唐昊，李沅秋，甘曉鳳，羅朝兵

（樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000）

竹子為多年生禾本科常綠植物，竹筍為竹子的嫩芽部分，除了富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素、氨基酸和膳食纖維等，還含有有機(jī)酸類、三萜類、酚類物質(zhì)和大量的黃酮類物質(zhì)，因此具有極高的食用價(jià)值及藥理價(jià)值[1-3]。目前，關(guān)于竹筍營(yíng)養(yǎng)成分的研究進(jìn)展主要使用傳統(tǒng)的生理生化方法，如陳松河等[2]比較了5種牡竹屬筍用竹竹筍營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)牡竹屬筍富含氨基酸、蛋白質(zhì)和粗纖維。牛兆輝等[3]測(cè)定了小佛肚竹竹筍的營(yíng)養(yǎng)成分，表明其主要成分組成為粗纖維、粗脂肪和蛋白質(zhì)。此外，還發(fā)現(xiàn)龍竹竹筍富含蛋白質(zhì)、總糖、粗脂肪、粗纖維和單寧等物質(zhì)[4]。這些研究大多針對(duì)竹筍的幾類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并未全面的了解竹筍的營(yíng)養(yǎng)成分，因此利用代謝組學(xué)的方法對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行全面研究是十分必要的。

代謝組學(xué)是通過氣相色譜（gas chromatography，GC）、液相色譜（liquid chromatography，LC）與質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）聯(lián)用等技術(shù)手段，采用組學(xué)分析方法，研究不同樣本的所有代謝物，具有耗時(shí)短，準(zhǔn)確度高，廣覆蓋的特點(diǎn)[5,6]。其中廣泛靶向代謝組學(xué)是結(jié)合了非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，基于廣泛靶向代謝組數(shù)據(jù)庫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，定性、定量樣本中代謝物檢測(cè)方法[7,8]。因此，可利用廣泛代謝組學(xué)對(duì)食品進(jìn)行代謝產(chǎn)物的鑒定與分析，有助于全面了解食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9]。

慈竹（Bambusa emeiensis），禾本科慈竹屬，地下莖合軸叢生型，低丘或平原地區(qū)的地理?xiàng)l件和環(huán)境極其適宜生長(zhǎng)，尤其是四川、貴州和湖南等地區(qū)，是我國(guó)西南地區(qū)具有較廣生長(zhǎng)面積和較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的竹種[10]。慈竹筍顏色潔白，口感清脆，可被當(dāng)作鮮菜、筍干及罐頭等多類食品[11]。本研究應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）手段，全面解析慈竹筍營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)從清除自由基、相對(duì)還原力、總抗氧化能力等方面系統(tǒng)研究其抗氧化活性，為促進(jìn)慈竹筍的全面開發(fā)提供部分基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 m高的慈竹筍采集于四川省樂山市中區(qū)竹林（東經(jīng)103.77，北緯29.57）；甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸均購于Sigma公司；核糖醇、吡啶、BSTFA+TMCS、甲氧基胺鹽酸鹽均購于TCI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000液相色譜儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Q Exactive Focus，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；7890A氣相色譜儀，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；5975C質(zhì)譜儀，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；53050真空濃縮儀，德國(guó)艾本德公司；SCIENTZ-48組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；H1650-W冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及代謝物提取

2019年6月，采集1 m高的慈竹筍，分別收集竹筍基部、中部和頂部樣本各5 g，混合后放置于50 mL凍存管，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱備用，剩余竹筍樣本用于粗提物的提取。生物學(xué)重復(fù)9次。

取竹筍100 mg及5顆鋼珠放入5 mL凍存管中，液氮速凍5 min，使用高通量組織研磨儀在70 Hz條件下研磨1 min。加入1400 μL預(yù)冷甲醇，渦旋振蕩30 s（用于GC-MS檢測(cè)樣本需要加入60 μL 0.2 mg/mL核糖醇作為內(nèi)標(biāo)）。超聲波室溫處理30 min，加入750 μL氯仿和1400 μL預(yù)冷dd H2O，渦旋振蕩1 min，然后14000 r/min冷凍離心10 min，取上清液1 mL并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管用于真空離心濃縮。

1.3.2 GC-MS

濃縮后的樣本加入60 μL甲氧基溶液渦旋振蕩30 s，37 ℃條件下反應(yīng)2 h后加入60 μL BSTFA試劑（含1%三甲基氯硅烷），37 ℃條件下反應(yīng)90 min。12000 r/min冷凍離心10 min，取上清液加入檢測(cè)瓶中。從每個(gè)待測(cè)樣本各取20 μL混合成QC樣本（校正分析結(jié)果偏差及儀器自身造成失誤），最后用待測(cè)樣本進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，共測(cè)9次。

采用HP-5MS毛細(xì)管柱（5%苯/95%甲基聚硅氧烷30 m×250 μm i.d.，0.25 μm film thickness，Agilent J& W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA），以1 mL/min的恒流氦氣來分離衍生化物質(zhì)，1 μL樣品以20:1分流比通過自動(dòng)進(jìn)樣器注入。注射溫度為280 ℃，接口設(shè)置為150 ℃，離子源調(diào)整到230 ℃。升溫程序以60 ℃為初始溫度，持續(xù)2 min，以10 ℃/min速率上升至300 ℃并停留5 min。質(zhì)譜采用的是范圍從35到750（m/z）的全掃描方法。

1.3.3 LC-MS/MS

用250 μL 2-氯苯丙氨酸（0.04 μg/g）甲醇水溶液（1:1，4 ℃）溶解濃縮樣品，0.22 μm膜過濾，得到待測(cè)樣本，進(jìn)行LC-MS/MS上機(jī)檢測(cè)。自每個(gè)待測(cè)樣本各取20 μL混合成QC樣本，用待測(cè)樣本進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，共測(cè)9次。

色譜條件：T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），調(diào)整自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為8 ℃，柱溫條件為40 ℃，以0.25 mL/min的速度進(jìn)樣2 μL，其中選擇正離子0.1%甲酸水（D）-0.1%甲酸乙腈（C）和負(fù)離子5 mM甲酸銨水（B）-乙腈（A）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，具體程序?yàn)椋?~1 min，2% A/C；1~9 min，2%~50% A/C；9~12 min，50%~98% A/C；12~13.5 min，98% A/C；13.5~14 min，98%~2% A/C；14~20 min，2% C-正模式（14~17 min，2% A-負(fù)模式）。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜電離方式ESI，其中正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV。鞘氣的流速30 arb，輔助氣流速10 arb，毛細(xì)管溫度325 ℃，70000的分辨率全掃描且范圍是81~1000，HCD二級(jí)裂解，碰撞電壓30 eV，選用動(dòng)態(tài)排除將無關(guān)的MS/MS信息去除。

1.3.4 竹筍粗提物的制備

將采集的新鮮慈竹筍用蒸餾水沖洗3次，切成3 cm×3 cm小塊，55 ℃烘干至含水量小于6%，將其粉碎后并過60目篩，得竹筍粉。稱取竹筍粉3 g，加入120 mL 70%乙醇，35 ℃振蕩萃取24 h，70 ℃水浴回流1.5 h，提取上清液。向剩余物中加入50%乙醇60 mL，70 ℃水浴回流1.5 h，提取上清液。將所剩殘?jiān)?000 r/min離心10 min，提取上清液。將所有上清液合并，抽濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粘稠狀，最后放人真空干燥箱中干燥。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

對(duì)慈竹筍粗提物的抗氧化物能力進(jìn)行了測(cè)定，主要從清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力、相對(duì)還原力和總抗氧化能力五個(gè)方面進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作和武靜文等在對(duì)毛竹、麻竹及雷竹的竹筍及筍殼提取物的實(shí)驗(yàn)方法一致[12-17]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用EXCEL繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 慈竹筍成分組成及分析

2.1.1 GC-MS

運(yùn)用GC-MS平臺(tái)共檢測(cè)到75個(gè)代謝物，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分為氨基酸、糖類、核苷酸、有機(jī)酸、脂肪酸、磷酸、胺類、多元醇以及其他等九大類（表1）。其中氨基酸數(shù)量最多，有24個(gè)代謝物，比例為32.00%，相對(duì)含量為7.72%；有機(jī)酸數(shù)量?jī)H次于氨基酸，達(dá)到22個(gè)，占比為29.33%，相對(duì)含量為12.27%；相對(duì)含量最高的是糖類（74.30%），共有9個(gè)代謝物，占比為12.00%；其余代謝物相對(duì)含量較低，僅占總含量的5.71%。

表1 慈竹筍代謝物分類及相對(duì)含量Table 1 Metabolite classification and relative abundance of B.emeiensis shoot

進(jìn)一步分析表明，相對(duì)含量在1%以上的代謝物有12種（表2）。相對(duì)含量在1%以上的代謝物有12種，其中相對(duì)含量最多的是糖類物質(zhì)，包括葡萄糖（34.98%）、果糖（19.18%）、蔗糖（14.99%）、半乳糖（3.02%）和麥芽糖（1.04%）；有機(jī)酸3種：奎寧酸（7.14%）、蘋果酸（2.46%）和莽草酸（1.54%）；氨基酸2種：天門冬氨酸（1.93%）和絲氨酸（1.64%）；磷酸1種：磷酸（3.98%）；多元醇1種：肌醇（1.05%）。

表2 慈竹筍GC-MS代謝組成分Table 2 Components of B. emeiensis shoot metabolome by GC-MS

2.1.2 LC-MS/MS

當(dāng)通過LC-MS/MS共檢測(cè)鑒定出226種代謝物，其中相對(duì)含量最高的是有機(jī)酸。由表3可知，占總量0.5%以上的代謝物共有16種，包括苯及取代并苯衍生物類3種：苯甲酸（31.44%）、對(duì)羥基苯甲醛（12.88%）和苯乙醛（0.89%）；羧酸1種：反式桂皮酸（0.71%）；嘌呤核苷類1種：肌苷（1.74%）；脂肪酰基類3種：甘油磷酸膽堿（1.14%）、膽堿（1.12%）和磷酸膽堿（0.66%）；氨基酸4種：L-谷氨酸（1.96%）、L-苯丙氨酸（0.63%）、肌酸酐（0.56%）和L-酪氨酸（0.55%）；糖類2種：阿洛酮糖（6.24%）和酮戊二酸（0.55%）；生物堿類1種：甜菜堿（21.28%）；未知類1種：植物鞘氨醇（2.24%）。

表3 慈竹筍LC-MS/MS代謝組成分Table 3 Components of B. emeiensis shoot metabolome by LC-MS/MS

2.1.3 成分分析

大量的研究表明，竹筍中含有豐富的糖類、有機(jī)酸、氨基酸和多肽類等物質(zhì)[18-20]。在本研究中，GC-MS的結(jié)果顯示，慈竹筍的代謝物種糖類的相對(duì)含量達(dá)到了74.30%。且有其他研究表明，如在Yushania alpina竹筍中，蔗糖、果糖和葡萄糖含量分別達(dá)到了0.58 g/100 g、0.62 g/100 g和0.77 g/100 g[21]。Wang等[22]的論述也表明竹筍因其含有的豐富糖類可以作為一種蔬菜為人類的生存提供能量和營(yíng)養(yǎng)。另外，在GC-MS和LC-MS/MS的結(jié)果中，有機(jī)酸的相對(duì)含量都較高，其中含量最高的為苯甲酸，其次是甜菜堿和對(duì)羥基苯甲醛，相對(duì)含量均大于10%。苯甲酸在許多植物中參與了非生物因素的響應(yīng)，如在大豆和番茄中能誘導(dǎo)植物對(duì)寒冷、干旱、和熱產(chǎn)生耐受性[23]，與水脅迫協(xié)同作用可以進(jìn)一步導(dǎo)致小麥幼苗生長(zhǎng)高度變低[24]，苯甲酸還可以與肉桂酸協(xié)同作用解除氨基乙酰乙酸的抑花作用[25]，此外，苯甲酸常用于食品防腐劑，對(duì)腐敗微生物具有良好的抑制作用[26]。甜菜堿具有良好的抗氧化作用[27,28]，具有降血脂的作用，而對(duì)羥基苯甲醛對(duì)由氧化應(yīng)激導(dǎo)致血腦屏障具有保護(hù)作用[29]。這些結(jié)果表明慈竹筍是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的功能性食品原料，同時(shí)其含有的有機(jī)酸在竹筍的保鮮領(lǐng)域可能具有一定的潛在開發(fā)價(jià)值。通過這兩種色譜方法，還鑒定出多種相對(duì)含量較高的氨基酸，如在本研究中發(fā)現(xiàn)的天冬氨酸和谷氨酸相對(duì)含量均較高（>1%），與五種牡竹屬竹種中檢測(cè)到的鮮味呈味氨基酸含量較高具有一定的一致性，表明慈竹筍中這兩種氨基酸可能與慈竹的鮮味程度相關(guān)[2]；此外，天冬氨酸、絲氨酸及苯丙氨酸等在其他研究的代謝組中也被檢測(cè)到[30,31]，其中對(duì)于苯丙氨酸而言，其在多種竹種中被認(rèn)為與竹筍的苦味密切相關(guān)[2,30]，這些成分暗示了慈竹筍中的氨基酸在食品應(yīng)用上，除了提供營(yíng)養(yǎng)還可能影響慈竹筍的品嘗感官。對(duì)于竹筍種含有的脂肪類物質(zhì)，其含量都相對(duì)較少，在GC-MS結(jié)果中，脂肪酸類物質(zhì)僅含0.17%，且在LC-MS/MS結(jié)果中，只有膽堿（1.12%）和甘油磷酸膽堿（1.14%）兩種脂類物質(zhì)相對(duì)含量大于1%，表明慈竹筍成分中脂類物質(zhì)含量少。

2.2 慈竹筍提取物抗氧化分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

通過檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)和DPPH反應(yīng)后的吸光度，獲得反應(yīng)前后DPPH的濃度變化，可判斷待測(cè)物質(zhì)的清除DPPH自由基能力。如圖1所示，慈竹筍提取物對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，且隨著劑量的增加，DPPH自由基清除率相應(yīng)增加，并成劑量依賴關(guān)系。當(dāng)粗提物的濃度為0.1 mg/mL時(shí)，清除率為15.50%，Vc的清除率為78.10%；濃度為0.2 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到28.20%，Vc清除率為83.70%；濃度增加到1.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到82.70%，Vc為93.40%。武靜文等的研究顯示，當(dāng)毛竹、麻竹及雷竹粗提物濃度在0.1 mg/mL~0.8 mg/mL之間時(shí)，隨著濃度的增加，對(duì)自由基的清除作用增幅較大，而當(dāng)粗提物濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，增幅變緩[12]。此外，陳曉燕等的研究結(jié)果也表明當(dāng)竹筍多糖含量對(duì)DPPH自由基的清除作用也隨著多糖濃度的升高而增強(qiáng)，并在多糖濃度到1.0 mg/mL后趨近于平緩[32]。結(jié)合慈竹筍GC-MS代謝物分析結(jié)果中糖類物質(zhì)的含量最為豐富，且經(jīng)多種酶水解或裂解后產(chǎn)生大量的多糖，因此，我們推測(cè)可能是慈竹筍提物中含有的多糖對(duì)DPPH自由基的清除發(fā)揮了較強(qiáng)的作用。

圖1 慈竹竹筍提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 The elimination of DPPH· of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.2 羥自由基清除能力的測(cè)定

羥自由基清除率的大小可反映慈竹竹筍的抗氧化能力。由圖2所示，隨著提取物濃度的升高，對(duì)羥自由基清除能力也隨之增強(qiáng)，說明提物濃度與其羥自由基清除能力有一定量效關(guān)系。慈竹筍提取物羥自由基清除率較高，且高于Vc，表明其具有強(qiáng)的羥自由基清除抗氧化能力。當(dāng)提物的濃度為0.1 mg/mL時(shí)，竹筍的羥自由基清除率為73.40%，Vc的清除率為68.80%，二者的清除能力均超過50%；而當(dāng)提取物的濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，竹筍的清除率為89.70%，Vc的清除率為84.10%，由此可見，慈竹筍提取物具有較高的羥自由基基礎(chǔ)清除能力，且與毛竹春筍提取物在相應(yīng)濃度對(duì)羥自由基的清除率接近[12]。

圖2 慈竹竹筍提取物羥自由基清除能力Fig.2 The elimination of OH· of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.3 超氧自由基清除能力的測(cè)定

如圖3所示，隨著竹筍提取物濃度的增加，超氧自由基清除能力呈上升趨勢(shì)，表明濃度與其存在一定量效關(guān)系。竹筍提物清除超氧自由基能力明顯弱于Vc，當(dāng)竹筍粗提物濃度為1 mg/mL時(shí)，其清除能力僅有43.80%，而Vc清除能力達(dá)到89.50%。由此可見，慈竹筍提取物對(duì)超氧自由基清除能力介于麻竹筍和雷竹筍提取物之間，低于毛竹筍提取物；此外，毛竹筍、麻竹筍、雷竹筍提取物對(duì)超氧自由基清除能力顯著弱于Vc[12]，表明竹筍具有較弱的超氧自由基清除能力。

圖3 慈竹竹筍提取物超氧自由基清除能力Fig.3 The elimination of O2-·of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.4 相對(duì)還原力的測(cè)定

樣品相對(duì)還原力由Fe2+和Fe3+之間轉(zhuǎn)移來表示，吸光值越高，還原力越強(qiáng)。如圖4所示，隨著提取物濃度的增加，相對(duì)還原力逐漸增強(qiáng)，說明提取物濃度與相對(duì)還原力呈一定量效關(guān)系。提取物相對(duì)還原力整體較弱，當(dāng)濃度為0.1 mg/mL時(shí)，相對(duì)還原力僅為5.30%；當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，其相對(duì)還原能力也僅有27.90%。本研究顯示慈竹筍提取物相對(duì)還原能力較弱，但與毛竹筍多糖提取物的相對(duì)還原力隨多糖濃度增加，相對(duì)還原力緩慢增強(qiáng)的趨勢(shì)相似[33]，此外，慈竹筍提取物相對(duì)還原力仍低于毛竹筍、麻竹筍和雷竹筍的筍殼提取物，當(dāng)筍殼粗提物濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，提取物相對(duì)還原能力均高于50%[12]，表明在相對(duì)還原力方面，筍殼比筍肉可能具有更好的表現(xiàn)。

圖4 慈竹竹筍提取物相對(duì)還原力Fig.4 Reducing power of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.5 總抗氧化能力的測(cè)定

如圖5所示，竹筍提物總抗氧化能力明顯弱于Vc。1 mg/mL的竹筍的吸光度平均值為0.43，F(xiàn)RAP值為100.10 μmol/L。而1 mg/mL的Vc的吸光度平均值為2.85，F(xiàn)RAP值為996.20 μmol/L。研究發(fā)現(xiàn)毛竹筍提取物FRAP值為353.80 μmol/L，麻竹筍和雷竹筍總抗氧化能力低于毛竹筍[12]。結(jié)果表明慈竹筍提物總抗氧化能力遠(yuǎn)高于毛竹筍、麻竹筍和雷竹筍，但仍低于Vc。

圖5 慈竹竹筍提取物總抗氧化活性Fig.5 Total oxidation resistance of extracts from B. emeiensis shoot

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用GC-MS和LC-MS/MS廣泛靶向代謝組學(xué)手段，對(duì)慈竹筍營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行成分鑒定與分析，并從清除自由基、相對(duì)還原力、總抗氧化能力等方面系統(tǒng)研究了其抗氧化活性。通過GC-MS代謝組結(jié)果鑒定出75種代謝物，其中相對(duì)含量最高的三類物質(zhì)依次為糖類（74.30%）、有機(jī)酸（12.27%）和氨基酸（7.72%），另通過LC-MS/MS鑒定出226種代謝物，其中苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛和苯乙醛等相對(duì)含量最高，代謝組鑒定結(jié)果說明慈竹筍包含有大量的糖類物質(zhì)、多種的氨基酸和有機(jī)酸，可以用于營(yíng)養(yǎng)慈竹筍，特定風(fēng)味的慈竹筍食品的開發(fā)。此外，對(duì)慈竹筍提取物濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，其抗氧化活性分析表明其對(duì)DPPH自由基清除率和羥自由基清除率較高，可達(dá)到80%以上，超氧自由基清除率為43.80%，但相對(duì)還原力較弱且FRAP值為同等濃度水平下Vc的1/10。綜上，慈竹筍是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的功能性食品原料，對(duì)DPPH自由基清除和羥自由基的清除能力較強(qiáng)，因而本研究的結(jié)果可以為慈竹筍后期的食品加工利用提供一定的理論參考信息。