劉 蕾，徐 夢(mèng)，王 凌，茹淑華，孫世友，郜 靜，李 玭，張國(guó)印,馬俊賢

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050051；2.中國(guó)科學(xué)院 地理科學(xué)與資源研究所，生態(tài)網(wǎng)絡(luò)觀測(cè)與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3.河北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局，河北 石家莊 050091)

由于我國(guó)耕地資源短缺，發(fā)展設(shè)施農(nóng)業(yè)是推進(jìn)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、加快農(nóng)業(yè)供給結(jié)構(gòu)性改革的主要抓手和突破口，也是農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)村經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的重要推動(dòng)力。然而，為追求高產(chǎn)，設(shè)施蔬菜通常種植指數(shù)高、輪作周期短，且水肥、農(nóng)藥投入量高，加上常年處于高溫、高濕、高蒸發(fā)、無降水淋洗的特殊環(huán)境，極易導(dǎo)致土壤酸化、次生鹽漬化、土傳病害等問題，同時(shí)土壤中過量氮磷養(yǎng)分的淋洗會(huì)導(dǎo)致水環(huán)境污染。這些產(chǎn)區(qū)土壤質(zhì)量退化和生態(tài)環(huán)境惡化可能進(jìn)一步影響蔬菜生長(zhǎng)過程，不僅導(dǎo)致減產(chǎn)減收，更會(huì)威脅食品安全和人類健康[1]。

以往研究中通常使用土壤理化性狀來表征或者評(píng)估設(shè)施栽培條件對(duì)土壤質(zhì)量、蔬菜產(chǎn)量等的影響[2-4]。然而，越來越多的證據(jù)表明，傳統(tǒng)的理化指標(biāo)逐漸難以滿足對(duì)土壤質(zhì)量與土壤健康研究的需要，而土壤生物學(xué)性質(zhì)則能敏感地反映出土壤環(huán)境和健康的變化[5]。土壤微生物是土壤中的關(guān)鍵組分，在促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)利用[6]、保持土壤健康和質(zhì)量[7]以及污染物降解[8]等過程中發(fā)揮著重要作用，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[9]。土壤微生物對(duì)環(huán)境變化十分敏感，因此，通過土壤微生物性狀的變化評(píng)估設(shè)施土壤質(zhì)量變化近年來成為研究設(shè)施土壤質(zhì)量保持和功能恢復(fù)的熱點(diǎn)[10-11]。研究表明，設(shè)施農(nóng)業(yè)種植方式顯著改變土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響微生物群落，通常表現(xiàn)為多樣性隨種植年限顯著降低[12-13]或者群落組成改變(例如土壤細(xì)菌與真菌比值降低、有益菌群減少、病原微生物數(shù)量增加等)[10，14-17]。例如，相比于露地蔬菜種植，塑料大棚土壤微生物多樣性顯著降低，且大棚生產(chǎn)條件增加了微生物的環(huán)境脅迫進(jìn)而導(dǎo)致群落退化[18]。Zhang等[10]在壽光連續(xù)11 a試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一年兩季番茄栽培使得土壤微生物組成朝著有益菌豐度降低、病原微生物積累的方向演變。大量研究表明，土壤微生物群落失衡是導(dǎo)致設(shè)施蔬菜土傳病害、連作障礙等加劇的主要原因[19-20]。因此，設(shè)施蔬菜種植過程中土壤微生物多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)的變化可以作為土壤受損程度和質(zhì)量變化的重要預(yù)警指標(biāo)，理解土壤微生物及功能群的變化對(duì)揭示設(shè)施蔬菜栽培條件引起的土壤質(zhì)量退化微生物學(xué)機(jī)制及保持設(shè)施土壤可持續(xù)性具有重要意義。然而，與農(nóng)田相比，設(shè)施土壤微生物研究在我國(guó)起步較晚，且多集中在種植年限[10-11，13，15，17，21-22]和施肥[23-25]對(duì)設(shè)施土壤微生物區(qū)系的影響，對(duì)不同輪作模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能變化的認(rèn)識(shí)仍有很大的局限性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本試驗(yàn)在河北衡水國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)饒陽縣大尹村鎮(zhèn)南北巖村(115°50′82″E，38°16′14″N)進(jìn)行，饒陽縣設(shè)施蔬菜經(jīng)過30多年發(fā)展，種植規(guī)模達(dá)千公頃，居全省第一。研究區(qū)地屬冀中平原黑龍港流域，地貌類型為滹沱河洪積平原，南北巖村設(shè)施大棚建于廢棄河床之上，土壤類型為潮土，質(zhì)地為沙壤，地下水埋深3～7 m。年均溫12.2 ℃，降雨量552.6 mm，屬于溫帶大陸季風(fēng)氣候。該區(qū)典型種植模式為西紅柿-甜瓜輪作，秋冬茬為番茄(8-12月)，平均產(chǎn)量為67 500～90 000 kg/hm2；冬春茬為甜瓜(1-7月)，平均產(chǎn)量約75 000 kg/hm2。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

定位試驗(yàn)開始于2018年6月，在典型西紅柿-甜瓜輪作中通過引入養(yǎng)分、水分需求量更低的豆角，調(diào)整種植制度，共設(shè)置3個(gè)處理：西紅柿-甜瓜、豆角-甜瓜、西紅柿-豆角，養(yǎng)分和水分投入量如表1所示，每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)面積21.5 m2。試驗(yàn)開始前土壤基礎(chǔ)理化性狀：容重1.01 g/cm3，黏粒9.6%，砂粒56.6%，有機(jī)質(zhì)45.9 g/kg，NO3--N 147.1 mg/kg，Olsen-P 274.0 mg/kg。

表1 不同輪作模式下周年養(yǎng)分及水分投入量Tab.1 Annual input of fertilizer and water under different rotation systems

1.3 樣品采集

土壤樣品采集于2020年7月28日西紅柿、豆角拉秧并清理完全后進(jìn)行，每個(gè)小區(qū)選取3個(gè)樣方(1 m×1 m)，樣方間距3 m，每個(gè)樣方中隨機(jī)用土鉆采集5個(gè)表層土壤(0～20 cm)并混合，即每個(gè)小區(qū)15鉆混合為一個(gè)樣品重復(fù)，一共采集9個(gè)土壤樣品。去除石塊、落葉等雜質(zhì)后充分混勻，分成2份，過2 mm篩，一份用于微生物測(cè)定，保存于-20 ℃，一份用于土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定，保存于4 ℃冰箱。

1.4 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤有機(jī)質(zhì)用油浴加熱重鉻酸鉀氧化-容量法測(cè)定，土壤全鉀用堿熔-火焰光度法測(cè)定，土壤總氮用凱氏蒸餾法，土壤硝態(tài)氮用紫外分光光度法測(cè)定，土壤pH值用1 mol/L KCl浸提(水土比1.0∶2.5)電位法測(cè)定，水溶性鹽采用電導(dǎo)法測(cè)定，土壤總磷用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法，土壤Olsen-P 0.5 mol/L NaHCO3(pH值8.5)溶液浸提(水土比20∶1)鉬銻抗比色法測(cè)定[26]。

1.5 土壤微生物測(cè)定

使用OMEGA M5635-02 Soil DNA Kit試劑盒提取土壤DNA，使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE，美國(guó))測(cè)定DNA 的質(zhì)量，送至上海派森諾公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGC

AGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA

T-3′)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3V4基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)真菌ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序得到的原始序列經(jīng)過QⅡME2、DADA2進(jìn)行質(zhì)控拼接，去重后得到擴(kuò)增子序列變異體(Amplicon Sequence Variants，ASV)。采用QⅡME2的classify-sklearn算法對(duì)于每個(gè)ASV的特征序使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)行物種注釋，得出物種分類水平，對(duì)比數(shù)據(jù)庫為Greengenes(Release 13.8,http://greengenes.secondgenome.com/)和UNIT (Release 8.0，https://unite.ut.ee/)。最后對(duì)采用QⅡME2的qiime feature-table rarefy功能進(jìn)行抽平。采用QⅡME2的qiime diversity alpha-rarefaction命令，設(shè)置最小抽平深度為10、全體樣本中最低測(cè)序深度樣本序列量的95%，再在這一深度與最小深度之間均勻選取10個(gè)深度值，每個(gè)深度值抽平10次，計(jì)算所選的多樣性指數(shù)。選取最大抽平深度時(shí)的得分平均值作為α-多樣性指數(shù)。以Chao指數(shù)表征豐富度，以Shannon指數(shù)表征多樣性，以Pielou指數(shù)表征均勻度。

(1)給予兩組患者同樣的基礎(chǔ)用藥,指導(dǎo)患者合理使用克拉霉素片(廣東逸舒制藥股份有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H20000207;0.125g*24s)、阿莫西林分散片(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H10980075;0.25g*6s))、甲硝唑片(湖南漢森制藥股份有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H43020225;0.2g*21s);(2)對(duì)照組在基礎(chǔ)用藥基礎(chǔ)上加用奧美拉唑(廣東逸舒制藥有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H20040911;20mg*7S);實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用雷貝拉唑(濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H20052317;10mg*7S)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用單因素方差分析(ANOVA)比較3種種植制度下土壤化學(xué)性質(zhì)、微生物α-多樣性、細(xì)菌及真菌各種群相對(duì)豐度的差異，并用Duncan′s multiple range test檢驗(yàn)各處理間差異的顯著性(P<0.05水平下)。使用Spearman相關(guān)性分析土壤微生物多樣性指數(shù)及各種群相對(duì)豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性。方差分析和相關(guān)性分析使用IBM SPSS Statistics(v 18.0)進(jìn)行。不同種植方式下共有/特有的ASV韋恩圖計(jì)算采用R語言VennDiagram進(jìn)行。利用隨機(jī)森林模型(Random Forest)預(yù)測(cè)顯著影響3種輪作模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異的物種(屬水平)及其貢獻(xiàn)，使用R語言RandomForest進(jìn)行運(yùn)算分析，每個(gè)物種對(duì)預(yù)測(cè)模型貢獻(xiàn)的顯著性用軟件包rfPermute計(jì)算。微生物群落結(jié)構(gòu)及其影響因子使用典型相關(guān)分析(Canonical Correlation Analysis，CCA)，3種輪作模式下群落結(jié)構(gòu)的差異用PERMANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)，使用R語言Vegan包進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)

相比于傳統(tǒng)茄科-葫蘆科輪作，引入豆科作物的輪作模式每年降低N-P2O5-K2O投入21.38%～23.46%，2.27%～5.04%，25.45%～26.97%，降低水分投入22.73%～31.82%，經(jīng)過2 a四季肥水管理，不同設(shè)施輪作模式主要對(duì)土壤硝態(tài)氮含量和pH值產(chǎn)生了顯著的影響(表2)：土壤NO3-N含量在豆角-甜瓜模式下最高，而在西紅柿-豆角模式下最低，相比于傳統(tǒng)西紅柿-甜瓜，西紅柿-豆角土壤NO3-N含量降低了65.31%；西紅柿豆角模式下土壤pH值顯著高于其他2種輪作模式，提高了4.4%～6.8%。

表2 不同輪作模式下土壤化學(xué)性質(zhì)Tab.2 Soil general properties under different rotations

2.2 土壤細(xì)菌和真菌α-多樣性

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、去燥、拼接、去除嵌合體及數(shù)量為1的序列后，共得到405 515個(gè)細(xì)菌序列和1 050 999個(gè)真菌有效序列。去重后土壤細(xì)菌得到9 638個(gè)ASVs，不同輪作模式下ASV數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。土壤真菌獲得1 146個(gè)ASVs，其中西紅柿-豆角模式下土壤真菌ASV數(shù)量顯著低于另2種處理(P<0.05)。

不同輪作模式顯著影響土壤微生物α-多樣性，但是細(xì)菌和真菌的響應(yīng)特征有區(qū)別(表3)。輪作模式顯著影響了土壤細(xì)菌的均勻度(P<0.05)，其Pielou指數(shù)在西紅柿-甜瓜模式下最高，在豆角-甜瓜模式下最低。而土壤真菌的豐富度對(duì)輪作模式有顯著響應(yīng)，其Chao指數(shù)在西紅柿-豆角模式下顯著低于其他2種模式。

表3 不同輪作模式下土壤微生物群落α-多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity indices of soil microbial community under different rotations

2.3 微生物群落組成和結(jié)構(gòu)差異

高通量測(cè)序獲得的土壤細(xì)菌ASVs分屬于31門100綱231目372科617屬，且群落中優(yōu)勢(shì)種群(相對(duì)豐度大于1%)在不同輪作模式土壤中的分布具有明顯差異(圖1)。在門水平上，己科河菌門(Rokubacteria)的平均相對(duì)豐度在西紅柿-豆角模式下((3.15±0.05)%)顯著高出西紅柿-甜瓜((1.36±0.51)%)和豆角-甜瓜((1.37±0.29)%)約2.3倍。在科水平上，西紅柿-豆角土壤中具有顯著(P<0.05)較高的亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)((6.20±0.59)%)、Rokubacteriales((3.15±0.29)%)和S085((1.73±0.02)%)；西紅柿-甜瓜種植制度顯著提高了Roseiflexaceae((6.21±0.07)%)和生絲單胞菌科(Hyphomonadaceae)((1.41±0.14)%)的相對(duì)豐度；豆角-甜瓜模式則顯著提高了甾體桿菌科(Steroidobacteraceae)的相對(duì)豐度((1.41±0.27)%)。

土壤真菌ASVs分屬于9門28綱55目117科174屬，其中子囊菌門(Ascomycota)在3種輪作模式下均是土壤中的優(yōu)勢(shì)種群，其平均相對(duì)豐度能達(dá)到54.37%～69.50%。在門水平下，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的平均相對(duì)豐度在西紅柿-豆角種植制度下((13.71±2.50)%)顯著最高，分別是西紅柿-甜瓜((2.87±0.44)%)和豆角-甜瓜((3.35±0.96)%)的4.8，4.1倍(圖2)。土壤真菌優(yōu)勢(shì)科中，小不整球殼科(Plectosphaerellaceae)的相對(duì)豐度在西紅柿-豆角種植制度下顯著最高((4.96±0.17)%)，是西紅柿-甜瓜((1.62±0.93)%)和豆角-甜瓜((1.56±0.51)%)的約3倍。蟲草菌科(Cordycipitaceae)和叢赤殼科(Nectriaceae)則在西紅柿-豆角種植制度土壤富集，其相對(duì)豐度分別是(5.24±1.99)%，(1.34±0.25)%，顯著高于其余2種種植制度(分別是蟲草菌科(0.52±0.33)%，(0.37±0.19)%和叢赤殼科(0.71±0.36)%，(0.38±0.21)%)。

韋恩圖表明，土壤真菌群落在3種種植制度下的特異性更強(qiáng)(圖3)。真菌群落中，3種植制度下共有ASV(66個(gè))占總真菌ASV的5.76%，而共有細(xì)菌ASV(1 016個(gè))則占總細(xì)菌ASV的10.54%。并且，西紅柿-甜瓜、豆角-甜瓜2種種植制度下特有ASV占總ASV的比例均在真菌群落(35.08%，28.45%)大于細(xì)菌群落(23.60%，23.27%)。但是在西紅柿-豆角模式下真菌特有ASV占總ASV的比例(14.38%)則明顯低于細(xì)菌(27.43%)。對(duì)于2種模式下共有的ASV，無論是細(xì)菌還是真菌，均在當(dāng)季作物相同情況下(即西紅柿-甜瓜和豆角-甜瓜，當(dāng)季為甜瓜)數(shù)量最多(細(xì)菌652個(gè)，真菌107個(gè))。

隨機(jī)森林模型揭示了對(duì)預(yù)測(cè)3種種植制度下土壤微生物群落構(gòu)建差異有顯著(P<0.05)貢獻(xiàn)的細(xì)菌和真菌種群。土壤細(xì)菌群落構(gòu)建在3種種植制度下的差異主要受SWB02(貢獻(xiàn)量2.15%)、0319-6G20(1.95%)、Blastocatella(1.95%)、Dokdonella(1.92%)等種群的顯著影響，且這些種群大部分屬于Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria等主要細(xì)菌門。其中，Gemmatirosa(Gemmatimonadetes)、SWB02(Proteobacteria)等種群在西紅柿-甜瓜土壤中顯著富集；Microbispora(Actinobacteria)、Dokdonella(Proteobacteria)等種群在豆角-甜瓜土壤中顯著富集；MND1(Proteobacteria)、IMCC26256(Acidobacteria)等種群在西紅柿-豆角土壤中顯著富集(圖4)。對(duì)于土壤真菌，顯著影響不同種植制度下群落構(gòu)建差異的屬主要為Verticillium(貢獻(xiàn)量3.20%)、Blastobotrys(3.17%)、Kernia(2.91%)、Dokmaia(2.30%)等8個(gè)屬，集中在2個(gè)門，并且不屬于群落中的優(yōu)勢(shì)種，相對(duì)豐度均低于5%，其中Blastobotrys(Ascomycota)、Kernia(Ascomycota)顯著在西紅柿-甜瓜土壤中富集；Verticillium(Ascomycota)、Dokmaia(Ascomycota)、Ceriporia(Basidiomycota)顯著在西紅柿-豆角土壤中富集(圖5)。

2.4 不同輪作模式下土壤微生物群落差異的驅(qū)動(dòng)因子

相關(guān)分析表明，土壤pH值與真菌多樣性(Chao指數(shù))有極顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，而細(xì)菌多樣性指數(shù)則與土壤理化性質(zhì)沒有顯著相關(guān)性(表4)。細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)種群的相對(duì)豐度也顯著受到土壤理化性質(zhì)的影響：其中，相對(duì)豐度與pH值、NO3-N和土壤總氮的相關(guān)性最強(qiáng)，與Olsen-P、土壤總鉀和C/N的相關(guān)性次之(表4)。大部分細(xì)菌種群的相對(duì)豐度受到多個(gè)土壤性質(zhì)的綜合影響，并且不同種群與土壤因子的相關(guān)性有明顯區(qū)別。例如，Rokubacteriales、OM190與NO3-N顯著負(fù)相關(guān)，與pH值顯著正相關(guān)；而Roseiflexaceae、鏈孢囊菌科(Streptosporangiaceae)則與NO3-N顯著正相關(guān)，與pH值顯著負(fù)相關(guān)。相比于細(xì)菌，大部分真菌種群僅受到1～2個(gè)土壤因子的影響，并且這些種群相對(duì)豐度與土壤因子的相關(guān)性基本一致：例如，小不整球殼科(Plectosphaerellaceae)與NO3-N極顯著負(fù)相關(guān)，蟲草菌科(Cordycipitaceae)等與NO3-N顯著負(fù)相關(guān)，而與pH值顯著正相關(guān)。

表4 微生物多樣性指數(shù)及相對(duì)豐度與土壤理化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性Tab.4 Spearman correlation coefficients (r) of diversity indices and the relative abundance of microbial taxa with soil general properties

表4(續(xù))

典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)進(jìn)一步揭示了影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子(圖6)。CCA結(jié)果表明，土壤因子對(duì)細(xì)菌和真菌群落變化的解釋度分別為33.61%，32.12%。在所有環(huán)境因子里，土壤NO3-N和pH值是顯著影響細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子(P<0.05)。此外，當(dāng)季作物類型也對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響：PERMANOVA檢驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)季作物為甜瓜的種植制度(西紅柿-甜瓜+豆角-甜瓜)下土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)與當(dāng)季作物為豆角的模式(西紅柿-豆角)產(chǎn)生顯著差異(細(xì)菌F=2.35，P=0.01；真菌F=1.88，P=0.01)。

3 討論與結(jié)論

設(shè)施蔬菜高集約化生產(chǎn)方式及不合理的水肥管理極易造成土壤酸化、次生鹽漬化等土壤質(zhì)量退化，而土壤微生物對(duì)環(huán)境變化十分敏感，因此，通過土壤微生物性狀的變化評(píng)估設(shè)施土壤質(zhì)量變化近年來成為研究設(shè)施土壤質(zhì)量保持和功能恢復(fù)的熱點(diǎn)[10-11]。然而，與農(nóng)田相比，設(shè)施土壤微生物研究在我國(guó)起步較晚，且多集中在種植年限[10，11，13，15，17，22]和施肥[23-25]對(duì)設(shè)施土壤微生物區(qū)系的影響，對(duì)不同輪作模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的變化認(rèn)識(shí)仍有很大的局限性。特別是引入豆科作物的輪作模式，其增產(chǎn)[28-29]和環(huán)保[30-33]效果雖得到普遍認(rèn)可，然而該體系對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落的綜合影響及其驅(qū)動(dòng)因子卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，設(shè)施蔬菜種植中，當(dāng)季作物種類(豆角/甜瓜)顯著影響了土壤微生物多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)。Ridl等[34]研究氮磷鉀肥料和種植不同作物(辣根、茄子、煙草)對(duì)土壤微生物群落的影響時(shí)同樣指出，作物種類對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，其作用效果甚至大于施肥。而這種差異的主要原因在于，植物與土壤微生物在相互作用過程中會(huì)形成植物-微生物協(xié)同調(diào)控機(jī)制：即植物通過分泌碳源物質(zhì)調(diào)控根際土壤微生物的種類和結(jié)構(gòu)；同時(shí)，微生物也會(huì)通過產(chǎn)生激素類物質(zhì)、抑制病原菌生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物對(duì)生物及非生物脅迫產(chǎn)生抗性等方式促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[35-36]。引入豆科作物的輪組模式顯著改變了碳源底物、并且水肥管理差異也改變了土壤理化性狀，從而調(diào)控微生物組成和活性。在所有土壤因子中，pH值和NO3-N對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響最為顯著。由于設(shè)施環(huán)境極端性及復(fù)雜性，目前，報(bào)道的設(shè)施土壤微生物群落組成及結(jié)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)因子各不相同，甚至相互矛盾。例如，Song等[17]指出土壤pH值和粘粒含量是影響設(shè)施土壤細(xì)菌群落的主要因素，而影響真菌群落的主要因素則為pH值和磷含量。Yao等[18]在對(duì)比設(shè)施及露地蔬菜土壤微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)指出設(shè)施土壤微生物群落隨種植年份發(fā)生顯著改變，然而，Tian等[11]在調(diào)查環(huán)渤海區(qū)設(shè)施土壤微生物后卻發(fā)現(xiàn)微生物群落與栽培年份關(guān)系并不顯著，而是與土壤鉀含量密切相關(guān)。這些明顯不同甚至相悖的研究結(jié)果表明，對(duì)土壤微生物結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)還十分有限，特別是顯著差別與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的設(shè)施土壤。

本研究3種輪作模式中，豆角-甜瓜和西紅柿-豆角相比于傳統(tǒng)西紅柿-甜瓜輪作模式分別減少N-P2O5-K2O投入21.38%～23.46%，2.27%～5.04%，25.45%～26.97%，降低水分投入22.73%～31.82%，經(jīng)過2 a四季肥水管理，西紅柿-豆角輪作模式相對(duì)于傳統(tǒng)西紅柿-甜瓜，NO3-N含量顯著降低了65.31%。并且由于氮肥減投緩解了土壤酸化，使得pH值相對(duì)于傳統(tǒng)模式提高了6.8%。本研究結(jié)果也表明，正是pH值和NO3-N含量的差異驅(qū)動(dòng)了不同輪作模式下細(xì)菌和真菌群落組成和結(jié)構(gòu)的差異。其余土壤養(yǎng)分差異不顯著，可能由于試驗(yàn)?zāi)攴葺^短。然而，豆角-甜瓜輪作模式下土壤養(yǎng)分含量卻與西紅柿-甜瓜沒有顯著差異，這可能與甜瓜季養(yǎng)分投入量遠(yuǎn)大于西紅柿季有關(guān)，且甜瓜季溫度高于西紅柿季，土壤養(yǎng)分礦化加劇，因此，甜瓜季高投入、高礦化使得土壤養(yǎng)分含量激增，掩蓋了上一季豆角減投的效果，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

對(duì)于土壤細(xì)菌，結(jié)果表明變形菌門(Proteobacteria)在所有輪作模式是中所占比例最大，與以往研究一致[11，17，37]，主要原因在于該類型細(xì)菌屬于典型富養(yǎng)型生物，其生存的r-策略使得它在碳源底物有效性高的設(shè)施環(huán)境中快速生長(zhǎng)，成為優(yōu)勢(shì)種群。然而，不同微生物對(duì)輪作模式改變及其導(dǎo)致的環(huán)境因子變化的響應(yīng)不同，這取決于不同微生物的生理、生態(tài)特性差異。例如，發(fā)現(xiàn)亞硝化單胞菌科在西紅柿-豆角土壤中顯著增加，且與NO3-N含量有極顯著負(fù)相關(guān)(r=0.817，P<0.01)。以往研究也發(fā)現(xiàn)，減量施肥顯著提高亞硝化單胞菌科(屬)的相對(duì)豐度[38-39]。另外，亞硝化單胞菌科的相對(duì)豐度與pH值具有顯著正相關(guān)(r=0.667，P<0.05)，這與普遍認(rèn)為的低pH值會(huì)限制硝化細(xì)菌生長(zhǎng)[40]結(jié)論一致。在3種輪作模式下，當(dāng)季豆角種植(西紅柿-豆角)的水肥投入量明顯低于當(dāng)季甜瓜種植模式，導(dǎo)致土壤pH值升高、NO3-N下降，因此，有助于該菌群生長(zhǎng)。西紅柿-豆角輪作模式還顯著提高了己科河菌門的相對(duì)豐度。作為一種新型土壤細(xì)菌，該菌群具有多樣的生物次級(jí)代謝物基因，可能與抗藥性密切相關(guān)[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤NO3-N、總氮和pH值顯著影響該類微生物的相對(duì)豐度，表明此類細(xì)菌對(duì)土壤無機(jī)氮敏感性很高，并且有研究表明該菌群可以進(jìn)行反硝化作用[42]。另外，相比于引入豆角的輪作模式(豆角-甜瓜和西紅柿-豆角)，西紅柿-甜瓜土壤中Roseiflexaceae和生絲單胞菌科(Hyphomonadaceae)的相對(duì)豐度顯著增加。這兩類細(xì)菌多被發(fā)現(xiàn)于高溫、高鹽分環(huán)境中[43]及各種海洋環(huán)境中[44]，而西紅柿-甜瓜土壤具有相對(duì)較高的EC值，可能是導(dǎo)致該種群富集的原因。

對(duì)于土壤真菌，子囊菌門(Ascomycota)在3種輪作模式中所占比例均最高，達(dá)到54.37%～69.50%，與Tian等[16]在環(huán)渤海區(qū)設(shè)施土壤調(diào)查結(jié)果一致[11]。研究指出設(shè)施土壤中子囊菌門豐度增加與其土壤磷含量高密切相關(guān)。在3種輪作模式中，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的相對(duì)豐度在西紅柿-豆角模式下顯著增加，其中銀耳綱(Tremellomycetes)和外擔(dān)菌綱(Exobasidiomycetes)的相對(duì)豐度增加程度較高。研究發(fā)現(xiàn)，這些真菌可能在抑制植株根部土傳病害方面發(fā)揮作用，是有效的生防菌[45]。然而，小不整球殼科、蟲草菌科和叢赤殼科(Nectriaceae)等具有致病的種群的相對(duì)豐度也顯著增加。 Bainard等[46]發(fā)現(xiàn)，豆科植物輪作頻數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致病原菌數(shù)量增加2～3倍，因此，提出應(yīng)避免連續(xù)種植豆科作物，以防根系特異性病原菌累積。土壤中真菌優(yōu)勢(shì)科的大部分屬于子囊菌門，在群落演替中處于演替前期，與接合菌、細(xì)菌等最先侵入枯枝落葉等基質(zhì)形成優(yōu)勢(shì)菌，分解代謝吸收大量糖和NPK等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[47]，因此，相對(duì)豐度與土壤NO3-N、Olsen-P、總氮、總鉀、有機(jī)碳、C/N等密切相關(guān)。以叢赤殼科為例，NO3-N、總氮、有機(jī)碳和pH值顯著影響其相對(duì)豐度，但具體影響機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。近年來，盡管高通量測(cè)序技術(shù)在各類型生態(tài)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用為更好的理解土壤微生物多樣性及群落構(gòu)建提供了豐碩的成果，但仍有相當(dāng)一部分微生物在生態(tài)系統(tǒng)中功能并不十分清楚。

利用隨機(jī)森林模型，本研究預(yù)測(cè)出多種能夠顯著(P<0.05)影響3種輪作模式下群落構(gòu)建差異的微生物種群。這些種群的相對(duì)豐度在3種輪作模式下有顯著差異，進(jìn)而可能導(dǎo)致不同土壤中碳氮循環(huán)過程的改變。例如，紅微菌屬(Rhodomicrobium)是一種需微氧至厭氧的紫色光合細(xì)菌，具有極其多樣的碳源代謝能力，可代謝幾乎所有的發(fā)酵產(chǎn)物，包括CO2、小分子有機(jī)酸和CH4等，同時(shí)是一種自生固氮菌，具有固氮能力[48-49]。發(fā)現(xiàn)紅微菌屬的相對(duì)豐度在西紅柿-豆角土壤中顯著高于其余2種輪作模式，這暗示了共生固氮過程可能是豆角土壤中氮素供應(yīng)的重要來源或補(bǔ)給。本研究還發(fā)現(xiàn)，氫孢菌屬(Hydrogenispora)的相對(duì)豐度在西紅柿-甜瓜土壤中顯著高于引入豆角的種植制度。該屬的細(xì)菌偏好利用糖類底物，如Hydrogenisporaethanolica能發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、淀粉[50]，這表明不同種植制度下土壤有機(jī)碳組分可能發(fā)生變化。另外，西紅柿-豆角土壤中輪枝孢屬(Verticillium)相對(duì)豐度顯著高于其余2種輪作模式，這類真菌會(huì)引起枯萎病，但是經(jīng)過合理輪作，其相對(duì)豐度會(huì)顯著下降，可以看到上一季種植豆角的輪作模式豆角-甜瓜在這一季土壤中該類真菌相對(duì)豐度與西紅柿-甜瓜差異已經(jīng)不顯著。

除了群落結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)土壤真菌的豐富度對(duì)于輪作模式及其導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)的改變更為敏感，而細(xì)菌多樣性的變化與土壤因子的相關(guān)性不顯著。3種輪作模式下土壤真菌Chao指數(shù)的變化與土壤pH值具有極顯著的負(fù)相關(guān)性(r=-0.767，P<0.01)，這與以往研究結(jié)果一致[51-52]。目前，研究普遍承認(rèn)pH值是影響真菌群落多樣性的主要化學(xué)性質(zhì)[53-54]，不過Bahram等[55]指出全球范圍內(nèi)土壤真菌多樣性與pH值相關(guān)性較弱。這種差異很可能是由于生物及非生物因素改變，如植被變化、施肥變化等帶來的碳源底物、土壤理化性狀等環(huán)境因子改變綜合調(diào)控的結(jié)果，而非pH值的直接作用引起的變化?？傮w來說，本研究中輪作模式的改變僅影響到土壤微生物多樣性的某個(gè)方面(例如豐富度、均勻度)，這可能是由于相應(yīng)的施肥、灌水處理時(shí)間尚短。土壤微生物多樣性是其發(fā)揮生態(tài)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)[56]，后續(xù)研究還需長(zhǎng)期連續(xù)觀測(cè)，深入研究種植制度改變導(dǎo)致的生物及非生物因素變化對(duì)土壤微生物多樣性及群落特征的影響，從而揭示其影響設(shè)施土壤碳氮循環(huán)的機(jī)理。

設(shè)施農(nóng)業(yè)高集約化生產(chǎn)方式導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的改變，進(jìn)而影響土壤微生物的多樣性、群落組成及功能。基于豆科作物養(yǎng)分減投的輪作制度調(diào)整技術(shù)相對(duì)于茄科-葫蘆科傳統(tǒng)輪作模式，經(jīng)過2 a四季肥水管理顯著降低了土壤NO3-N含量并提高pH值。土壤環(huán)境的變化顯著改變了細(xì)菌和真菌的多樣性和群落組成，但不同微生物對(duì)輪作模式改變引起的環(huán)境因子變化的響應(yīng)不同，主要取決于不同微生物的生理、生態(tài)特性差異。在所有土壤因子中，pH值和NO3-N對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響最為顯著，并且當(dāng)季作物種類(豆科/非豆科)對(duì)土壤微生物富集模式有顯著作用。此外，土壤細(xì)菌對(duì)輪作制度調(diào)整的響應(yīng)比真菌敏感，未來應(yīng)深入研究這種群落變化如何影響設(shè)施土壤碳氮循環(huán)關(guān)鍵過程。