratylenchus capsici n.sp.， a new root-lesion nematode in Israel on pepper （Capsicum annuum） [J]. Phytopathology， 2019， 109（5）： 847858.

[6] NGUYEN H T， TRINH Q P， COUVREUR M， et al. Molecular and morphological characterisation of a new root-lesion nematode， Pratylenchus horti n.sp. （Tylenchomorpha： Pratylenchidae）， from Ghent University Botanical Garden [J]. Nematology， 2019， 21（7）： 739752.

[7] 江麗輝， 邊勇， 汪萬春. 短體線蟲Pratylenchus spp. 非中國種問題探討[M]∥廖金鈴， 彭德良， 段玉璽. 中國線蟲學研究（第三卷）. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社， 2010： 116122.

[8] 徐玉梅， 趙增旗， 王建明， 等. 中國檢疫性植物線蟲鑒定手冊[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2014.

[9] 王寧. 口岸進境截獲短體屬線蟲的種類鑒定[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學， 2014.

[10]WHITEHEAD A G， HEMMING J R. A comparison of some quantitative methods of extracting small vermiform nematodes from soil [J]. Annals of Applied Biology， 1965， 55（1）： 2538.

[11]SEINHORST W. A rapid method for the transfer of nematodes from fixative to anhydrous glycerine [J]. Nematologica， 1959， 4（1）： 6769.

[12]HOOPER D J. Handling， fixing， staining and mounting nematodes [M]∥SOUTHEY J F. Laboratory methods for work with plant and soil nematodes. London， U.K： Ministry of Agriculture， Fisheries and Food， 1986： 5980.

[13]CASTILLO P， VOVLAS N. Pratylenchus （Nematoda： Pratylenchidae）： diagnosis， biology， pathogenicity and management [M]. Leiden-Boston： Brill， 2007.

[14]WILLIAMS B D， SCHRANK B， HUYNH C. et al. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites [J]. Genetics， 1992， 131（3）： 609624.

[15]ZHENG Jingwu， SUBBOTIN S A， HE Shuishan， et al. Molecular characterisation of some Asian isolates of Bursaphenlenchus xylophilus and B.mucronatus using PCR-RFLPs and sequences of ribosomal DNA [J]. Russian Journal of Nematology， 2003， 11（1）： 1722.

[16]HOLTERMAN M， VAN DER WURFF A， VAN DEN ELSEN S， et al. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades [J]. Molecular Biology and Evolution， 2006， 23（9）： 17921800.

[17]FERRIS V R， FERRI S M， FAGHIHI J. Variation in spacer ribosomal DNA in some cyst-forming species of plant-parasitic nematodes [J]. Fundamental and Applied Nematology， 1993， 16（2）： 177184.

[18]VRAIN T C， WARKARCHUK D A， LVESQUE A C， et al. Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group [J]. Fundamental and Applied Nematology， 1992， 15（6）： 563573.

[19]SHERBAKOFF C D， STANLEY W W. The more important diseases and insect pests of crops in Tennessee [R]. Tennessee Agriculture Experiment Station Bulletin， 1943，186： 1142.

[20]LOOF P A A. Taxonomic studies on the genus Pratylenchus （Nematoda） [J]. Tijdschrift over Plantenziekten， 1960， 66（2）： 2990.

[21]高學彪， 程瑚瑞， 方中達. 玉米根腐線蟲病的病原鑒定和致病性研究[J]. 植物病理學報， 1992， 15（1）： 5055.

[22]HERNNDEZ M， JORDANA R， GOLDARACENA A， et al. SEM observations of nine species of the genus Pratylenchus Filipjev， 1936 （Nematoda： Pratylenchidae） [J]. Journal of Nematode Morphology and Systematics， 2000， 3（2）： 165174.

[23]黃文華， 高學彪， 呂繼宏. 山藥根腐線蟲病的病原鑒定和致病性研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報， 1994， 15（3）： 3538.

[24]黎少梅， 馮志新， 許克林. 河南省主要農(nóng)作物線蟲名錄[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報， 1985， 19（3）： 257269.

[25]張紹升. 福建省香蕉寄生線蟲種類調查[J]. 福建果樹， 1991， 12（2）： 3031.

[26]孫嚴， 王壽華. 吐魯番地區(qū)葡萄根圍線蟲的種類[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學， 1992， 29（6）： 262263.

[27]于焦， 金惺惺， 秦萌， 等. 西藏農(nóng)作物短體線蟲種類的鑒定和描述[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報， 2017， 36（5）： 2024.

[28]丁曉帆， 王雪， 李想， 等. 海南省甘蔗根際寄生線蟲調查與鑒定[J]. 甘蔗糖業(yè)， 2015（5）： 1722.

[29]陳艷， 高利媛， 馬騰， 等. 高羊茅根際一種短體線蟲的分離與鑒定[J]. 草業(yè)科學， 2015， 32（6）： 988993.

[30]江曉帆， 董春華， 馬駿， 等. 大連櫻桃根際寄生線蟲種類的調查與鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2014， 42（9）： 26002601.

[31]蘭慶渝， 鄧大林， 謝成倫， 等. 鐵滅克等五種藥劑防治果樹線蟲的研究[J]. 四川果樹， 1995（2）： 68.

[32]LI Yu， LU Qisen， WANG Shuo， et al. Discovery of a root-lesion nematode， Pratylenchus scribneri， infecting corn in Inner Mongolia， China [J]. Plant Disease， 2019， 103（7）： 1792.

[33]王宏洪， 卓侃， 廖金鈴. 桃樹根圍三種短體線蟲的鑒定[C]∥郭澤建， 吳元華. 中國植物病理學會2014年學術年會論文集. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社， 2014： 471.

[34]趙文霞， 楊君寶. 中國植物線蟲名錄[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2006.

[35]方羽生， 尹淦. 植物病原線蟲短體屬種類的研究[J]. 華南師范大學學報（自然科學版）， 1994， 26（4）： 3241.

[36]李戌清， 鄭經(jīng)武. 4種短體線蟲形態(tài)及rDNA-ITS的PCR-RFLP鑒定[J]. 植物病理學報， 2013， 43（4）： 444448.

[37]高學彪， 程瑚瑞， 方中達. 斯克里布納短體線蟲在華北的寄主范圍和克線磷防治作用的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報， 1994， 17（1）： 4346.

[38]閻愛華. 薯蕷紅斑病病原線蟲種類鑒定及其生物學特性研究[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學， 2006.

[39]黃金玲， 陸秀紅， 高淋淋， 等. 廣西淮山根腐線蟲病病原鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2015， 46（11）： 19901993.

[40]賀哲， 黃婷， 李俊科， 等. 瑞昌山藥根腐線蟲病病原鑒定[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報， 2016， 38（5）： 879883.

[41]張廣民， 高士仁， 國慶合. 山藥新病害： 山藥根腐線蟲病[J]. 植物保護， 1991， 17（3）： 50.

[42]楊寶君， 趙來順. 短體屬線蟲一新種（墊刃目： 短體科）[J]. 動物分類學報， 1992， 17（2）： 160164.

（責任編輯：楊明麗）