攜帶豬流行性腹瀉病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒樣顆粒的構建與鑒定

劉如月，范京惠，劉 濤, 苑軍輝，李清艷，翟向和*，左玉柱*

(1. 河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院/科教興農中心，保定 071001； 2. 瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，保定 071001； 3. 行唐縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所, 行唐 050600)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)主要引起新生仔豬水樣腹瀉，致死率高達80%～100%[1]。自1973年，豬流行性腹瀉在我國多有發(fā)生[2]，2010年，在我國大規(guī)模暴發(fā)，給我國生豬產業(yè)帶來了嚴重的損失[3]。目前，市面上商品化的滅活疫苗和弱毒活疫苗不夠安全[4]。所以，研制一種安全且有效的新型PED疫苗就顯得尤為重要。

PEDV主要編碼E、S、M和N蛋白這4種結構蛋白[5]。將PEDV的S蛋白分為S1、S2兩個區(qū)域，S1集中了多個中和表位，其中，包含兩個短的保守的B細胞中和表位，分別為744YSNIGVCK752和756SQYGQVKI771，它們主要決定病毒的抗原性[6-8]。所以，PED亞單位疫苗多基于S1蛋白來構建。

乙肝核心抗原 (hepatitis B core antigen, HBcAg)能夠在酵母表達系統、大腸桿菌表達系統及桿狀病毒-昆蟲表達系統等多種表達系統中表達[9]。本研究選擇的大腸桿菌表達系統和其他系統相比具有表達周期短、經濟、易于操作和表達蛋白量高等優(yōu)點[10]。當外源基因表位插入到HBcAg的主要免疫優(yōu)勢區(qū)(MIR)時，可在原核系統中進行表達，重組蛋白自發(fā)裝配成病毒樣顆粒(virus like particle, VLP)，且可增強外源基因表位的免疫原性[11-12]。VLP是具備病毒的一些抗原性，但不具備感染性的能夠自我組裝的類病毒粒子。

因此，本研究以HBcAg作為呈現PEDV S1 抗原表位的載體，構建了重組質粒，表達獲得重組蛋白HBcAg-PEDV S1，通過透射電鏡檢測發(fā)現其可以形成VLP，這為今后研制PED的新型疫苗提供研究方法及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

限制性內切酶為寶生物工程(大連)有限公司產品；PEDV HB/HS株(JQ862708.1) 及大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)菌細胞由河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院動物傳染病實驗室保存；pcDNA3.1(+)-HBcAg(編碼1—144 aa)質粒由河北農業(yè)大學王家鑫教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中乙肝核心抗原基因序列(KC774394)及PEDV的S基因(JQ862708.1，與CV777相似性為96.9%)，分別設計引物P1、P2及P5并添加相應酶切位點及終止密碼子；設計引物P3-R重疊S1的18個堿基，設計引物P4-F重疊HBcAg的17個堿基(表1)。

表1 構建重組質粒的引物

1.2.2 重組質粒的構建 用引物P3、P4通過融合PCR擴增HBcAg(編碼1—74 aa)-S1片段；用引物P5進行PCR擴增HBcAg(編碼83—144 aa)片段；回收目的片段進行連接轉化并且測序正確后，提取質粒。對上述兩個質粒用HindⅢ和XhoⅠ進行雙酶切并連接。取連接完成的重組質粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1，用EcoR Ⅰ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定,再送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 目的蛋白的表達及純化

將測序正確的重組質粒pET-32a(+)-HBcAg- PEDV S1轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，表達并純化重組蛋白，SDS-PAGE檢測。

1.4 重組蛋白的復性

用尿素濃度梯度法透析法復性重組蛋白，檢測復性后的蛋白濃度，SDS-PAGE檢測。

1.5 透射電鏡檢測HBcAg-PEDV S1病毒樣顆粒結構

將復性蛋白濃度調整至200 μL·mL-1，取蛋白樣品滴于銅網上，滴加2%的磷鎢酸負染液，自然干燥后，將樣品置于透射電子顯微鏡下觀察樣品形態(tài)。

2 結 果

2.1 重組質粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1的鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ對pET-32a(+)-HBcAg- PEDV S1重組質粒進行雙酶切鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，可見702 bp的目的條帶，對重組質粒的測序結果與目的序列進行比對，結果顯示,與預期完全相符，表明成功構建重組質粒。

2.2 重組蛋白HBcAg-PEDV S1的純化和復性

SDS-PAGE結果(圖1)顯示，重組蛋白HBcAg-PEDV S1通過純化和復性后,可見43.1 ku目的蛋白；復性蛋白濃度約為1.5 mg·mL-1。

M.蛋白相對分子質量標準；1.pET-32a(+)空載體對照；2.純化蛋白；3.復性蛋白

2.3 VLPs的透射電鏡鑒定

透射電鏡結果顯示，可看到大小均勻的粒子形成，并且直徑在30 nm左右，與預期相符(圖2)。

圖2 HBcAg-PEDV S1 VLP的透射電鏡觀察

3 討 論

目前,國內控制PEDV的主要手段是為豬群接種傳統滅活疫苗和弱毒活疫苗。而傳統滅活疫苗多選用經典毒株，這造成疫苗對各地的豬群免疫保護能力參差不齊；而弱毒活疫苗雖然免疫效果遠優(yōu)于傳統滅活疫苗，但其研發(fā)成本較高、周期較長，并且基于目前的研究和臨床觀察發(fā)現，有弱毒活疫苗與流行毒株基因重組的現象發(fā)生[13-14]，這就要求對其進行進一步研究，研發(fā)有效且安全的PED新型疫苗。

以HBcAg為載體可用于新型疫苗的研發(fā)，在美國等國家允許應用于疫苗中[15]。近期在研發(fā)PED的亞單位疫苗中， 以基因重組HBcAg與PEDV S蛋白上的B細胞表位構建了VLP，并且可在小鼠體內誘導產生特異性抗體，證明成功構建PED的基因工程疫苗[16-17]。與其相比，本研究優(yōu)勢在于利用融合PCR將其B細胞表位插入到HBcAg中，而不是直接由生物公司合成，降低成本的同時，可以達到相同的免疫效果。

VLP能夠自發(fā)裝配成類病毒粒子，具備病毒的一些抗原性，但不具備感染性[18]。1986年，乙肝表面抗原(HBsAg)作為第一種基于病毒樣顆粒的商業(yè)疫苗被批準上市[19]。大腸桿菌表達系統是第一個用于生產VLPs的系統，已經生產了幾種商業(yè)VLPs疫苗，例如，抗戊型肝炎病毒VLPs疫苗[20]。

PEDV S1區(qū)包含多個主要B細胞表位和受體結合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關。其主要的兩個B細胞表位為744YSNIGVCK752、756SQYGQVKI771[21]。 據此，本研究通過設計融合PCR[22]將PEDV S1 的B細胞表位插入到HBcAg中，成功構建了pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1重組質粒。將其誘導表達、純化并復性，通過透射電鏡檢測到形成VLPs，表明利用大腸桿菌表達系統成功表達了PEDV S1 VLPs。本研究為后續(xù)PED疫苗的研制提供了進一步的參考。

4 結 論

作者將PEDV S1中含B細胞表位的270 bp片段插入到HBcAg的MIR區(qū)域，利用大腸桿菌表達系統表達其重組蛋白，經過透射電鏡檢測到成功形成HBcAg-PEDV S1 VLPs，為今后PED疫苗的研究提供了進一步的理論依據。