劉慧，曾祥權，謝文東，蔣世衛(wèi)，杜洪淼，周玉春，黃華

（1.北京市產品質量監(jiān)督檢驗院，北京 101300）（2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

李斯特菌屬革蘭氏陽性短桿菌，兼性厭氧、無芽孢、一般不形成莢膜[1]。迄今為止，已經分離并鑒定出17種李斯特菌菌株，代表菌株有單增李斯特菌（L.monocytogenes）、綿羊李斯特菌（L. iuanuii）、西爾李斯特菌（L. seeligeri）、英諾克李斯特菌（L.innocua）、威爾斯李斯特菌（L. welshimeri）、格氏李斯特菌（L.grayi）等[2]，其中單增李斯特菌可直接引起人類李斯特菌病[3]。單增李斯特菌作為一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于新鮮果蔬、乳制品、肉制品、水產品、冷凍冷藏食品及即食食品等各種食品中[4]，并在低溫、酸性、厭氧、高鹽等不利的生存環(huán)境下仍能生長，還可以在食物接觸表面（如不銹鋼）進行擴散，并在生物膜的保護下，耐受高濃度的消毒劑和抗菌劑[5,6]。值得注意的是，食品中單增李斯特菌的污染可能發(fā)生在生產、加工、包裝或分銷等任何一個環(huán)節(jié)。

國內外關于單增李斯特菌引起的食物中毒事件頻頻發(fā)生[7-9]。李斯特菌病的高危人群是孕婦、嬰幼兒、老年人及免疫功能障礙者[10]，其有非侵入性和侵入性兩種臨床表現。非侵入性臨床表現為較輕的食物中毒癥狀，如發(fā)燒、頭痛和腹瀉，醫(yī)學上稱之為發(fā)熱性腸胃炎；而侵入性疾病包括腦膜炎、腦炎、敗血癥及圍產期感染，可誘發(fā)早產、流產、甚至死產[11]。盡管與其他常見的食源性疾病如沙門氏菌病或大腸桿菌感染疾病相比，李斯特菌病的發(fā)生率較低，但其致死率高達20%~30%[12-14]，這意味著巨大的醫(yī)療負擔和公共衛(wèi)生威脅。另外，99%的李斯特菌病例是由于食用了被單增李斯特菌污染的食品所致[15]。特別是近年來隨著消費者生活習慣和方式的改變，即食食品的消費量逐年增加。由于其無需清洗或烹調處理即可直接食用的特點，更易被微生物污染，同時也加大了公眾對單增李斯特菌的暴露風險[16]。

鑒于單增李斯特菌對經濟和公共安全的嚴重危害，很多國家和組織對單增李斯特菌污染問題日益關注和重視，并對食品中的單增李斯特菌的限量進行了嚴格規(guī)定。歐盟委員會2073/2005號法規(guī)（歐洲委員會，2005）[17]規(guī)定嬰幼兒即食食品與特殊醫(yī)療用途的即食食品，在其產品保質期內對單增李斯特菌實施“零容忍”政策，即25 g內不得檢出（0/25 g）；對于其他類的無法支持單增李斯特菌生長的即食食品，在其產品保質期內單增李斯特菌的限量為100 CFU/g；對于其他類的可以支持單增李斯特菌生長的即食食品，單增李斯特菌的限量標準要根據食物鏈水平確定。在美國，食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定對于不支持單增李斯特菌生長的即食食品，單增李斯特菌含量應小于100 CFU/g[18]。在我國，食品安全國家標準規(guī)定食品（預包裝食品，不包括罐頭類食品）中不得檢出單增李斯特菌[19]。

目前，我國對單增李斯特菌的檢測仍以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法為主，該方法需要對樣品進行增菌，并通過選擇性培養(yǎng)基進行篩選，操作復雜繁瑣，檢測周期長且靈敏度不高。因此，迫切需要探索更加快速、便捷、準確、安全的檢測技術，這對實現在整個食物鏈中單增李斯特菌的實時監(jiān)控，及時有效預防單增李斯特菌誘發(fā)的食源性疾病及維護公共健康衛(wèi)生，減少經濟損失具有重要的現實意義。目前已經開發(fā)使用的單增李斯特菌快速檢測方法主要有基于抗原/抗體特異性結合的免疫分析法、基于分子生物學的核酸分析法、新型生物傳感器法及基于蛋白質檢測的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等[15,20-23]，這些快速檢測技術能夠大大提高單增李斯特菌的檢測效率和靈敏度。本文就傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及新興快速檢測在單增李斯特菌中的應用進行了系統(tǒng)闡述，并對其優(yōu)缺點進行了討論分析，以期為相關工作者針對單增李斯特菌的快速檢測提供參考依據。

1 傳統(tǒng)檢測方法

平板培養(yǎng)法是用于單增李斯特菌檢測的傳統(tǒng)方法，檢出限通常為1~5 CFU/25 g樣品[24]。由于單增李斯特菌易受加熱、冷凍、冷凍干燥、鹽、防腐劑及其他化學添加劑或天然抑菌化合物等因素的傷害而處于亞致死狀態(tài)，導致其很難被傳統(tǒng)檢測方法檢出[25]。此外，即便是單增李斯特菌活菌，也可通過進入休眠狀態(tài)以應對各種環(huán)境壓力，休眠狀態(tài)下的活菌細胞仍具有存活能力，但其在標準培養(yǎng)基上不可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBCN）[26]。鑒于單增李斯特菌具有亞致死損傷和VBCN狀態(tài)，針對其檢測的培養(yǎng)方法通常包括兩步富集過程。采用非選擇性或半選擇性培養(yǎng)基進行的預富集步驟可以使受傷的目標生物體復蘇并增殖，同時該步驟還可稀釋抑菌物質并對來自干燥或加工食品基質中的細菌細胞進行水化作用[27]；采用選擇性培養(yǎng)基（如含不同鹽類和抗生素）進行的富集步驟可抑制背景菌群生長，并對目標病原體進行選擇性增殖，增殖倍數可達百萬倍以便于其分離檢測[24]。通過對分離菌落進行染色鏡檢、動力試驗、生化鑒定、血清學試驗等可得出定性檢測結果。目前我國常用的方法主要是國標法（GB 4789.30-2010），其采用的平板培養(yǎng)法靈敏度高，成本低，可給出定性和定量結果，但操作步驟多，過程較復雜，從培養(yǎng)得到可疑菌落到檢測得出確定結果，整個周期需要5~14 d[28]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)病原體的方法被認為是金標準方法，可靠、準確，但耗時較長，不適用于緊急狀態(tài)下的快速檢測。近年來，不斷有研究對標準培養(yǎng)法進行改進，如在選擇性培養(yǎng)基中使用熒光或顯色底物，可避免傳代培養(yǎng)和生化鑒定，使得分析更加快捷便利[29,30]。

2 免疫測定方法

免疫學測定方法以病原微生物作為免疫原，制備相應的特異性抗體，通過抗原抗體的特異性結合進行測定。一個單克隆抗體可以識別一個特定抗原，而一個多克隆抗體可以識別一個或多個抗原。針對單增李斯特菌的免疫測定方法的檢測限（約103~107CFU/mL）受抗體和免疫試驗類型的影響。為了達到設定的檢測限標準，免疫測定時通常需要對樣品進行富集。在食品診斷中應用最廣泛的免疫學方法有酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）、酶聯(lián)熒光分析法（Enzyme-linked fluorescent，ELFA）、側向免疫層析法（Lateral flow immunoassay，LFI）和免疫磁性分離法（Immuno-magnetic separation，IMS）等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

在ELISA中，預先將抗原或抗體結合到固相載體表面上，然后與待測樣品中的抗體或抗原分子發(fā)生特異性結合，得到的免疫復合物所攜帶的酶可與特定底物相反應發(fā)生顏色變化。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，ELISA方法檢測時間短，大約30~50 h即可得出結果。但是，只有當病原體的數量足夠多時，免疫檢測才能提供有效的信息。因此，ELISA方法檢測靈敏度較低，大約在105~106CFU/mL之間，且抗體對病原體的親和力低，易受污染物等因素的干擾。免疫分析可以多種形式進行，通常采用的是夾心“三明治”反應類型，從而進一步減少分析時間、試劑和樣品量[31-33]。Magliulo等[34]人開發(fā)了一種可同時檢測包括單增李斯特菌在內的多種病原菌的夾心ELISA方法，在該測定中靶標病原菌的特異單克隆抗體被固定在96孔微量滴定板中，一旦待測樣品中的抗原抗體發(fā)生特異性結合，就添加辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體，并通過測定魯米諾底物的化學發(fā)光來測量酶活。該方法對所有靶標病原菌的定量限在104~105CFU/mL之間，測定前樣品需要進行富集。Portanti等[35]采用ELISA方法測定了包括肉品、海產品和乳制品在內的220個污染樣品中的單增李斯特菌，該方法得到ISO標準方法的驗證，加標樣品的檢測限為6.6×103CFU/mL，相對檢測限為5~10 CFU/g。夾心ELISA法操作簡單，特異性強，反應靈敏度高。然而，制備單克隆抗體的成本較高，使得采用ELISA試劑盒測試各種食物樣品的成本相對較高。

2.2 酶聯(lián)免疫熒光分析法（ELFA）

ELFA是將熒光物標記到抗體上，單增李斯特菌抗原和單克隆抗體發(fā)生特異性結合后，通過測定熒光強度檢測單增李斯特菌的數量，大大提高了檢測的靈敏度。Ueda等[36]使用一種基于ELFA原理的商品化檢測方法（VIDAS?LMO2）以測定食品樣品中的單增李斯特菌，該方法在弱酸性食物樣品中的檢測限為105CFU/mL，在酸奶和果汁等酸性食物樣品中的檢測限為106CFU/mL，且有效縮短了檢測時間，大約70 min即可獲得結果。ELFA中無顯色反應，檢測時間短，且靈敏度高于ELISA；但缺點是成本較高，目前主要應用于自動ELFA系統(tǒng)（VIDAS）。

2.3 側向免疫層析法（LFI）

側向免疫層析（LFI）是在免疫滲透技術基礎上建立的固相標記分析技術，結合了免疫技術和色譜層析技術的優(yōu)點。LFI的物化形式是免疫層析試紙條，核心部分由樣品墊、結合墊、反應墊、支撐墊和吸水墊五部分組成（如圖1所示）。在毛細管作用下，抗原與抗體在硝酸纖維素膜等固相載體上發(fā)生結合反應，利用標記材料的顯色作用或熒光效應，可通過肉眼直接觀察檢測條帶或在熒光激發(fā)狀態(tài)下測量熒光強度得到定性定量分析結果[37]。目前有膠體金、熒光素、量子點等多種標記材料。該方法靈敏度高、對操作人員要求低，并且不需要昂貴的儀器設備，易于實現現場檢測，主要作為定性或半定量篩選手段。Cho等[38]基于單克隆單增李斯特菌抗體LZF7和LZH1開發(fā)的LFI方法與磁處理聯(lián)合使用以檢測人工接種牛奶中的單增李斯特菌，檢測可在2 h內完成，檢測限低至102CFU/mL。Bla?kova等[39]利用LFI方法檢測經聚合酶鏈式反應（PCR）得到的擴增樣品中的單增李斯特菌基因，將PCR產物加入LFI檢測設備中，特異性擴增子的存在會顯示為一條暗線，檢測時間為28 h（包括24 h的富集時間），檢測結果為<10個細胞/25 mL樣品；Kovacevic等[40]將LFI方法應用于肉類生產加工不同階段的環(huán)境樣品中單增李斯特菌的檢測，研究結果表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR測定相比，LFI同樣具有特異性，且大批量檢測樣品時（>300個）依然具有較高的靈敏度。

圖1 側向層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic diagram of lateral flow test strip

2.4 免疫磁性分離法（IMS）

免疫磁性分離法又稱為免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）分離技術，該技術是對具有超順磁性的微粒表面進行化學修飾，使之可與特異性抗體發(fā)生結合，成為能夠捕獲特異性抗原的磁珠。將免疫磁珠與待測溶液混合，若有靶標抗原存在，即被免疫磁珠捕獲，形成抗原-免疫磁珠復合物，并在適當的磁場條件下發(fā)生分離，從而達到富集靶標抗原的目的[41]，如圖2[46]所示。該技術特異性強，靈敏度高，分離富集速度快，適用范圍廣。在實際應用中，該方法通常與ELISA技術、PCR技術、熒光信號技術等聯(lián)合使用以改進和增強方法的靈敏度。Yang等[42]采用單增李斯特菌單克隆抗體、免疫磁珠分離技術，結合實時熒光PCR檢測方法，建立乳品中單增李斯特菌的納米免疫磁分離-實時熒光PCR快速檢測方法，該方法的檢測限為>102CFU/0.5 mL。Wang等[43]將納米免疫磁分離技術與量子點熒光分析相結合，可實現2 h內同時靶向檢測食物樣品中的單增李斯特菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，該方法在碎牛肉、雞肉、西藍花和生菜樣品中的檢測限為20~50 CFU/mL。Walcher等[44]將順磁珠表面涂上重組單增李斯特菌噬菌體內溶素產生的細胞壁結合域蛋白（cell wall-binding domain proteins，CBD），形成的CBD磁珠用于原奶中單增李斯特菌的檢測，該方法的靈敏度為102~103CFU/mL。Amagliani等[45]人開發(fā)了一種更為靈敏的多重磁珠捕獲雜交-三重實時熒光PCR技術，可同時檢測海產品中的單增李斯特菌和沙門氏菌，該方法的檢測限為1 CFU/g。

3 分子生物學檢測方法

3.1 常規(guī)PCR

PCR技術通過對單增李斯特菌的特異性目標基因設計相應的引物并用于擴增這一段基因，從而獲得大量待測基因以確證為單增李斯特菌。常見的目標基因有hly，inlA，inlB、iap、16S和23S rRNA以及編碼入侵相關蛋白p60、氨肽酶C、磷脂酶C蛋白、纖連蛋白結合蛋白和dth-18延遲型超敏蛋白的基因[47,48]。PCR技術特異性強、穩(wěn)定性高、重現性好且操作簡便，被廣泛應用于食品中單增李斯特菌的檢測。常規(guī)的定性或半定量PCR依賴于擴增產物的終點分析（電泳或熒光）。Amagliani等[49]采用商品化DNA提取試劑盒與常規(guī)PCR技術對人工接種并富集24 h后的豬肉香腸和馬蘇里拉奶酪中的單增李斯特菌進行檢測，方法靈敏度可達1 CFU/g。Delibato等[50]將PCR技術與微流控芯片電泳系統(tǒng)結合對即食肉制品、奶酪、煙熏三文魚等食物樣品中的單增李斯特菌檢測，該方法與ISO標準方法檢出結果一致。但是，PCR技術無法區(qū)分DNA是來自死細胞還是活細胞，往往會出現假陽性結果[51]。為了避免死菌DNA造成的假陽性結果，可將疊氮溴乙錠（EMA）和疊氮溴化丙啶（PMA）與PCR聯(lián)合使用[52]。PMA和EMA不能穿透活菌，但很容易進入細胞膜受損的死菌細胞并與其DNA分子結合，導致DNA分子無法進行PCR擴增，從而可用PCR技術將死活菌區(qū)分開。還可使用逆轉錄PCR技術，與DNA相比，mRNA的半衰期更短，在細胞死亡之后降解更快，因此可以作為有用的目標分子以檢測樣本中存在的活細胞[53]。然而，當選擇毒力因子mRNAs作為目標分子時，必須認識到這些mRNAs有時只在特定環(huán)境條件下表達。而且，在不受DNA干擾情況下提取mRNA是一個繁瑣的過程[54]。近年來，還有研究開發(fā)出過濾技術，能夠從活細胞中快速清除死亡和受損細胞[55]。此外，單增李斯特菌是一種低細胞數量細菌[20]，有研究發(fā)現濃縮肉湯中英諾克李斯特菌（L.innocua）的數量遠遠超過單增李斯特菌[48]，從而導致單增李斯特菌很難被檢出，出現假陰性結果。目標DNA的缺失或濃縮食品中酚類物質、核酸酶等抑制劑的存在，也會造成假陰性結果。因此，許多研究將內參（Internal control，IAC）DNA片段添加到反應管中與目標DNA同時擴增以檢測PCR抑制劑是否存在，辨別假陰性。Rip等[56]以hly基因為靶標基因，并對內參基因IAC進行優(yōu)化，建立的PCR方法用于檢測人工接種并富集22 h的卡門培爾奶酪和鴕鳥肉樣品中的單增李斯特菌。

3.2 多重PCR（Multiplex PCR，mPCR）

多重PCR檢測是在一個反應系統(tǒng)中加入多組引物，同時擴增多個核酸片段的PCR反應。操作過程與反應試劑與常規(guī)PCR相同，特異性增強，可同時檢測不同食源性病原體，能夠實現高通量檢測[57]。Chen等[21]通過比較基因組學方法篩選出50個ST121菌株的候選基因，從中選擇靶標基因設計該菌株特異性引物，并以prfA基因設計單增李斯特菌的特異性引物，基于此開發(fā)建立了一種用于鑒定單增李斯特菌ST121菌株的多重PCR方法。該方法快速準確、特異性強，檢測限為253 fg/μL基因組，將其用于人工接種牛奶（富集4~12 h）中ST121菌株的檢測，靈敏度達到2.5~2.5×104。Zhang等[58]采用基于微芯片電泳結合激光誘導熒光的多重PCR技術用于測定單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌，該方法分析時間短，試劑用量少，選擇性強，靈敏度高。在最佳實驗條件下，可在135 s內分離出三種致病菌的PCR產物，其中單增李斯特菌的檢測限為1.8 ng/μL；將該方法用于人工接種牛奶中三種致病菌的檢測，單增李斯特菌的靈敏度為68 CFU/mL。Rawool等[59]開發(fā)了一種新穎的多重PCR方法用以鑒定李斯特菌屬，并區(qū)分單增李斯特菌及其主要譜系（LI，LII，LIII），該方法快速、廉價，可用于篩選和鑒定單增李斯特菌的亞型分型。然而，與常規(guī)PCR使用單個引物相比，多重PCR引物之間易發(fā)生相互干擾，導致擴增效率降低[60]。

3.3 實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）

實時熒光定量PCR是在反應體系中加入特定熒光物質，對擴增產物進行標記跟蹤和實時監(jiān)測。熒光強度的變化取決于累積的PCR產物的量，通過監(jiān)測其變化可繪制標準曲線來測量實時PCR反應進程并進行定量分析[61]。反應體系中加入的熒光分子可以使標記有熒光染料以及猝滅劑的特異性探針，如TaqMan探針、分子信標、蝎子引物、雙雜交探針及復合探針等，也可以是非特異性DNA結合染料，如SYBR Green I。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR的特異性較強，靈敏度較高，操作簡便，且具有可定量的優(yōu)勢[62]。Jin等[63]根據李斯特菌的ssrA基因設計引物和探針，通過使用實時PCR和高分辨熔融曲線分析鑒定食物樣品中包括單增李斯特菌在內的6種李斯特菌，其中單增李斯特菌的檢測靈敏度為102CFU/mL。Schoder等[64]分別采用實時熒光定量PCR和ISO標準方法對76種食物樣品中的單增李斯特菌進行檢測，結果表明，相較于ISO標準方法，實時定量PCR方法的準確性更高（96%），特異性更強（100%），靈敏度更高（76.9%）。Wei等[65]將免疫磁性分離（IMS）技術與實時熒光定量PCR結合建立了豆芽樣品中單增李斯特菌的快速檢測方法，該方法的擴增效率為96.7%，檢測時間短（27 h），特異性強為（100%），靈敏度（95%）和準確性（95.6%）均較高，檢測限低至4.4 CFU/g。

3.4 環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

環(huán)介導等溫擴增的特征是針對目標DNA鏈上的6個特異性區(qū)域設計4個不同的引物，然后再利用鏈置換型DNA聚合酶在等溫條件（60~65 ℃）下進行擴增，整個反應持續(xù)1 h，最后通過肉眼觀察白色渾濁對檢測結果進行判斷[66]。與常規(guī)PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等步驟，擴增效率極高，可在15~60 min內實現109~1010倍的擴增，具有快速、簡單、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點[67,68]。該技術不需要專門的PCR儀器即可實現現場高通量快速檢測，其檢測成本遠遠低于實時熒光定量PCR。Wan等[69]根據hlyA基因設計6條引物，建立了改良單疊氮丙啶-LAMP方法用于檢測人工接種食品樣品中的單增李斯特菌，該方法在純培養(yǎng)物和食品樣品中的檢測限分別為102~3.1×103CFU/g。Mik?-Krajnik等[70]基于商品化生物發(fā)光方法（3MTM分子檢測系統(tǒng)，MDA）開發(fā)了一種新穎的LAMP方法用于檢測不銹鋼和聚乙烯表面上的三種單增李斯特菌菌株，該方法的檢測限為100~102/100 cm2，特異性和靈敏度均為100%。Feng等[68]將磁分離適配體捕獲與LAMP方法結合對17種食物樣品中的單增李斯特菌進行分析檢測，該方法不需要預先培養(yǎng)富集，總測定時間約為3 h，檢測限低至5 CFU/mL，準確性為100%。

3.5 重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase polymerase amplification，RPA）

重組酶聚合酶擴增（RPA）是由特定的酶和蛋白組合（重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶）參與，在恒定溫度下反應5~20 min即可實現微量核酸指數擴增的新技術[71]。RPA與常規(guī)PCR擴增技術一樣具有特異性強、靈敏度高等特點，但反應速度更快且不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環(huán)設備。與其他等溫擴增技術相比，RPA技術所需溫度更低（37~42℃），能在廣泛環(huán)境溫度下工作，更適合于現場檢測。目前，已有RPA應用于單增李斯特菌檢測的報道。如Du等[72]將RPA與免疫層析試紙條（lateral flow strip，LF）相結合建立了一種單增李斯特菌快速檢測方法（RPA-LF），等溫擴增與產物檢測步驟可以在15 min內完成，且具有較高的靈敏度和特異性，在純培養(yǎng)條件下檢測限低至1.5×101CFU/mL。Wang等[73]采用同樣的策略建立了一種改進的RPA-LF方法用以檢測不同食品樣品中的單增李斯特菌，改進后的方法靈敏度更低（10 CFU/25 g樣品），并可有效消除引物二聚體的假陽性信號。

3.6 DNA微陣列（DNA microarray）

DNA微陣列又稱為基因芯片技術，主要是將多個寡聚核苷酸序列作為探針，有序地排列在硅膠板或其他固體物質上，與待測樣品的標記基因進行雜交，接著通過熒光的激光共聚檢測器對芯片進行掃描，分析熒光信號得到檢測結果[74]。一個基因芯片上可以含有成千上萬個探針，一次同時檢測出多種致病菌。因此，DNA微陣列技術大大提高了檢測工作的效率，可實現食源性致病菌的高通量分析，已成功應用于多種食源性致病菌的檢測與基因分型。Volokhov等[75]將DNA微陣列技術與多重PCR擴增相結合，開發(fā)出可用于包括單增李斯特菌在內的6種李斯特菌同時檢出的芯片制作及檢測方法。Bang等[76]從單增李斯特菌菌株ATCC19111的基因組中隨機選出60個不同大小的DNA片段并將其固定在胺涂層玻璃載玻片上制作出探針用以對單增李斯特菌進行鑒定區(qū)分，將該探針與從單增李斯特菌菌株中提取的DNA基因組雜交，發(fā)現16珠單增李斯特菌的雜交信號為98%~100%，將該DNA芯片用于人工接種牛奶中單增李斯特菌的檢測，檢測限約為8 logCFU/mL。目前，在DNA微陣列檢測過程中，尚缺乏簡便有效的方法以獲得足夠量的熒光標記DNA與探針進行雜交，并獲得顯著的特異性陽性結果。

3.7 熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization，FISH）

FISH是將熒光素直接或間接標記的核酸探針與待測樣品中的核酸序列按照堿基互補配對原則進行雜交，經洗滌后直接在熒光顯微鏡下觀察。Rohda等[77]對近年來應用于食品中單增李斯特菌檢測的FISH方法進行了綜述。Fuchizawa等[78]將過濾培養(yǎng)和FISH技術相結合，以李斯特菌的23S rRNA與單增李斯特菌的16S rRNA為探針，對人工接種的煙熏鮭魚、奶酪、火腿、卷心菜等食物樣品中的李斯特菌和單增李斯特菌進行檢測，該方法與傳統(tǒng)的平板菌落計數法相比，檢測時間縮短（12~16 h），靈敏度可達到102~103CFU/mL。Moreno等[79]分別采用標準培養(yǎng)方法、常規(guī)PCR方法以及基于直接活菌計數（Direct Viable Count，DVC）的FISH方法對191份新鮮蔬菜和冷凍蔬菜樣品中的李斯特菌和單增李斯特菌進行檢測，研究結果表明，標準培養(yǎng)、PCR和DVC-FISH檢測系統(tǒng)分別檢出4%、10%、33%的樣品呈陽性，而DVC-FISH相較于其他兩種方法，檢測時間更短，靈敏度更高，即培養(yǎng)7 h后，可檢出活菌細胞7.4×102~7.4×102CFU/g。

4 生物傳感器（Biosensors）

生物傳感器是一類能感應生物反應并將該反應經過信號放大轉化為可以檢測到的光、電等化學信號的分析設備，主要由生物受體（微生物、細胞、酶、核酸、抗原、抗體等）和轉換器組成，如圖3所示。轉換器可以是光學的（拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜、表面等離子體共振、光纖）、電化學的（電流、阻抗、電位、電導）、熱學的以及基于質量學（壓電、磁）的[80]。由于生物傳感器在微生物快速檢測中表現出的優(yōu)良性能，目前也有許多研究集中在為單增李斯特菌檢測開發(fā)各種敏感的生物傳感器?；诠鈱W原理的生物傳感器是利用光學材料對適配體、抗原或抗體進行修飾，然后通過適配體與病原體或抗原與抗體之間的特異性結合，以光學材料特性的變化反映病原菌濃度的變化[81]。如Chen等[82]結合免疫磁性分離、脲酶催化和pH指示劑開發(fā)了一種光學生物傳感器可對單增李斯特菌進行快速檢測，該方法的檢測限低至1.0×102CFU/mL，將其應用于人工接種生菜樣品中單增李斯特菌的檢測，平均回收率為95.1%。近年來電化學生物傳感器因其高靈敏度、高通用性、強便攜性等特點受到人們廣泛關注。這些傳感器依賴于核酸、抗原、抗體、適配體等的生物偶聯(lián)，將生物信號經電子或電阻傳導轉化為可檢測的化學信號，主要類型有電流型、阻抗型及電導型等[83]。如Radhakrishnan等[84]將單增李斯特菌的單克隆抗體lgG1固定在Au電極上作為單增李斯特菌的檢測探針，抗體與單增李斯特菌的特異性結合引起電極表面阻抗的變化，通過免疫傳感器的電化學阻抗變化來反映單增李斯特菌的濃度，該方法可特異性地檢測未經濃縮的人工接種番茄提取物中的單增李斯特菌，檢測靈敏度高度達4 CFU/mL。Niu等[85]利用金納米粒子（AuNPs）和部分還原氧化石墨烯（p-RGO）修飾電極構建了檢測單增李斯特菌的hly基因序列的電化學DNA生物傳感器，以亞甲基藍為電化學指示劑，采用微分脈沖伏安法監(jiān)測目標DNA的雜交。在最佳條件下，該方法檢測的濃度范圍為1.0×10-13~1.0×10-6mol/L，檢測限為3.17×10-14mol/L。此外，也有基于質量學的壓電生物傳感器用于食物中單增李斯特菌檢測的報道。如Shmarma等[86]采用單增李斯特菌的商品化多克隆抗體，并使用壓電懸臂生物傳感器代替電化學傳感器檢測牛奶中的單增李斯特菌，該方法的檢測限為103細胞/mL。以上列舉的生物傳感器方法省時、簡便，但有些方法的靈敏度有待進一步改善。

圖3 生物傳感器基本組件圖[81]Fig.3 Basic component of biosensor

5 其他快速檢測方法

5.1 飛行時間質譜技術

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，MALIDI-TOF-MS）技術具有分析時間短、試驗成本低、可實現高通量檢測等優(yōu)勢，已廣泛應用于食源性病原微生物的鑒定。工作原理是每種病原菌都具有其特征性蛋白質指紋圖譜，細菌蛋白與樣品基質結合后，通過激光電離提取總蛋白，并經由檢測器被捕獲，根據不同質荷比（m/z）的蛋白質通過飛行管的時間不同進行分離，最后通過與數據庫圖譜比對得出定性分析結果，從而實現對病原菌的鑒定和分型[87]。在2008年，Barbuddhe等[88]利用全細胞MALDI-TOF技術，通過獲得細菌細胞內核糖體蛋白的特征性指紋圖譜，對不同來源和物種水平的李斯特菌進行鑒定。該實驗中，首先從純培養(yǎng)板中提取李斯特菌落，然后采用乙醇、甲酸和乙腈對其進行處理以獲得細胞提取物，最后通過MALDI-TOF監(jiān)測4000~12000 u范圍內的核糖體蛋白特征峰。通過觀察某些特征峰是否存在，即可在譜系水平分離出單增李斯特菌，該結果得到脈沖凝膠電泳技術的證實。最近，Jadhav等[21]使用MALDI-TOF對不同來源的澳大利亞乳制品中的單增李斯特菌進行鑒定和來源追蹤。然而，與其他用于菌株基因分型的方法相比，MALDI-TOF鑒定時更容易受培養(yǎng)基類型、樣品制備、樣品基質等因素的干擾。

5.2 噬菌體

圖5 噬菌體P100修飾的磁性顆粒分離單增李斯特菌[83]Fig.5 Isolation and separation of L. monocytogenes using bacteriophage P100-modified magnetic particles [83]

噬菌體（bacteriophage）是一種特殊的病毒，能夠感染并殺死細菌或真菌等微生物。噬菌體受體結合蛋白能夠與宿主細胞表面的特異性受體發(fā)生結合，這種特性賦予了噬菌體很高的生物技術應用價值。近年來，結合分子生物學、免疫學及其他學科建立起來的新興噬菌體檢測方法特異性強、靈敏度高并可區(qū)分死菌和活菌細胞，在食源性病原菌快速檢測領域中顯示出了巨大的優(yōu)勢[89,90]。Kretzer等[91]利用噬菌體編碼的肽聚糖水解酶（內溶素）的細胞壁結合域（CBD）蛋白代替抗體固定在順磁珠上作為與單增李斯特菌特異性結合的配體用以富集分離目標菌，并將該技術與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結合檢測人工接種和自然污染食物樣品（生菜、奶酪、鮭魚、肉、奶）中的單增李斯特菌。研究結果表明，樣品預濃縮6 h后，該方法對于所有食品基質中單增李斯特菌的檢測限為102CFU/g，而預濃縮24 h后，除軟奶酪外，其他所有食品基質中單增李斯特菌的檢測限均達到0.1 CFU/g，方法靈敏度明顯優(yōu)于標準培養(yǎng)方法。Walcher等[42]同樣利用噬菌體CBD蛋白包被的順磁珠分離富集人工接種原奶中的單增李斯特菌，并利用平板計數法或RT-PCR技術檢測，方法檢測限范圍為102~103CFU/mL。Zhou等[92]利用三種不同大小的磁性顆粒通過化學和物理方法固定化噬菌體P100，建立了一種從復雜食物基質中分離單增李斯特菌的噬菌體輔助磁性分離方法（如圖4所示），并通過研究噬菌體的偶聯(lián)率及捕獲單增李斯特菌特異性基因片段的效率對每種噬菌體修飾磁性顆粒復合物的性能進行了評價。研究結果表明，與化學固定化方法相比，采用物理方法固定化的噬菌體修飾磁性顆粒復合物對單增李斯特菌的選擇性和捕獲效率更強。

圖4 MALDI-TOF-MS微生物檢測原理[87]Fig.4 Principle of MALID-TOF-MS in microbiological detection

6 結語

近年來，由單增李斯特菌感染引起的食源性疾病逐年增多，人們對單增李斯特菌檢測的關注度越來越高。目前我國對單增李斯特菌的檢測有多種，其中多種PCR方法已經形成標準并頒布實施。免疫學測定方法，簡單快捷，尤其是免疫層析試紙條攜帶方便，適合現場快速檢測，但免疫測定方法對抗體制備具有較高要求，易受其他雜菌干擾，靈敏度不夠高。使用DNA或RNA序列作為靶標的分子測定方法特異性和靈敏度更高，但該方法的預處理較復雜，對操作技術有較高要求，主要用于實驗室分析，不適合現場檢測?；诿庖邔W和核酸分析的生物傳感器技術由于操作簡便、檢測周期短、靈敏度高等特點逐漸發(fā)展起來，但是必須根據反應信號選擇合適的敏感元件，盡量減少干擾并降低背景噪音。MALDI-TOF方法分析時間短，可實現高通量檢測，但容易受培養(yǎng)基類型、樣品制備、樣品基質等因素的干擾。而基于噬菌體的方法則需要與分子生物學、免疫學及其他學科相結合。以上這些技術雖然目前還存在很多不足，但隨著科學技術的發(fā)展，會得到進一步的改進和完善，特別是近年來不同學科之間的相互滲透日益加強，不同方法之間的結合使用會成為未來食源性單增李斯特菌檢測的發(fā)展趨勢。