秋石斛抗寒性生理的綜合評價(jià)

林榕燕 鐘淮欽 方能炎 林兵 葉秀仙

摘要：為建立秋石斛抗寒性生理綜合評價(jià)體系，選取6個(gè)秋石斛品種為材料，測定各品種的葉片相對電導(dǎo)率，結(jié)合 Logistic 方程計(jì)算半致死溫度（LT50），同時(shí)測定抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)[葉綠素含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛（MDA）含量、保護(hù)酶活性等]，通過相關(guān)性及主成分分析，選用相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量這5個(gè)指標(biāo)，利用隸屬函數(shù)分析法綜合評價(jià)供試秋石斛抗寒性。結(jié)果表明，秋石斛不同品種的LT50大小依次為D117、四面佛、三亞陽光、D128、香江美人和水芙蓉，說明水芙蓉在供試品種中抗寒性較強(qiáng)。隸屬函數(shù)分析法評價(jià)結(jié)果顯示，水芙蓉和香江美人為高抗寒品種，D128為低抗品種，三亞陽光、四面佛和D117為不抗品種，綜合評價(jià)的結(jié)果與LT50結(jié)果和越冬條件下的田間觀測結(jié)果基本吻合，說明了該綜合評價(jià)體系的可行性。本研究初步建立了秋石斛抗寒性生理綜合評價(jià)體系，為進(jìn)一步開展秋石斛抗寒機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：秋石斛;抗寒性;半致死溫度（LT50）;生理指標(biāo);相關(guān)性分析

中圖分類號： S682.310.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0111-06

秋石斛（Dendrobium spp.）為蘭科石斛屬多年生植物，花型優(yōu)美、色彩豐富、花期較長，不僅可作為切花材料，也是重要的盆花品種，在國際花卉市場上占有一席之地[1]。但秋石斛的生長期對溫度和濕度要求較高，過高或過低的溫度都有可能使其停止生長[2]。在我國，僅有部分地區(qū)可以生產(chǎn)秋石斛，如福建、海南、云南等地，但這些地區(qū)仍無法完全滿足秋石斛的生長，冬季低溫的影響不容忽視[3]。低溫不僅造成秋石斛切花產(chǎn)量和品質(zhì)下降，還影響到來年的生產(chǎn)[4]。因此，低溫被普遍認(rèn)為是秋石斛推廣應(yīng)用的最大限制因素。

提高秋石斛的抗寒性以降低冬季低溫傷害是秋石斛產(chǎn)業(yè)亟須解決的主要問題，而獲得高抗寒性的秋石斛品種則是解決該問題的關(guān)鍵。但目前常規(guī)雜交育種方法，很難滿足生產(chǎn)上對秋石斛抗寒品種的迫切需要[5-6]，且近年來有關(guān)秋石斛的研究多集中在離體培養(yǎng)技術(shù)[7-8]、花色形成機(jī)理[9]、病毒檢測[10]等方面，對抗寒性機(jī)理研究相對滯后。針對這一研究現(xiàn)狀，本研究擬開展秋石斛種質(zhì)資源抗寒性生理指標(biāo)分析，建立秋石斛抗寒性生理綜合評價(jià)體系，解析秋石斛抗寒生理響應(yīng)機(jī)制，為今后更加系統(tǒng)深入地研究秋石斛抗寒相關(guān)調(diào)控機(jī)理和抗寒品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

因此，本研究基于課題組前期的研究基礎(chǔ)，以秋石斛在種質(zhì)資源圃越冬條件下的田間性狀觀測為材料選擇依據(jù)，選取具有抗寒表現(xiàn)不一的6個(gè)秋石斛品種，測定各品種葉片在低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率，結(jié)合 Logistic 方程計(jì)算半致死溫度（LT50），同時(shí)測定了部分抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)，如葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性等，通過相關(guān)性及主成分分析，并綜合生理指標(biāo)觀測結(jié)果，初步建立了秋石斛抗寒性生理綜合評價(jià)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所花卉研究中心種質(zhì)資源圃保存的長勢基本一致且生長狀況良好的秋石斛品種（三亞陽光、四面佛、香江美人、水芙蓉、D117及D128）為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)于2020年9月在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 相對電導(dǎo)率測定 參照徐新娟等的方法[11]，并略作修改。相對電導(dǎo)率（REC）的計(jì)算公式為REC=（E1/E2）×100%，其中E1為材料處于室溫條件下浸泡24 h后測量的電導(dǎo)率;E2為材料在測量E1后于100 ℃ 沸水浴 20 min冷卻至室溫后測量的電導(dǎo)率。

1.2.2 LT50的確定 應(yīng)用 Logistic 方程y=k/（1+ae-bx）對處理溫度和對應(yīng)的相對電導(dǎo)率進(jìn)行擬合，并推導(dǎo) Logistic方程的二階導(dǎo)數(shù)并令其為0，計(jì)算出方程的拐點(diǎn)溫度，即LT50。式中：y表示低溫處理下的相對電導(dǎo)率;x表示處理溫度;k、a和b均為方程的參數(shù)。

1.2.3 葉綠素含量的測定 參照王學(xué)奎的方法[12]，并做適當(dāng)修改。以95%乙醇作為萃取液，搖勻后置黑暗處，中間搖晃幾次使萃取液混合均勻，直至葉片材料完全失綠。以萃取液作為空白對照，分別在649、665 nm波長下測定提取液中葉綠素的吸光度。

1.2.4 可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量測定 可溶性糖含量和MDA含量的測定參照Solarbio公司相應(yīng)的檢測試劑盒說明書，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量;可溶性蛋白含量參照南京建成科技有限公司的蛋白定量測試盒說明書，采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.2.5 SOD、POD、CAT酶活性測定 3種酶活性的測定均參照相應(yīng)的酶活性檢測試劑盒說明書，采用氮藍(lán)四唑法測定SOD酶活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，采取可見光法測定CAT活性。

1.2.6 抗寒性綜合評價(jià)方法 對參試的9個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性和主成分分析，并采用隸屬函數(shù)分析法進(jìn)行評價(jià)。（1）與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)計(jì)算：Uij=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）;（2）與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)計(jì)算：Uij=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）。

式中：Uij 為各指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值;Xij表示第i個(gè)秋石斛品種第j項(xiàng)指標(biāo)測定值;Xjmax、Xjmin為供試的全部材料中第j項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Execl 2007和SPSS 20.0軟件對文中涉及的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、顯著性分析、主成分分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋石斛不同品種低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的變化規(guī)律

通過比較秋石斛不同品種葉片在-10、-5、0、5、10 ℃時(shí)的相對電導(dǎo)率（圖1），發(fā)現(xiàn)隨著溫度降低，6個(gè)秋石斛品種葉片的相對電導(dǎo)率均呈上升趨勢，其中四面佛和D117的變化趨勢較為相似，在 0 ℃ 降到-5 ℃的范圍內(nèi)，相對電導(dǎo)率上升程度最大;而三亞陽光、香江美人、水芙蓉及D128的相對電導(dǎo)率在-5 ℃降到-10 ℃的范圍內(nèi)上升最明顯。

將不同處理溫度間的相對電導(dǎo)率數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析（圖2-A），發(fā)現(xiàn)-10 ℃處理時(shí)的相對電導(dǎo)率最高，與其他處理溫度間的相對電導(dǎo)率存在顯著差異，而 0、5、10 ℃ 時(shí)的相對電導(dǎo)率間差異不顯著。將6種秋石斛葉片相對電導(dǎo)率數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析（圖2-B），發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同品種間的相對電導(dǎo)率間差異不顯著。

2.2 LT50的確定

由表1可知，秋石斛不同品種的LT50高低順序?yàn)镈117、四面佛、三亞陽光、D128、香江美人和水芙蓉。其中，水芙蓉的LT50為2.73 ℃，比D117、四面佛、三亞陽光、D128、香江美人分別低了2.56、2.45、2.26、1.28、0.63 ℃，說明水芙蓉在供試品種中抗寒性最強(qiáng)。

2.3 秋石斛不同品種葉綠素含量的差異分析

以6個(gè)品種秋石斛葉片為材料，對葉綠素a含量、葉綠素b含量及總?cè)~綠素含量進(jìn)行分析，如圖3所示，葉綠素a和總?cè)~綠素含量分布情況基本一致，表現(xiàn)為水芙蓉>四面佛>D128>香江美人>D117>三亞陽光，葉綠素a含量在品種間差異不顯著，總?cè)~綠素含量在品種三亞陽光和水芙蓉間存在顯著差異。葉綠素b含量的分布情況表現(xiàn)為水芙蓉>四面佛>香江美人>D128>D117>三亞陽光，葉綠素b含量在品種間存在顯著差異，其中水芙蓉葉片中的葉綠素b含量是三亞陽光葉片中的1.70倍。

2.4 秋石斛不同品種可溶性糖和可溶性蛋白含量的差異分析

由圖4-A可見，不同秋石斛品種葉片可溶性糖含量的高低排序?yàn)橄憬廊恕⑺饺?、D128、D117、三亞陽光、四面佛，其中，香江美人的可溶性糖含量最高，與其他品種的可溶性糖含量存在明顯差異，其可溶性糖含量是四面佛的1.43倍。由圖 4-B 可見，不同秋石斛品種葉片可溶性蛋白含量的高低排序?yàn)樗饺?、D128、三亞陽光、D117、香江美人、四面佛，其中，水芙蓉的可溶性蛋白含量最高，與其他供試品種的可溶性蛋白間均存在顯著性差異，其可溶性蛋白含量是四面佛的2.00倍。

2.5 秋石斛不同品種MDA含量的差異分析

通過比較不同品種葉片MDA含量（圖5），發(fā)現(xiàn)MDA含量的高低排序?yàn)橄憬廊?、D128、水芙蓉、D117、四面佛、三亞陽光，其中，香江美人的MDA含量最高，與其他供試品種的MDA含量均存在顯著性差異，其MDA含量是三亞陽光的1.55倍。

2.6 秋石斛不同品種葉片相關(guān)酶活性的差異

由圖6可以看出，SOD、POD、CAT這3種酶活性在不同品種中高低排序存在一定差異。由圖6-A可見，D117的SOD酶活性顯著高于其他供試品種，而香江美人的SOD酶活性顯著低于其他供試品種，D117的SOD酶活性是香江美人的2.44倍。由圖6-B可見，D117的POD酶活性顯著高于其他供試品種，其POD酶活性是三亞陽光的1.40倍。由圖6-C可見，香江美人和水芙蓉的CAT酶活性顯著低于D117、D128和三亞陽光，香江美人的CAT酶活性僅為D128的55.48%。

2.7 參試生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析與主成分分析

由表2可知，LT50與相對電導(dǎo)率、CAT活性、POD活性、SOD活性存在正相關(guān)關(guān)系，其中與相對電導(dǎo)率存在極顯著正相關(guān)關(guān)系;LT50與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、總?cè)~綠素含量和MDA含量負(fù)相關(guān)，其中與可溶性糖含量顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí)，可溶性糖含量與相對電導(dǎo)率和CAT活性存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與MDA含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系;CAT活性和SOD活性存在顯著正相關(guān)關(guān)系。由于LT50越高，抗寒性越低，說明與抗寒性呈正相關(guān)的指標(biāo)有可溶性糖、可溶性蛋白、總?cè)~綠素含量和MDA含量;與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)有相對電導(dǎo)率、CAT活性、POD活性、SOD活性。

對測試的生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，由表 3 可知，前2個(gè)主成分合計(jì)解釋了78.574%的方差，其中第1主成分的貢獻(xiàn)率為58.775%，反映了LT50、相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量等成分的信息;第2主成分的貢獻(xiàn)率為19.799%，主要反映了可溶性蛋白含量的信息;說明LT50、相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量這6個(gè)指標(biāo)可以用作秋石斛抗寒性評價(jià)的指標(biāo)。

2.8 抗寒性生理綜合評價(jià)體系的建立

為了較全面地反映秋石斛的抗寒性，選用相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量這5個(gè)指標(biāo)，通過平均隸屬度來綜合評價(jià)供試秋石斛品種的抗寒性。由表4可知，香江美人和水芙蓉為高抗寒品種;D128為低抗品種;而三亞陽光、四面佛和D117為不抗品種，綜合評價(jià)的結(jié)果與LT50的結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

植物抗寒性受環(huán)境和遺傳的影響，其機(jī)制研究是一個(gè)非常復(fù)雜的過程[14-15]。當(dāng)前，用來反映植物抗寒性的評價(jià)指標(biāo)有生理生化指標(biāo)、形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因蛋白等，用來鑒定植物抗寒性較為常用的方法有田間直接鑒定法、LT50評價(jià)法、隸屬函數(shù)分析法等[16-19]。本研究主要利用LT50評價(jià)法和隸屬函數(shù)分析法對供試的秋石斛品種進(jìn)行抗寒性評價(jià)。

LT50評價(jià)法應(yīng)用 Logistic 方程對處理溫度和對應(yīng)的相對電導(dǎo)率進(jìn)行擬合，得到幾種供試秋石斛品種的抗寒性大小為水芙蓉>香江美人>D128>三亞陽光>四面佛>D117。隸屬函數(shù)分析法綜合了相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量等抗寒相關(guān)的多個(gè)生理指標(biāo)對供試秋石斛抗寒性進(jìn)行評價(jià)，其評價(jià)結(jié)果與LT50評價(jià)法鑒定結(jié)果基本一致，說明本研究采取的評價(jià)方法具有一定的可靠性。

在分析過程中，以LT50作為參考指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與秋石斛抗寒性具有較強(qiáng)相關(guān)性的指標(biāo)有相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量，其中可溶性糖含量和可溶性蛋白含量與抗寒性呈正相關(guān)關(guān)系，這一研究結(jié)果與薔薇抗寒性研究結(jié)果[20]一致;而相對電導(dǎo)率、CAT活性、SOD活性與抗寒性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果與石榴[21]、球根花卉[22]、狗牙根[23]等抗寒研究結(jié)果相符。值得一提的是，2個(gè)評價(jià)方法中都利用到了相對電導(dǎo)率這一指標(biāo)。有研究表明，相對電導(dǎo)率在一定程度上反映了膜脂的損傷程度，與抗寒性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這是因?yàn)榈蜏貤l件下，細(xì)胞膜透性增加，電解質(zhì)外滲加大，相對電導(dǎo)率升高[24-25]。本研究中，四面佛和D117的相對電導(dǎo)率在0 ℃降到-5 ℃的范圍內(nèi)上升程度最大;而三亞陽光、香江美人、水芙蓉及D128的相對電導(dǎo)率在-5 ℃降到-10 ℃的范圍內(nèi)上升最明顯，說明四面佛和D117的抗寒性在供試品種中較弱，也表明相對電導(dǎo)率可在一定程度上體現(xiàn)植物的抗寒性，但無法反映某一具體品種的抗寒性。

綜上，通過LT50評價(jià)法和隸屬函數(shù)分析法，本研究初步建立了秋石斛抗寒性生理綜合評價(jià)體系，供試的6個(gè)秋石斛抗寒性大小為水芙蓉>香江美人>D128>三亞陽光>四面佛>D117。但在現(xiàn)階段的抗寒研究中，能用來反映植物抗寒性的生理指標(biāo)還有很多，為了更加系統(tǒng)地研究秋石斛的抗寒性機(jī)理，筆者所在課題組下一步將通過測定不同低溫脅迫條件下的更多生理指標(biāo)，對綜合評價(jià)體系進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，挖掘出調(diào)控秋石斛抗寒的關(guān)鍵基因，揭示秋石斛響應(yīng)低溫脅迫的分子調(diào)控機(jī)制，為從理論上深入闡明秋石斛抗寒機(jī)理、促進(jìn)秋石斛抗寒品種選育奠定基礎(chǔ)。

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