七星瓢蟲乙酰輔酶A羧化酶基因克隆及表達分析

向梅 謝應強 張洪志 李玉艷 王孟卿 臧連生 張禮生

摘要 ：乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）是脂肪酸合成第一步反應的限速酶，參與長鏈脂肪酸的合成。本試驗基于七星瓢蟲Coccinella septempunctata L.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究ACC在滯育七星瓢蟲脂代謝中的調(diào)控作用。利用RT-PCR和RACE技術從七星瓢蟲中克隆得到ACC基因全長，命名為CsACC（GenBank登錄號：MT012819），該基因cDNA序列全長7 217 bp，開放閱讀框（ORF）長為6 792 bp，編碼2 263個氨基酸，預測蛋白質(zhì)分子量為255.9 kDa，理論等電點（pI）為5.90，無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，無信號肽。通過氨基酸多序列比對分析，結(jié)果顯示CsACC與鞘翅目的赤擬谷盜Tribolium castaneum乙酰輔酶A羧化酶同源性較高。利用實時熒光定量PCR技術檢測CsACC基因在七星瓢蟲正常發(fā)育及滯育誘導不同階段的相對表達量，結(jié)果顯示，滯育誘導30 d表達量達到最高，滯育誘導60 d、滯育解除期以及正常發(fā)育30 d表達量幾乎持平。本研究為揭示CsACC基因在脂代謝通路中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

關鍵詞 ：七星瓢蟲; 乙酰輔酶A羧化酶; 脂代謝; 基因克隆; 表達分析

中圖分類號：

S 476.2

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020093

Cloning and expression analysis of acetyl-CoA carboxylase in

Coccinella septempunctata

XIANG Mei1，2， XIE Yingqiang2， ZHANG Hongzhi2， LI Yuyan2， WANG Mengqing2，

ZANG Liansheng1*， ZHANG Lisheng2*

（1. Jinlin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Acetyl-CoA carboxylase （ACC） is a rate-limiting enzyme involved in the first step of fatty acid synthesis. In order to explore the function of ACC in lipid metabolism of Coccinella septempunctata at diapause stage， the full-length cDNA of a ACC gene was cloned using RT-PCR and RACE techniquebased on the transcriptome database. The gene was named CsACC （GenBank accession no. MT012819）. The full length of cDNA sequence of this gene was 7 217 bp and the length of open reading frame （ORF） was 6 792 bp， encoding 2 263 amino acid residues. The predicted molecular weight of the protein was 255.9 kDa with an isoelectric point （pI） of 5.90 without a transmembrane helical structure or signal peptide. The results showed that CsACC had a high homology with that of Tribolium castaneum. The relative expression levels of CsACC gene in different stages of normal and diapause development were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression levels of CsACC gene reached the highest level on 30th day after diapause induction， and the expression levels were almost flat on 60th day after diapause inductions， 30th day after normal development and after diapause termination. This study provides a theoretical basis for revealing the regulatory role of CsACC gene in the lipid metabolism pathway.

Key words

Coccinella septempunctata; acetyl-CoA carboxylase; lipid metabolism; gene clone; gene expression

七星瓢蟲Coccinella septempunctata L.在我國廣泛分布，其捕食果樹及農(nóng)作物上的各種蚜蟲[12]，是一種典型的捕食性農(nóng)業(yè)害蟲天敵，在國內(nèi)外已被廣泛應用[34]。七星瓢蟲存在滯育現(xiàn)象，腹部可大量積累脂肪，滯育個體總脂含量較正常發(fā)育個體顯著增加[5]。根據(jù)此現(xiàn)象，本研究通過七星瓢蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析比對正常發(fā)育組、滯育組及滯育解除組，篩選得到脂代謝中滯育關聯(lián)基因，研究差異表達基因，為揭示滯育分子機制提供理論依據(jù)[67]。

昆蟲脂肪體是維持體內(nèi)能量平衡的動力來源，也是在變態(tài)過程中長時間不進食時脂肪的必要儲藏庫。大部分營養(yǎng)物質(zhì)被昆蟲吸收后，以甘油三酯（triglyceride， TG）形式儲存在體內(nèi)[8]。而用于合成甘油三酯的脂肪酸（fatty acids， FAs）其合成通路在維持昆蟲體內(nèi)平衡中起重要作用。乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是脂肪酸從頭合成的限速酶，其催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，最終可以形成C16脂酰輔酶A[910]。ACC可分多亞基型ACC和多功能型ACC。多亞基型ACC存在于植物及細菌中，由4個亞基組成，即生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）、生物素羧基載體蛋白（biotin carboxyl carrier protein， BCCP）及羧基轉(zhuǎn)移酶（carboxyltransferase，CT）的兩個亞基α-CT和β-CT。多功能型ACC多存在于真核生物[1112]。ACC已經(jīng)應用于肥胖、糖尿病以及植物除草劑的藥物設計中，也是某些農(nóng)作物的靶標基因[13]，而在昆蟲中研究較少。研究表明，昆蟲ACC為單基因編碼的多結(jié)構(gòu)域酶，該酶可影響昆蟲脂質(zhì)積累、生殖能力以及表皮功能[14]。研究結(jié)果顯示，RNA干擾破壞黑腹果蠅Drosophila melanogaster脂肪體中的ACC不影響其生存能力，但會導致甘油三酯儲存的急劇減少和糖原積累增加[15]。對埃及伊蚊Aedes aegypti體內(nèi)ACC和脂肪酸合成酶1（FAS1）進行轉(zhuǎn)錄水平定量分析，敲除掉這兩種基因后，脂肪體脂質(zhì)生物合成和中腸消化的速率降低[16]。脂肪酸合成通路關鍵基因?qū)ハx的生長、發(fā)育和繁殖等都起到了關鍵作用[17]。在果蠅中發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)代謝基本調(diào)節(jié)因子為代謝通路的控制提供了新的方向[18]。尖音庫蚊Culex pipiens在滯育期間大量的脂肪代謝基因在早期受到抑制，而在滯育解除期高表達[19]，此結(jié)果與七星瓢蟲脂代謝滯育關聯(lián)基因表達趨勢相似[7]。因此，推測乙酰輔酶A羧化酶在七星瓢蟲滯育中也可能發(fā)揮作用，并影響滯育進程。本試驗對七星瓢蟲乙酰輔酶A羧化酶進行全長克隆并分析其功能，利用實時熒光定量PCR技術對滯育和非滯育等階段雌蟲的CsACC進行定量檢測，研究其作用及在脂代謝通路中對脂質(zhì)積累的影響。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及處理方法

本試驗蟲源為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所天敵昆蟲組飼養(yǎng)的七星瓢蟲室內(nèi)種群，飼養(yǎng)方法參考王偉等[5]的方法。正常發(fā)育飼養(yǎng)條件：溫度（24±1）℃、相對濕度（70±10）%、光周期L∥D=16 h∥8 h。滯育誘導飼養(yǎng)條件：溫度（18±1）℃、相對濕度（70±10）%、光周期L∥D=10 h∥14h。以正常發(fā)育條件下飼養(yǎng)30 d的雌蟲為正常發(fā)育組。將正常發(fā)育條件下得到的初羽化成蟲雌雄配對，轉(zhuǎn)移至滯育誘導條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)40 d且未產(chǎn)卵雌成蟲為滯育組。滯育判斷方法參考王偉等[5，20]的方法。將滯育成蟲轉(zhuǎn)移至正常發(fā)育條件下，待其第1次產(chǎn)卵為滯育解除組。

七星瓢蟲各處理組收集： 收集新羽化成蟲，正常發(fā)育30 d，滯育誘導10、20、30 d和60 d雌成蟲以及滯育解除組成蟲，經(jīng)蒸餾水洗凈后，濾紙干燥，置于液氮速凍，保存于-80℃冰箱。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒RNAiso Plus、RACE試劑盒SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech和qPCR試劑盒SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNase H Plus）均購自TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒GlodenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit和PCR擴增試劑盒I-5TM 2×High Fidelity Master Mix購于北京擎科生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

將七星瓢蟲樣品于預冷研缽內(nèi)加入液氮研磨至粉末，快速轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)加入1 mL RNAiso Plus 試劑，按照RNA提取試劑盒說明書提取樣品總RNA。利用微量分光光度計（NanoPhotometer P-Class， Implen公司）檢測RNA純度和濃度，記錄濃度及OD值，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.4 CsACC基因的克隆

1.4.1 引物設計及合成

基于七星瓢蟲轉(zhuǎn)錄組中注釋為ACC的基因序列，利用Primer Premier 5.0設計常規(guī)PCR引物和實時熒光定量PCR引物，利用DNAMAN設計 3′RACE和5′RACE特異性引物（表1）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4.2 中間片段PCR擴增、回收純化及測序

以合成的七星瓢蟲cDNA為模板，選取CsACC-f1、CsACC-r1，CsACC-f2、CsACC-r2，CsACC-f3、CsACC-r3，CsACC-f4、CsACC-r4 4對引物進行中間序列擴增。反應體系（50 μL）：Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，模板 DNA 1 μL，正、反引物各2 μL，充分混勻，瞬時離心。PCR反應程序：98℃預變性2 min;98℃變性10 s，56℃ 退火10 s，72℃ 延伸15 s，33個循環(huán);72℃ 5 min。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳

檢測擴增產(chǎn)物，并在紫外燈下切取目的條帶按照膠回收試劑盒（Nucleo Spin Gel and PCR Clean-up）說明書進行回收。將回收產(chǎn)物與pClone 007 Blunt simple vector連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)氨芐青霉素篩選后挑取單個菌落，37℃， 250 r/min培養(yǎng)6 h，將菌液送至上海生工生物技術有限公司測序。

1.4.3 3′ RACE和5′ RACE

按照SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech試劑盒說明書進行3′RACE與 5′ RACE。3′RACE和5′ RACE擴增均采用巢式 PCR。第一輪：反應體系（50 μL），包括 PCR-Grade H2O 15.5 μL， 2×SeqAmp Buffer 25.0 μL， SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，混勻離心后加入Race-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5.0 μL，CsACC-3′GSP1/CsACC-5′GSP1 1.0 μL，混勻離心。反應程序：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán);94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán);94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)。第二輪：以稀釋20倍的第一輪反應產(chǎn)物為模板，按照第一輪反應體系及程序進行巢式PCR，引物為表1中的CsACC-3′GSP2/CsACC-5′GSP2。將最后所得擴增產(chǎn)物純化回收，根據(jù) In-Fusion HD Cloning Kits（Clontech）試劑盒說明書進行連接轉(zhuǎn)化，挑選單個菌落由上海生工生物技術有限公司測序。

1.4.4 CsACC序列拼接與生物信息學分析

利用DNAMAN對測序結(jié)果進行堿基序列拼接及氨基酸序列推導。利用ORF Finder（https：∥www.ncbi.nlm.gov/orffinder/）查找開放閱讀框以及推測的氨基酸序列，并確認和DNAMAN的預測一致。利用CDD（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析，利用TMHMM Server V.2.0（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對跨膜結(jié)構(gòu)進行預測，利用Protparam（https：∥web.expasy.org/protparam/）在線分析氨基酸理化性質(zhì)，利用SignalP 4.0 Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測，利用PredictProtein（https：∥www.predictprotein.org/）和SWISS-MODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)預測。在NCBI上對其氨基酸序列進行BLAST比對，利用MEGA 5.0對搜索得到的同源性序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.5 CsACC實時熒光定量 PCR

收集新羽化成蟲，正常發(fā)育組，滯育誘導10、20、30 d和60 d的雌成蟲以及滯育解除組雌成蟲共7個處理組，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于qPCR反應。利用Light Cycler實時熒光定量PCR儀（Roche， Basel， Switzerland）測定CsACC基因表達量。依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNase H Plus）試劑盒說明書進行操作。反應體系設為20 μL，包括：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNase H Plus） 10 μL，qCsACC-f/qCsACC-r各0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase free H2O 6.4 μL。反應條件：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)?；虻南鄬Ρ磉_量計算采用 2-ΔΔCt法[21]，試驗采用3個生物學重復，4個技術重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsACC基因克隆與序列分析

基于七星瓢蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RACE 技術克隆得到目的基因全長序列7 217 bp（圖1），命名為CsACC（GenBank登錄號：MT012819）。分析結(jié)果顯示，基因開放閱讀框（ORF）長6 792 bp（位點93—6 884 nt），編碼的蛋白由2 263個氨基酸組成。5′非編碼區(qū)長92 bp，3′非編碼區(qū)長333 bp，具polyA尾巴。預測該蛋白分子量為255.9 kD，理論等電點為5.90。無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽。利用PsortⅡ?qū)Φ鞍走M行亞細胞定位預測，該蛋白出現(xiàn)可能性最高的3處分別為細胞質(zhì)（52.2%），線粒體（17.4%），細胞核（13%）。在該蛋白的第731—1 474個氨基酸之間存在ACC乙酰輔酶A羧化酶結(jié)構(gòu)域（ACC_central，登錄號：pfam08326），該酶參與長鏈脂肪酸的合成，催化反應過程中的限速步驟。以乙酰輔酶A羧化酶1（SMTL ID：6g2h.1.A）為模型預測CsACC蛋白的3D結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，模板與該蛋白的氨基酸序列相似性為63.64%（圖2）。

2.2 CsACC基因同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將七星瓢蟲CsACC與8種昆蟲的ACC氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對，結(jié)果表明，CsACC氨基酸序列在不同物種中同源性較高，相似性達到75.66%（圖3）。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中選取 20種與該序列同源性較高的物種，利用MEGA 5，通過neighbor-joining（N-J）方法構(gòu)建CsACC蛋白氨基酸序列在不同昆蟲物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離分析結(jié)果可知七星瓢蟲CsACC蛋白氨基酸序列與赤擬谷盜Tribolium castaneum親緣關系最近，并與鞘翅目類群同源性較高，與膜翅目、雙翅目和半翅目等則聚為一大分支，親緣關系相差較大。

2.3 CsACC基因的實時熒光定量PCR分析

將七星瓢蟲7個處理組進行實時熒光定量分析，以Actin作為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，CsACC基因在各階段均有表達，且表達量有極顯著差異（P<0.01）。隨著滯育誘導時間的延長，表達量逐漸增加，滯育誘導30 d時達最高水平，滯育誘導60 d、滯育解除期以及正常發(fā)育30 d表達量幾乎持平，沒有顯著差異。從圖中可明顯看出，滯育誘導10、20、30 d的表達量顯著高于滯育解除期及正常發(fā)育期（圖5）。

3 討論

乙酰輔酶A羧化酶是在代謝過程中催化脂肪酸合成的關鍵酶，是長鏈脂肪酸合成的前體，在脂代謝過程中發(fā)揮著重要作用。ACC基因目前已經(jīng)應用于肥胖、糖尿病以及植物除草劑的藥物設計中[2224]，但在昆蟲滯育相關研究中報道較少。ACC分為異質(zhì)型和同質(zhì)型兩大類，目前克隆較多的是異質(zhì)型ACC的亞基基因，如大腸桿菌、分枝桿菌、擬南芥、大豆及棉花等的ACC[14]，另外在魚類，山羊中研究得比較清楚[25]。有研究報道，干擾黑腹果蠅Dmelanogaster及埃及伊蚊A.aegypti的ACC基因都會導致甘油三酯含量和產(chǎn)卵量下降[1617]。本研究利用 RT-PCR 與 RACE 技術克隆得到的七星瓢蟲CsACC全長為7 217 bp，由于PCR技術受到Taq酶和反轉(zhuǎn)錄酶的影響，很難一次擴增到7 kb的目的條帶，故參照轉(zhuǎn)錄組中原始序列設計了4對特異性引物，利用RT-PCR獲得該基因全長。其保守區(qū)域具有乙酰輔酶A羧化酶結(jié)構(gòu)域，同源性比較結(jié)果顯示，七星瓢蟲CsACC氨基酸序列與赤擬谷盜親緣關系最近。

昆蟲在滯育前會大量儲存脂肪，為滯育期生命活動提供能量和水分，滯育期間的營養(yǎng)利用是一個動態(tài)過程，被儲存的脂肪可與糖、醇互相轉(zhuǎn)化，并調(diào)節(jié)滯育深度和時間[26]。滯育期間體內(nèi)脂肪的儲存與其抗逆能力也息息相關[2728]。本研究通過實時熒光定量PCR檢測到CsACC基因在七星瓢蟲滯育誘導期，滯育期和滯育解除期均有表達，滯育誘導30 d達最高，而滯育解除期和正常發(fā)育組沒有顯著差異，此結(jié)果與七星瓢蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6]中CsACC變化規(guī)律相一致。根據(jù)前人研究的七星瓢蟲各階段總脂及甘油三酯含量變化，其在滯育準備期含量均呈上升趨勢，并在滯育誘導30 d時含量達到最高，隨著滯育時間延長而降低，推測轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)為機體供能[29]。從生理生化的角度來看，CsACC基因的實時熒光定量PCR結(jié)果與七星瓢蟲體內(nèi)甘油三酯的變化規(guī)律相符。初步推測，該基因在滯育準備期表達量逐步上升，原因可能是促進脂質(zhì)大量合成脂肪酸為滯育期做充分準備，也可能是對抗不良環(huán)境。滯育誘導60 d及滯育解除期，該基因表達量下降，與正常發(fā)育時期一致，可能是讓機體恢復至正常水平促進交配產(chǎn)卵等生理功能。在后續(xù)試驗中，可以利用RNA干擾技術進行該基因的功能驗證，進一步對七星瓢蟲滯育分子機制進行研究。

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（責任編輯：楊明麗）