潘麗梅 韋樹根 何麗麗 萬凌云 付金娥

摘要：為研究低溫脅迫下桑寄生頑拗性種子各生理生化指標(biāo)的變化，以不同溫度處理桑寄生種子，然后在不同時間段取樣進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定。結(jié)果表明，桑寄生種子對低溫敏感，低溫脅迫下其電導(dǎo)率、可溶性糖含量、淀粉含量、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性等均受到了不同程度的影響甚至破壞，其中0 ℃為桑寄生種子最敏感的低溫界限，0 ℃下放置12 h和36 h時各項(xiàng)指標(biāo)變化最明顯，低于0 ℃的條件已不利于桑寄生種子的萌發(fā)和保存，研究結(jié)果將為桑寄生種子的萌發(fā)及保存提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑寄生;頑拗性種子;低溫脅迫;生理生化

中圖分類號：S567.01 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0109-04

桑寄生[Taxillus chinensis （DC.） Danser]，植物學(xué)名廣寄生，是我國傳統(tǒng)的常用大宗中藥材，具有祛除風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元的功效[1]，為歷版《中國藥典》收載品種，也是廣西乃至我國極具特色的道地寄生類藥材，早在明朝萬歷年間的《廣西通志》就記載了桑寄生和桑寄生酒是廣西的主要特產(chǎn)[2]。桑寄生種子是典型的頑拗性種子，具有頑拗性種子的典型特征，易失活，低溫敏感性強(qiáng)，但是作為一種寄生類植物，只能通過其種子進(jìn)行繁殖，因此種子的頑拗性嚴(yán)重制約其繁育與發(fā)展[3]。目前對頑拗性種子的低溫保存技術(shù)研究較多[4-6]，但能真正實(shí)行長期低溫保存的實(shí)例較少，其根本原因是對低溫敏感的響應(yīng)機(jī)制了解不夠，因此作為引起頑拗性種子死亡的主要原因之一，種子低溫敏感性研究一直備受關(guān)注。當(dāng)種子遭到低溫脅迫時，一方面會引起生物膜的變化，從液晶態(tài)變成凝膠態(tài);另一方面也會引起膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的變化，使膜上的各種酶活性受到損害，從而引起細(xì)胞生理生化發(fā)生異常變化，造成種子的劣變甚至死亡。另外，有研究表明，為減緩低溫所帶來的傷害，種子本身會通過形成一些小分子物質(zhì)或者讓原有物質(zhì)進(jìn)行分解，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)含物中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，從而達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞膜系統(tǒng)的作用，緩解低溫脅迫造成的損害[7-8]。因此，本研究以桑寄生種子為材料，研究低溫脅迫下其電導(dǎo)率及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性等相關(guān)生理指標(biāo)的變化，為系統(tǒng)研究桑寄生低溫敏感和低溫保存技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年11月至2019年4月，采集廣西壯族自治區(qū)藥用植物園科研基地中寄生于桑樹上的桑寄生種子作為試驗(yàn)材料，選取成熟度一致、飽滿、無病蟲害與機(jī)械損傷的桑寄生種子，經(jīng)前期清洗、剝除果皮果膠后置于不同溫度（-4、0、4、10 ℃）下處理12、24、36、48 h，以25 ℃培養(yǎng)（CK）處理同樣時長為對照，了解低溫敏感過程的生理生化變化，其中-4、0、4、10 ℃置于可設(shè)置不同溫度冰箱中（相對濕度為70%～75%），其精確度為±0.1 ℃，25 ℃（CK）處理置于人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行（相對濕度為70%～75%，為與冰箱光照度保持一致，培養(yǎng)箱的光照關(guān)閉），然后對桑寄生種子各處理進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測定及分析。

1.2 方法

參照李合生的方法[9]，采用DDS-307型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率;采用蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉的含量;采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量;采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性;采用抑制光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性;抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性采用抗壞血酸過氧化物酶試劑盒進(jìn)行測定，具體操作按試劑盒方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3次重復(fù)，用Microsoft Office Excel和SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子浸出液相對電導(dǎo)率的變化

相對電導(dǎo)率在一定程度上可以反映植物細(xì)胞膜透性的變化趨勢，反映細(xì)胞膜遭受逆境脅迫時所受到的影響。由圖1可見，隨著低溫脅迫處理的進(jìn)行以及處理時間的延長，桑寄生種子的相對電導(dǎo)率整體呈上升趨勢，且均高于對照值，但不同的低溫處理下，升高的幅度不同，在10 ℃和4 ℃處理下隨著低溫時間的延長電導(dǎo)率的增幅不大，但在0 ℃和-4 ℃處理下其電導(dǎo)率的增幅較大，特別是在低溫處理的12 h后明顯增加，說明桑寄生種子于0 ℃以下低溫處理12 h以后，細(xì)胞膜透性產(chǎn)生了較大的變化，如相關(guān)的外滲物質(zhì)增多，表明細(xì)胞膜遭受到了一定程度上的破壞，從而導(dǎo)致其相對電導(dǎo)率不斷上升。

2.2 可溶性糖含量的變化

可溶性糖的種類主要包括蔗糖、葡萄糖等一系列糖類物質(zhì)，其含量變化與抗凍能力密切相關(guān)，一定含量的糖類物質(zhì)可明顯提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，并維持低溫下細(xì)胞膜的正常功能。由圖2可以看出，桑寄生種子在逐漸低溫培養(yǎng)的過程中，可溶性糖含量整體上呈緩慢下降然后上升接著又下降的過程，10 ℃和4 ℃整體上影響不大，到0 ℃時突然升高然后下降，可能是因?yàn)楫?dāng)種子遭遇低溫傷害時，種子通過增加相關(guān)的糖類物質(zhì)含量來達(dá)到抗凍目的，0 ℃時的增加最為明顯，均高于對照水平。此外，0 ℃放置不同時間的影響也不一樣，總體上是隨著放置時間的延長可溶性糖含量進(jìn)一步降低，在0 ℃放置12 h時達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，可見0 ℃冰點(diǎn)前后是可溶性糖含量變化的最大時期，也是最關(guān)鍵的時期，表明處于低溫結(jié)冰期的桑寄生種子所遭受的脅迫已達(dá)極限，對低溫最敏感。

2.3 淀粉含量的變化

當(dāng)種子處于低溫環(huán)境從而遭受低溫脅迫時，其內(nèi)含物均會發(fā)生一系列的變化，其中淀粉含量的動態(tài)變化與碳水化合物積累的趨勢息息相關(guān)。由圖3可見，25 ℃（CK）和10 ℃處理?xiàng)l件下，各處理時間點(diǎn)的淀粉含量變化不大，但隨著處理溫度的降低，淀粉含量呈緩慢增加然后急劇下降的過程，具體表現(xiàn)為在低溫處理前期，各處理時間點(diǎn)的淀粉含量均呈上升趨勢，與4 ℃處理相比，到達(dá)0 ℃時，放置 12 h 時淀粉含量仍然呈上升趨勢，但在放置36 h后開始下降，不過總體上仍高于對照水平。在4 ℃處理?xiàng)l件下，隨著放置時間的延長，淀粉含量逐漸上升;但在0 ℃處理?xiàng)l件下，隨著低溫放置時間的延長，淀粉含量則逐漸降低;而在-4 ℃時各處理時間點(diǎn)的淀粉含量均呈急劇下降的趨勢，且幅度下降較大，推測是由于低溫誘導(dǎo)了水解酶的活性，使淀粉的分解加速。

2.4 可溶性蛋白含量的變化

可溶性蛋白是種子內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，與植物的抗凍性密切相關(guān)。遭遇低溫脅迫時植物可溶性蛋白含量會有一定程度的增加，但低于界限溫度則影響蛋白合成。由圖4可知，桑寄生種子低溫過程中其可溶性蛋白含量呈緩慢下降然后上升最后下降的趨勢， 波動性較大。隨著處理時間的延長，在0 ℃處理?xiàng)l件下，可溶性蛋白含量逐漸增加，在放置36 h時達(dá)到峰值，隨后下降，這也可能是機(jī)體對低溫環(huán)境逐步適應(yīng)的表現(xiàn)，而在-4 ℃處理?xiàng)l件下，各時間點(diǎn)的可溶性蛋白含量直線下降，且都低于對照值，說明蛋白合成已嚴(yán)重受阻。

2.5 過氧化氫酶（CAT）活性的變化

過氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，可以控制植物體內(nèi)的H2O2水平。圖5顯示，低溫處理前期，桑寄生種子的CAT活性總體上呈緩慢上升的趨勢，說明遭受低溫脅迫后反而誘導(dǎo)了CAT活性增加。低溫處理12、24、36 h，CAT活性在波動中上升，在0 ℃放置36 h時達(dá)到峰值，隨后直線下降;而低溫處理48 h，CAT活性前期平穩(wěn)上升，但在4 ℃低溫以后下降，除了-4 ℃低溫處理下，其他低溫處理后的CAT活性與對照相比，均高于對照;隨著低溫處理的進(jìn)一步進(jìn)行，CAT活性均受到明顯抑制，迅速降低，表明低溫處理過程桑寄生種子的CAT酶遭受了嚴(yán)重的破壞，其中0 ℃為最敏感的溫度界限。

2.6 超氧化物歧化酶 （SOD） 活性的變化

SOD是清除氧自由基的關(guān)鍵酶之一，可以減緩氧自由基對細(xì)胞膜的傷害。圖6顯示，低溫處理的12 h和36 h，桑寄生種子的SOD活性前期呈平緩上升后期則出現(xiàn)明顯下降的趨勢，于0 ℃處理36 h時達(dá)到最大值，然后開始下降并低于對照值，表明低溫處理后期其SOD酶受到了不可逆轉(zhuǎn)的破壞，從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)進(jìn)一步受到損害。

2.7 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的變化

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一，其活性的升高可使超氧陰離子自由基（O-2 ·）產(chǎn)生速率下降，膜質(zhì)過氧化作用減弱[10]。由圖7可知，在桑寄生種子低溫脅迫過程中，APX的活性先上升然后在波動中下降，以4 ℃處理48 h 時活性最高，0 ℃處理時開始下降，其中12 h時下降最明顯，表明桑寄生種子在低溫處理前期APX活性增加，后期則下降，特別是 -4 ℃ 處理?xiàng)l件下其APX活性均低于對照。前期APX活性的升高，說明桑寄生種子抵御膜脂過氧化的能力提高，后期下降可能是因?yàn)榈蜏匾呀?jīng)嚴(yán)重傷害桑寄生種子，損害了APX酶本身。

3 結(jié)論與討論

頑拗性種子由于不耐低溫，因此常規(guī)的長期保存方法難以適用，如低溫種子庫等。玩拗性種子的保存一直以來都是頑拗性種子植物研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，因此了解頑拗性種子低溫敏感機(jī)理尤為重要，但頑拗性種子的低溫敏感性是一個復(fù)雜的進(jìn)化過程。目前在頑拗性種子研究方面，大部分的研究主要在于脫水敏感性研究，而對其低溫敏感研究較少。桑寄生種子對低溫敏感，本試驗(yàn)的低溫脅迫過程表明，0 ℃為桑寄生種子最敏感的溫度界限，明顯有別于其他正常性種子，如榔榆種子的低溫耐受范圍為≥-10 ℃[11]。植物低溫脅迫下其生理生化指標(biāo)會出現(xiàn)明顯變化甚至是一些不可逆的影響，主要表現(xiàn)在葉綠素合成受阻、各種光合酶活性受到抑制、細(xì)胞膜系統(tǒng)受損、體內(nèi)的各種代謝發(fā)生紊亂、植物體內(nèi)的滲透物質(zhì)和水含量的改變等方面[12-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫溫度的降低和脅迫時間的延長，桑寄生種子的電導(dǎo)率總體呈增加趨勢，說明電導(dǎo)率與低溫及低溫脅迫的持續(xù)時間密切有關(guān)，處理溫度越低，處理時間越長，細(xì)胞膜系統(tǒng)受的破壞越嚴(yán)重，電導(dǎo)率也越大，這與低溫脅迫下玉米種子萌發(fā)過程的電導(dǎo)率變化情況相似[15]。

可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉等作為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和內(nèi)含物，通過積累或分解滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡的目的，從而緩解逆境條件下對植物所造成的傷害[16]。本試驗(yàn)中，隨著處理溫度的降低和處理時間的延長，桑寄生種子的可溶性糖、可溶性蛋白以及淀粉含量都有了明顯的變化，可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)出“降—升—降”的變化趨勢，而淀粉含量則呈現(xiàn)出“升—升—降”的變化趨勢，有學(xué)者認(rèn)為，較高含量的可溶性糖和可溶性蛋白是增強(qiáng)植物抗寒性的內(nèi)在原因[17]，說明桑寄生種子在遭遇低溫過程中，合成了相關(guān)的糖和蛋白來對抗低溫脅迫，但隨著低溫時間的延長合成明顯受損。另外低溫脅迫下，CAT、SOD和APX活性隨脅迫溫度的下降和脅迫時間的延長總體上呈先升高后下降的變化過程，這可能是保護(hù)酶應(yīng)對逆境的一種響應(yīng)。在本試驗(yàn)中，保護(hù)酶活性不斷升高，可防御低溫對種子造成的傷害，但達(dá)到一定溫度或者一定時間時酶活性下降，說明某個溫度下或者某個低溫延續(xù)時間下可能已導(dǎo)致種子受到凍害，這與低溫處理下的羯布羅香種子[18]、蓖麻種子[19]的響應(yīng)相似。眾所周知，CAT作為清除H2O2的重要酶類，主要通過Halliwell-Asada途徑清除葉綠體中過多的H2O2，而APX恰好是這一途徑的重要組分之一[20-21]，因此兩者的變化更能反映系統(tǒng)清除H2O2的能力，而SOD則是抵御氧化損傷的首道防線[22]，SOD、CAT、APX被認(rèn)為是H2O2清除系統(tǒng)中最重要的酶類。研究結(jié)果表明，桑寄生種子不耐低溫，低于0 ℃時其活性氧和體內(nèi)的保護(hù)系統(tǒng)動態(tài)平衡已被破壞，進(jìn)一步加劇了自身的膜脂過氧化作用。

綜上所述，桑寄生種子低溫脅迫下電導(dǎo)率、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、內(nèi)含物、抗氧化系統(tǒng)等均受到了不同程度的影響甚至破壞，0 ℃為桑寄生種子最敏感的低溫界限，0 ℃下放置12 h和36 h時各項(xiàng)指標(biāo)變化最明顯，低于0 ℃的條件已不利于桑寄生種子的萌發(fā)和保存，本研究結(jié)果將為后續(xù)關(guān)于低溫敏感對桑寄生種子生理生化影響的更全面地研究提供一定的參考，也將為進(jìn)一步探討其低溫敏感機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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