汪 亮，李忠秋，唐曉東，張海峰，劉 娣，張冬杰

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150086)

V-ATP酶最早是在酵母細胞的液泡膜上發(fā)現(xiàn)的，其主要功能是利用水解ATP產(chǎn)生的能量實現(xiàn)氫離子的跨膜運輸，在水解ATP、調(diào)節(jié)pH值和產(chǎn)生電勢梯度等方面具有重要作用[1]。在進化上高度保守，主要存在于不同生物的細胞膜或細胞器膜上。V-ATP酶是一種復雜的異聚體蛋白，包括2個結(jié)構(gòu)復合體V1和V0，V1存在于膜表面，屬于催化區(qū)域，負責ATP的水解；V0包埋在膜內(nèi)，屬于質(zhì)子傳導區(qū)域，負責質(zhì)子的轉(zhuǎn)運。V1由8個亞基組成(A、B、C、D、E、F、G、H)，V0由6個亞基組成(a、c、c′、c″、d、e)[2]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)V-ATP酶除了可以轉(zhuǎn)運H+，調(diào)節(jié)細胞器內(nèi)的pH值外，還參與許多其他的生物學過程。比如，在植物中，可以調(diào)節(jié)細胞膨壓，促進細胞伸長以及幫助植物適應干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫[3]。在昆蟲中，可調(diào)節(jié)煙草天蛾、東亞飛蝗等的蛻皮活動，參與柑橘小實蠅雄蟲的生殖過程，在家蠶絲腺細胞中建立電勢差，利于細胞的胞吐作用以及后續(xù)絲膠蛋白的分泌[4]。

ATP6V0A4編碼V-ATP酶的a4亞基，被認為是遺傳性遠端腎小管性酸中毒的致病基因，該疾病因遠端腎小管泌氫障礙，使得可滴定酸及尿NH4+排出減少，從而導致一系列的臨床表現(xiàn)[5]。ATP6V0A4基因缺失小鼠到斷奶時，表現(xiàn)出嚴重的代謝性酸中毒，低血鉀和早起腎鈣化，聽力嚴重受損。除非堿化，否則它們會快速死亡[6]。民豬資源研究與利用課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，民豬在遭受冷應激后，其背部皮下脂肪內(nèi)的ATP6V0A4基因的轉(zhuǎn)錄水平會顯著升高(P<0.05)。目前，還未見該基因與脂肪代謝或體溫調(diào)節(jié)相關的報道，但其作為編碼V-ATP酶亞基的一個基因，參與細胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運質(zhì)子活動，這種活動對于pH值的穩(wěn)定和膜電位的產(chǎn)生至關重要，而膜電位是細胞代謝的驅(qū)動力[7]。為了后續(xù)探討ATP6V0A4基因在冷應激過程中的生物學功能，本研究對其啟動子區(qū)的核心序列進行了篩選和分析，從分子水平探討其可能存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1頭12月齡的雌性民豬基因組DNA由黑龍江省家畜育種重點實驗室-20 ℃保存，內(nèi)切酶KpnⅠ、Hind Ⅲ和pMD18-T Vector購自TaKaRa，雙熒光素酶報告載體購自Promega。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與PCR擴增 根據(jù)NCBI已有的豬ATP6V0A4基因組序列設計引物(GenBank登錄號：NC_010460)，擴增-1 504～-1 bp序列(將起始密碼子“A”的位置定義為1)，引物序列見表1。

以豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為模板DNA 1 μL(50 ng/μL)；2×PCR Mix 10 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；ddH2O補齊至20 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。

1.2.2 克隆測序 參照TransGen Biotech膠回收試劑盒(EG101-02)說明書操作。將回收后的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體，構(gòu)建pMD18-T-ATP6V0A4質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞。應用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切鑒定。雙酶切體系為KpnⅠ和Hind Ⅲ各0.5 μL(10 U/μL)，10×Buffer 1.0 μL，質(zhì)粒 4.0 μL；ddH2O 4.0 μL。反應條件為37 ℃酶切15 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后選取陽性克隆菌落送至北京華大基因科技有限公司測序。應用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行分析。

1.2.3 熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建 將測序正確的克隆載體與pGL3-Basic空載體分別使用KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切處理，回收目的片段后，將帶有黏性末端的目的片段與線性化的pGL3-Basic載體相連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細胞中，篩選陽性重組質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測序驗證后，提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒(提取方法嚴格按照天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性檢測 將報告基因重組質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至豬PK15細胞，轉(zhuǎn)染前一天以4×105～8×105細胞/皿的密度鋪至24孔板中，使第2天轉(zhuǎn)染時的細胞達到80%～90%匯合，轉(zhuǎn)染過程嚴格按照LipofectamineTM2000 (Invitrogen)說明書操作。每孔加入總質(zhì)量為0.5 μg的質(zhì)粒和2 μL轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后4～6 h換液，24 h后進行熒光素酶活性檢測。檢測時按照Promega產(chǎn)品說明書操作。

1.2.5ATP6V0A4基因啟動子核心區(qū)鑒定 以克隆測序后的1 504序列為參考序列，設計一系列截短型上游引物，5′端引入KpnⅠ酶切位點，它們共用1條下游引物1504A(表1)，組成8對引物。以pMD18-T-ATP6V0A4質(zhì)粒為模板，分別進行PCR擴增，回收目的片段后分別連入pMD18-T載體，測序驗證后將正確的質(zhì)粒連入雙熒光素酶報告基因載體，轉(zhuǎn)染入細胞，進行雙熒光素酶活性檢測。

1.2.6ATP6V0A4基因啟動子區(qū)調(diào)控元件鑒定 為了保證預測的準確性，在3個不同網(wǎng)站對ATP6V0A4基因的啟動子區(qū)進行調(diào)控元件的預測(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html、http：//jaspar.genereg.net、http：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3和http：//www.ifti. org)。

表1 擴增截短型啟動子所用引物Tab.1 Primers for amplification of truncated promoter

依據(jù)不同片段熒光素酶活性的測定結(jié)果，同時結(jié)合軟件的預測結(jié)果應用重疊延伸PCR對部分元件進行缺失突變，缺失突變用引物序列見表2。PCR反應分2輪進行，第1輪反應利用含有缺失序列的引物與原有引物進行配對擴增，在相互重疊的PCR產(chǎn)物末端突變目的序列，第2輪反應以第1輪反應獲得的2個片段為模板，利用原有引物進行拼接擴增，將缺失突變引入產(chǎn)物內(nèi)部。質(zhì)粒的構(gòu)建與熒光素酶活性的測定同上。

表2 突變調(diào)控元件結(jié)合位點所用引物信息Tab.2 Primer information for binding sites of mutation regulatory elements

2 結(jié)果與 分析

2.1 ATP6V0A4基因啟動子區(qū)的擴增與鑒定

利用引物1504S和1504A進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測后在1 500 bp左右發(fā)現(xiàn)清晰明亮的條帶(圖1)，經(jīng)雙酶切鑒定及測序驗證后，證明所擴增的片段為豬的ATP6V0A4基因啟動子區(qū)。

2.2 熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ對構(gòu)建成功的克隆載體及pGL3-Basic空載體進行雙酶切處理，純化目的片段及線性化的載體。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后得到重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行雙酶切、測序鑒定。結(jié)果表明，成功地將NoxⅠ基因啟動子區(qū)連入了pGL3-Basic載體。

2.3 熒光素酶活性檢測

將提取的pGL3-Basic-1504無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PK15細胞中，24 h后檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示-1504～-1 bp(圖2)片段含有啟動子活性。

2.4 ATP6V0A4基因啟動子區(qū)系列截短序列載體的構(gòu)建

以1504片段為模板，利用8條截短序列的上游引物與1504A配對，共擴增出8條長度不同的ATP6V0A4啟動子區(qū)片段。將PCR擴增出的目的片段與pMD18-T載體相連，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切(圖3)、測序驗證后，分別連入pGL3-Basic載體，構(gòu)建8個報告基因重組載體，分別為pGL3-Basic-1124、pGL3-Basic-813、pGL3-Basic-581、pGL3-Basic-468、pGL3-Basic-368、pGL3-Basic-265、pGL3-Basic-185和pGL3-Basic-107(數(shù)字代表插入片段的長度)。

2.5 熒光素酶活性分析

第1輪熒光素酶活性分析主要是從1 504 bp片段至265 bp片段，區(qū)間間隔大約為300 bp長度。因此，共檢測了4個片段的熒光素酶活性，以空載體pGL3-Basic作為陰性對照，以pGL3-Basic-1504作為陽性對照，具體檢測結(jié)果見圖4。由圖可知，1504截短至1124、813、581后，啟動子活性無顯著變化，說明-1 504--581 bp區(qū)域內(nèi)沒有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點。將581位置截短至265后，啟動子活性顯著升高(P<0.05)，說明-581--265 bp區(qū)域內(nèi)存在負調(diào)控元件，-265--1 bp區(qū)域內(nèi)存在正調(diào)控元件。

第2輪缺失以發(fā)生顯著變化的區(qū)間-581--1 bp為基礎，將此區(qū)間進一步分割，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-265--185 bp區(qū)域內(nèi)存在正調(diào)控元件(圖5)。

2.6 ATP6V0A4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的預測與鑒定

2.6.1 生物信息學預測結(jié)果 根據(jù)前期雙熒光素酶測定結(jié)果，同時綜合3個在線轉(zhuǎn)錄因子預測軟件的分析結(jié)果，在-205--190 bp區(qū)間預測到8個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別為E2F3、SP2、EGR1、E2F6、CTCFL、E2F1、SP1和ETF；在-120--110 bp區(qū)間預測到4個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別為HNF4G、HNF4A、NR2F1和SP1。

2.6.2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的驗證 利用重疊延伸PCR法對預測的ATP6V0A4基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點-205--190 bp和-120--110 bp進行缺失突變，經(jīng)酶切測序驗證后，與pGL3-Basic載體相連構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點缺失的報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-205和pGL3-Basic-121(數(shù)字表示突變位點)。

以pGL3-Basic-265和pGL3-Basic-185為參照，將構(gòu)建的缺失突變體進行雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示缺失-205--190 bp區(qū)域，雙熒光素酶活性顯著降低，說明該區(qū)域存在正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子；缺失-121--110 bp區(qū)域，雙熒光素酶活性不降反而有上升趨勢，說明這個區(qū)域可能含有轉(zhuǎn)錄負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(圖6)。

3 討論

目前，關于ATP6V0A4基因的研究幾乎全部集中在人類的原發(fā)性遠端腎小管酸中毒(dRTA)疾病上，dRTA是一種罕見的遺傳性疾病，其特征是遠端腎單位的尿液酸化過程受損，導致堿性尿的產(chǎn)生[8]。其致病機理還不清楚，但ATP6V0A4的突變與dRTA顯著相關[9]。此外，ATP6V0A4還與乳腺癌的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移相關，發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者該基因顯著高表達[10]。ATP6V0A4為組織特異性表達基因，在腎臟、內(nèi)耳、嗅覺上皮和雄性生殖道的質(zhì)膜、雌性的子宮、胚胎內(nèi)臟卵黃囊等組織表達[11]，說明該基因具有廣泛的生物學功能。

河北省植物生理及分子病理學重點實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，民豬在遭受冷應激刺激后，其背部脂肪內(nèi)的ATP6V0A4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，上升倍數(shù)可達8.42倍，但在正常情況下，脂肪型的民豬與瘦肉型的大白豬相比，大白豬背脂內(nèi)的ATP6V0A4基因轉(zhuǎn)錄水平比民豬的高8.83倍[12]。據(jù)此，筆者推測該基因可能與豬的脂肪代謝相關，并且受冷應激誘導，但目前還未見相關的研究報道。只知其最后的聚合產(chǎn)物V-ATP酶的組裝和活性會受到葡萄糖饑餓的誘導[13]，而冷應激也會通過胰島素依賴途徑增強葡萄糖氧化，進而刺激外周組織中的葡萄糖的攝取[14]。為了開展ATP6V0A4基因后續(xù)的功能分析，本研究在分子水平上對該基因啟動子區(qū)的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行了篩選與分析，發(fā)現(xiàn)-581--265 bp區(qū)域內(nèi)存在負調(diào)控元件，-205--190 bp區(qū)域內(nèi)存在正調(diào)控元件，利用在線軟件預測后發(fā)現(xiàn)-205--190 bp 區(qū)域內(nèi)存在E2F3、SP2、EGR1、E2F6、CTCFL、E2F1、SP1和ETF共計8個轉(zhuǎn)錄因子的識別序列。

E2F3、E2F6和E2F1都屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，它們通過調(diào)節(jié)控制細胞DNA合成及與細胞增殖有關的基因表達而起作用，同時本身的活性也受到其他在細胞周期進程中有重要作用的蛋白所調(diào)控[15]。如高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可通過上調(diào)E2F3促進卵巢癌細胞增殖和侵襲能力[16]。SP1和SP2同屬于Sp樣轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族共有8個成員，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等多種生理病理過程，調(diào)控作用廣泛[17]。而EGR1、CTCFL和ETF這3個轉(zhuǎn)錄因子的研究報道較少，多集中在癌癥的相關研究上[18-20]。本研究中，確定了正、負調(diào)控元件的結(jié)合區(qū)域，但具體哪個轉(zhuǎn)錄因子會結(jié)合到ATP6V0A4基因的啟動子區(qū)正調(diào)控/負調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄，還需要后續(xù)的定點缺失試驗驗證。