益腎生發(fā)片優(yōu)化工藝研究及顯微、薄層鑒別

連 冠

益腎生發(fā)片是大連市中醫(yī)醫(yī)院采用現(xiàn)代制備工藝研制的復(fù)方中藥制劑[1]，由菟絲子、桑椹、何首烏、黑芝麻、枸杞子、柴胡、丹參、當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎、桑葉、側(cè)柏葉13味中藥組成。具有疏肝益腎、養(yǎng)血生發(fā)的作用，用于斑禿、神經(jīng)性皮炎、脂溢性皮炎、全禿、普禿之血虛、肝郁、血瘀型者療效顯著，無(wú)明顯不良反應(yīng)。為保證產(chǎn)品的可控性和重現(xiàn)性，保證臨床療效，優(yōu)化益腎生發(fā)片的制備工藝，從而對(duì)益腎生發(fā)片進(jìn)行顯微鑒別、定性鑒別，進(jìn)而建立益腎生發(fā)片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為益腎生發(fā)片的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器六管崩解儀(LB2881B 型，上海分析儀器廠)；片劑四用測(cè)定儀(上海黃海藥廠)；電熱恒溫水浴鍋(HH.SY21-NI型，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9070A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電子天平(JA1003型，上海精科天平儀器廠)；OLYMPUS 正置熒光顯微鏡(CX31P-OC-1型，奧林巴斯株式會(huì)社)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(U-3010型，日立)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2型，國(guó)華電器有限公司)。

1.2 試劑及樣品醋酸乙酯、正已烷、甲醇、甲酸、水合氯醛、甘油-乙醇等試劑產(chǎn)自天津市科密歐試劑廠；TLC 硅膠G產(chǎn)自青島海洋化工廠；羧甲基淀粉鈉產(chǎn)自華唯纖維素有限公司。益腎生發(fā)片樣品(大連市中醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)為Z02160601、Z02160602、Z02160603，規(guī)格為0.3 g/片)；大黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為110756-200110)；藥材均購(gòu)自大連醫(yī)藥公司中藥批發(fā)部。

2 方法

2.1 優(yōu)化工藝研究益腎生發(fā)片是大連市中醫(yī)醫(yī)院總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的院內(nèi)制劑，在臨床上取得了良好的治療效果。在不改變?cè)に嚨臈l件下，為增強(qiáng)其療效，保證質(zhì)量，對(duì)益腎生發(fā)片生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，使其生產(chǎn)過(guò)程更加穩(wěn)定，可控。配制工藝：以上13味中藥，菟絲子、柴胡、丹參、桑葉、側(cè)柏葉加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成膏。其他桑椹等8味粉碎成細(xì)粉，與上述膏混勻，干燥，粉碎，過(guò)篩，混勻，制成顆粒，壓制成1000片，即得。見(jiàn)圖1。

圖1 益腎生發(fā)片生產(chǎn)工藝

2.1.1 出膏率的考察按處方量取菟絲子、柴胡、丹參、桑葉、側(cè)柏葉5味藥材共201.6 g，共3份，分別進(jìn)行水煮提取，測(cè)定出膏率[2]。第1次加12倍量水加熱提取1 h，第2次加10倍量水加熱提取1 h，合并2次提取液，濃縮，分別定容至1000 ml從中精密移取100 ml溶液，置干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再放置烘箱中(105 ℃)烘至恒重，稱定重量，計(jì)算出膏率?？梢?jiàn)原提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。見(jiàn)表1。

表1 出膏率檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 原粉藥材粉碎度的考察以粉碎后的細(xì)粉過(guò)篩的難易及壓片的情況對(duì)粉碎的細(xì)度進(jìn)行選取，并測(cè)定收粉率[3]。取桑椹、何首烏、黑芝麻、枸杞子、當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎藥材共300.8g，粉碎后分別篩取過(guò)60目、80目、100目的細(xì)粉，與相應(yīng)量的清膏混合、制粒、干燥、壓片，觀察記錄，可見(jiàn)藥材宜粉碎成過(guò)80目的粉末。見(jiàn)表2。

表2 粉碎細(xì)度的選擇

2.1.3 原粉藥材粉碎收粉率的考察取桑椹、何首烏、黑芝麻、枸杞子、當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎藥材共300.8g，平行取3份,粉碎后篩取過(guò)80目的細(xì)粉，測(cè)定收粉率，可見(jiàn)粉碎的平均收粉率為96.1%，該粉碎工藝可行。見(jiàn)表3。

表3 藥物粉碎收粉率考察結(jié)果

2.1.4 制粒工藝考察(黏合劑考察、制粒目數(shù)考察、制粒干燥條件考察)①黏合劑考察：清膏與藥粉混合，制成片劑，因流動(dòng)性差，需要制成顆粒，取以上三份清膏，與桑椹、何首烏、黑芝麻等粉碎后的細(xì)粉混合均勻，取混合后的藥物100g，共3份，分別以80%乙醇、水、3%羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)為黏合劑，制粒。結(jié)果可見(jiàn)水和3%CMS-Na均符合制粒要求，由于CMS-Na能起到一定的崩解作用，故確定3%CMS-Na為黏合劑。②制粒目數(shù)考察：由于本品未加任何輔料,要求顆粒較細(xì)，片子外觀光滑且具有一定的硬度，所以試驗(yàn)對(duì)制粒及整粒的目數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果可見(jiàn)采用20目制粒、20目整粒，壓片，片劑外觀光滑，硬度適宜。③制粒干燥條件考察：顆粒干燥采用熱風(fēng)循環(huán)烘箱干燥，溫度控制在60～70 ℃，對(duì)干燥時(shí)間及顆粒含水量進(jìn)行了考察，觀察壓片效果結(jié)果并記錄，結(jié)果可見(jiàn)顆粒在熱風(fēng)循環(huán)烘箱干燥，溫度控制在60～70 ℃，干燥3 h，顆粒的水分控制在4%左右，壓出的片子質(zhì)量較好。見(jiàn)表4～表6。

表4 黏合劑考察結(jié)果

表5 制粒目數(shù)考察結(jié)果

表6 制粒干燥條件考察結(jié)果

2.1.5 崩解時(shí)限考察試制三批片劑，參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》附錄崩解時(shí)限檢查法檢查，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 崩解時(shí)限考察

3 結(jié)果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定藥材粉碎過(guò)5號(hào)篩(80目)、選用3%CMS-Na為崩解劑、制成20目顆粒進(jìn)行壓片，片劑成型性好，硬度、崩解時(shí)限均符合要求。

3.1 顯微鑒別取益腎生發(fā)片樣品2片[4-7]，研磨成粉末狀；取適量粉末于載玻片上，用吸管滴幾滴水合氯醛，用鑷子夾取在酒精燈上進(jìn)行透化，待水汽散開(kāi)近干即可滴加甘油-乙醇試液，蓋上蓋玻片，排除氣泡完成制片。用顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。通過(guò)顯微鏡可以觀測(cè)到種皮石細(xì)胞成片，較大，淡棕色，表面觀不規(guī)則多角形或長(zhǎng)多角形，直徑49～115 μm。垂周壁波狀彎曲，壁厚約至25 μm，層紋較明顯。這是枸杞子種皮石細(xì)胞所特有的特征，表明該樣品中含有枸杞子，見(jiàn)圖2。草酸鈣簇晶直徑約34 μm，存在于薄壁細(xì)胞中，常排列成行，或一個(gè)細(xì)胞中含數(shù)個(gè)草酸鈣簇晶。這是白芍所特有的草酸鈣直徑范圍，表明該樣品中含有白芍，見(jiàn)圖3。薄壁細(xì)胞棕色或淡棕色，大多皺縮，形狀不規(guī)則，細(xì)胞中具深棕色長(zhǎng)圓形或梭形核狀物，表明該樣品中含有熟地黃，見(jiàn)圖4。

圖2 枸杞子種皮石細(xì)胞(10×40)

圖3 白芍草酸鈣簇晶(10×20)

圖4 熟地黃薄壁細(xì)胞(10×40)

3.2 薄層鑒別供試品溶液的制備：取益腎生發(fā)片[8]3個(gè)批號(hào)(批號(hào)：Z02160601、Z02160602、Z02160603)的樣品各1片，分別研磨至粉末狀，再分別加入醋酸乙酯20 ml，鹽酸1 ml，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)謩e加入甲醇5 ml使其溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備： 取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。展開(kāi)劑與顯色條件：照薄層色譜法[9-12](《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部附錄0502薄層色譜法)試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯-甲酸(6∶2∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。益腎生發(fā)片中何首烏的主要成分為大黃素，在色譜圖中可以看到：供試品薄層色譜斑點(diǎn)清晰，色譜分離良好，大黃素斑點(diǎn)附近無(wú)其他斑點(diǎn)干擾，無(wú)背景干擾?？梢宰鳛橐婺I生發(fā)片定性鑒別的有效方法。見(jiàn)圖5。

注：1為大黃素對(duì)照品，2、3、4對(duì)應(yīng)為益腎生發(fā)片3個(gè)批號(hào)Z02160601、Z02160602、Z02160603樣品的供試品圖5 大黃素薄層色譜圖

4 討論

快節(jié)奏的生活，巨大的精神壓力，使得越來(lái)越多的人面臨脫發(fā)的困擾。擺脫脫發(fā)成為現(xiàn)階段社會(huì)有待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。

本次制備工藝研究以片劑成型性為指標(biāo)對(duì)出膏率、粉碎細(xì)度、顆粒大小、崩解時(shí)限等因素進(jìn)行考察，確定藥材粉碎過(guò)5號(hào)篩(80目)、選用3%CMS-Na為崩解劑、制成20目顆粒進(jìn)行壓片，片劑成型性好，硬度、崩解時(shí)限均符合要求；對(duì)益腎生發(fā)片進(jìn)行顯微鑒別可以清晰看到枸杞子種皮石細(xì)胞、白芍草酸鈣簇晶、熟地黃薄壁細(xì)胞，取得了較好的鑒別效果，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)；在薄層鑒別中對(duì)益腎生發(fā)片中的何首烏進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示：分離效果較好，斑點(diǎn)清晰明顯，無(wú)背景干擾，可以作為益腎生發(fā)片定性鑒別的有效方法。

本文通過(guò)優(yōu)化益腎生發(fā)片的制備工藝，對(duì)益腎生發(fā)片進(jìn)行顯微、定性鑒別，為建立益腎生發(fā)片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，進(jìn)而為益腎生發(fā)片的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)提供必要條件。