楊冬華,李文軍,張慧玲,綻 麗,劉佳雯,張永棟△

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院：1.院感科；2.胸外科，西寧 810000)

在我國，肺癌死亡人數(shù)順位為惡性腫瘤的第1位[1]，給社會(huì)帶來巨大的醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究證實(shí)，在健康狀態(tài)下肺部也存在豐富的細(xì)菌微生物群落[2]。而人體微生物生態(tài)是指在一定空間范圍內(nèi)，細(xì)菌、真菌、病毒形成的微生物群落以其宿主的組織和細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物為環(huán)境而形成的統(tǒng)一生物系統(tǒng)[3-4]。并且，對(duì)肺部微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病的研究為目前研究熱點(diǎn)。然而目前的研究方向主要集中于肺部細(xì)菌微生態(tài)與慢性氣道疾病[5-7]，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等。關(guān)于肺部細(xì)菌微生態(tài)與肺癌的相關(guān)研究相對(duì)較少。本研究擬通過Illumina平臺(tái)，采用16S rDNA 高通量測(cè)序的方法研究不同分型肺癌患者的肺部微生物組學(xué)，分析肺癌患者肺組織的微生物組學(xué)特征，初步探討肺部細(xì)菌微生態(tài)與肺癌的相關(guān)性及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年本院病理診斷為肺癌的行肺葉切除術(shù)或修補(bǔ)術(shù)的19例住院患者。其中男14例，女5例；平均年齡(59±6.8)歲。知情同意后術(shù)中無菌操作取黃豆大小肺組織一塊液氮速凍后放置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。取的部位為局部組織(癌變組織周圍，距病變1 cm處)和周圍組織(相對(duì)遠(yuǎn)離癌變組織)。按照不同部位分組：距離病變1 cm處的組織為A1組，遠(yuǎn)離癌變部位的組織為B1組；按照不同病理狀態(tài)分組：小細(xì)胞癌肺組織為A2組，非小細(xì)胞癌肺組織為B2組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡30～85歲，無手術(shù)禁忌證，經(jīng)組織病理學(xué)診斷為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌的住院患者；(2)入院前1周無抗感染治療；(3)臨床病例信息資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<30歲或>85歲；(2)合并阻塞性肺炎；(3)合并支氣管哮喘、肺結(jié)核、COPD、艾滋病(HIV)、糖尿病、特發(fā)性肺纖維化等可能影響微生物組學(xué)特征的其他疾?。?4)曾有粉塵接觸史或其他特殊接觸史患者；(5)切取肺組織過程中未按照無菌操作或被污染的標(biāo)本；(6)臨床信息資料不完整。所有標(biāo)本的采集都經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1DNA提取

肺組織DNA抽提步驟如下：(1)取100 mg左右肺組織樣品加入2 mL離心管中，加3粒鋼珠，液氮震碎，在組織破碎儀上50 Hz，30 s。(2)加入700 μL SDS裂解液，加入20 μL蛋白酶K，65 ℃水浴放置40 min，期間顛倒混勻數(shù)次，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。(3)小心取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇(24∶1)顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中；加入2/3上清液體積的異丙醇；3 μL糖原(20 mg/mL)；1/10體積的3 mol/L的醋酸鈉；混勻，—20 ℃靜置30 min以上，12 000 r/min離心10 min。(4)棄上清液，75%乙醇(現(xiàn)配現(xiàn)用)洗1遍，12 000 r/min離心5～10 min，室溫靜置5 min，至乙醇揮發(fā)完全，按DNA沉淀的多少加入DNase-free水(50～100 μL)溶解DNA，輕柔吹打混勻，室溫靜置2～5 min，直至DNA完全溶解。

1.2.2PCR擴(kuò)增16SrDNA基因功能基因的不同區(qū)域

本試驗(yàn)選用長度約為250 bp的細(xì)菌 16S rRNA基因的高度可變的V4區(qū)用來測(cè)序。PCR 擴(kuò)增選用細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)特異性引物 520F(5′-barcode+AYT GGG YDT AAA GNG-3′)，802R(5′-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3′)。

1.2.3文庫構(gòu)建

利用 TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進(jìn)行建庫。(1)進(jìn)行的末端修復(fù)過程是利用試劑盒中的End Repair Mix2 將 DNA 5′端突出的堿基切除，3′端缺失的堿基補(bǔ)齊，同時(shí)在5′端加上一個(gè)磷酸基團(tuán);(2)3′端加A，這一過程中，DNA的3′端會(huì)單獨(dú)加上一個(gè)A堿基，以防止 DNA 片段的自連，同時(shí)保證 DNA與 3′端有一個(gè)突出T堿基的測(cè)序接頭相連;(3)加有特異性標(biāo)簽的接頭，此過程是為了讓 DNA 最終雜交到 Flow Cell 上;(4)通過PCR擴(kuò)增已經(jīng)加上接頭的DNA片段，然后利用 BECKMAN AMPure XP beads 純化PCR體系;(5)通過2%瓊脂糖凝膠電泳來對(duì)文庫做最終的片段選擇與純化。

1.2.4文庫質(zhì)檢與測(cè)序

1.2.4.1文庫質(zhì)檢與定量

取1 μL 文庫，在 Agilent Bioanalyzer 機(jī)器上用 Agilent High Sensitivity DNA Kit 對(duì)文庫做 2100 質(zhì)檢，合格的文庫應(yīng)該有單一的峰，無接頭。 利用 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在 Promega QuantiFluor上對(duì)文庫進(jìn)行定量，合格的文庫計(jì)算后濃度應(yīng)在 2 nmol/L以上。

1.2.4.2測(cè)序

對(duì)合格的文庫，在 MiSeq機(jī)器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。首先將需要上機(jī)的文庫(Index 不可重復(fù))梯度稀釋到 2 nmol/L，然后按所需數(shù)據(jù)量比例混樣。混好的文庫經(jīng)0.1 mol/L NaOH 變性成單鏈進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。所上文庫量的多少可根據(jù)實(shí)際情況控制在 15～18 pmol/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺癌患者肺部微生物種群在各分類單元的相對(duì)豐度

門水平主要為變形菌門(78.0%)、擬桿菌門(12.3%)、放線菌門(3.9%)、棲熱菌門(1.2%)、厚壁菌門(1.4%)。屬水平主要為蒼白桿菌屬(19.4%)、沉積物桿狀菌屬(11.3%)、不動(dòng)桿菌屬(6.6%)、貪銅菌屬(3.5%)、土壤桿菌屬(2.4%)、擬無枝菌酸菌(1.7%)、鞘脂單胞菌屬(1.4%)、甲基桿菌屬(1.2%)、棲熱桿菌屬(1.2%)、短波單胞菌屬(1.1%)、葉桿菌屬(0.8%)、噬幾丁質(zhì)桿菌屬(0.2%)、鏈球菌(0.2%)、韋榮球菌(0.1%)，以及未能分類到屬層面的物種，包括叢毛單胞菌科(18.6%)、變形菌綱(4.8%)、莖桿菌科(4.1%)、伯克霍爾德菌科(1.4%)、柄桿菌科(1.0%)，見表1。

表1 肺癌患者肺部微生物種群在各分類單元的相對(duì)豐度

2.2 A1組和B1組在屬水平菌群分類學(xué)組成

A1組和B1組微生物種群在屬水平層面順位前20的包括蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌屬、土壤桿菌屬、假平胞菌屬、棲熱菌屬、甲基桿菌屬、短波單胞菌屬、氨基桿菌、葉桿菌屬、戴爾福特菌、鏈球菌、短桿菌屬、不黏柄菌屬、假單胞菌、葡萄球菌屬、紅游動(dòng)菌屬、鞘脂菌屬，其中兩組之間微生物物種豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的為甲基桿菌屬(P=0.036)和紅游動(dòng)菌屬(P=0.03)，其他微生物物種豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 A1組和B1組在屬水平菌群分類學(xué)組成

2.3 A2組和B2組在屬水平菌群分類學(xué)組成

A2組和B2組微生物種群在屬水平層面順位前20的包括蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌、土壤桿菌屬、假平胞菌屬、棲熱菌屬、甲基桿菌屬、短波單胞菌屬、氨基桿菌、葉桿菌屬、戴爾福特菌、鏈球菌、短桿菌屬、不黏柄菌屬、假單胞菌、葡萄球菌屬、克拉菌屬、鞘脂菌屬，微生物物種豐度兩組之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 A2組和B2組在屬水平的菌群分類學(xué)組成

2.4 屬水平A2組和B2組優(yōu)勢(shì)種群

通過Lefse判別分析，找出A2組和B2組有特異的主要菌群。小細(xì)胞癌組中主要菌群為葉桿菌屬、動(dòng)球菌科、噬纖維菌目、纖維黏網(wǎng)菌。B2組中主要菌群為假單胞菌科、假單胞菌屬、嗜熱油菌綱、SHA_31、綠彎菌門、綠彎菌目、綠彎菌科、弧菌目、假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬、綠線菌屬等。

表4 屬水平A2組和B2組優(yōu)勢(shì)種群

3 討 論

肺癌疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，目前研究為肺癌患者肺部微生物種群特征提供了新的視角[8-9]。本研究收集肺癌患者肺部組織并進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，肺癌患者肺部微生物門水平主要為變形菌門(78.0%)、擬桿菌門(12.3%)、放線菌門(3.9%)、棲熱菌門(1.2%)、厚壁菌門(1.4%)。屬水平主要包括蒼白桿菌屬(19.4%)、未分類叢毛單胞菌科(18.6%)、沉積物桿狀菌屬(11.3%)、不動(dòng)桿菌屬(6.6%)等。APOPA等[4]對(duì)肺活檢組織的微生態(tài)構(gòu)成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肺癌患者有相似的微生態(tài)構(gòu)成，以擬桿菌門和變形菌門為主，包括無色菌屬、不動(dòng)桿菌屬、放線菌屬、伊麗莎白菌屬、羅氏菌屬和鞘氨醇桿菌屬等；同時(shí)，庫克菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等機(jī)會(huì)致病菌也在肺癌患者中廣泛存在。同時(shí)比較了同一患者距離病變組織1 cm處的組織和相對(duì)遠(yuǎn)離癌變部位組織的微生物組成情況。兩組菌群序列量順位靠前的為蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌等，并且兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

一項(xiàng)大型的病例對(duì)照研究提示，反復(fù)使用青霉素類、頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物會(huì)增加肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)，提示肺部菌群失衡可能與肺癌相關(guān)[10]。 菌群失衡表示某些致病細(xì)菌豐度的失調(diào)，進(jìn)而可能通過產(chǎn)生過多的毒性物質(zhì)、介導(dǎo)炎性反應(yīng)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。本次研究中A2組和B2組物種多樣性分析顯示，物種分類組成排在前20的物種兩組之間并無明顯差別(P>0.05)，通過判別分析進(jìn)行物種差異性分析，A2組豐度均值相對(duì)較高的物種為葉桿菌屬、動(dòng)球菌科、噬纖維菌目、纖維黏網(wǎng)菌，而在B2組內(nèi)豐度均值相對(duì)較高的物種分別為假單胞菌、嗜熱油菌綱、綠彎菌門、 綠彎菌目、綠彎菌科、弧菌目、假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬、綠線菌屬。本研究中非小細(xì)胞癌組中基本為鱗癌，而鱗癌的發(fā)病機(jī)制與肺部炎癥的發(fā)生、氣道阻塞的形成等相關(guān)[11-12]，從而可能使肺部存在更多的優(yōu)勢(shì)菌落，并相比另外一組，該組中存在假單胞菌、假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬等潛在的定值菌，而該類菌屬是引起肺部囊性纖維化、COPD等結(jié)構(gòu)性肺病變等疾病的主要機(jī)會(huì)致病菌[13-15]。因此，肺部細(xì)菌與宿主之間可能存在復(fù)雜的相互作用。肺部細(xì)菌可能促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展，而宿主因素例如吸煙狀態(tài)、基因突變等又可能反過來影響肺部細(xì)菌，交織成復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。