遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞鐵死亡的影響*

邱招輝，張賀平▲，李健玲，王華東，陸大祥，戚仁斌△

（1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510632）

缺血缺氧性腦病是老年人的多發(fā)病，通常是腦組織在缺血缺氧后，血液及氧氣重新進(jìn)入缺血組織而造成一種損傷［1］，而缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygen‐ation，H/R）損傷是缺血缺氧性腦病中的一個(gè)關(guān)鍵因素，并且缺血再灌注損傷是大多數(shù)腦血管病的主要機(jī)制，主要與鈣超載、自由基堆積和線粒體損傷等有關(guān)［2-3］。當(dāng)血液和氧氣重新恢復(fù)時(shí)，大量酶促反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基誘發(fā)多不飽和脂肪酸或血漿脂蛋白的過(guò)氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、甚至DNA的損傷［4］。大腦是機(jī)體代謝比較旺盛的器官之一，缺血缺氧引起的腦功能障礙可致殘甚至死亡［5］。當(dāng)腦神經(jīng)元缺氧時(shí)，氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗導(dǎo)致線粒體損傷、氧化應(yīng)激或神經(jīng)元的丟失［6］，細(xì)胞會(huì)發(fā)生壞死、凋亡和自噬等，亦被認(rèn)為是腦缺血缺氧性損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7-9］，并且是影響預(yù)后缺血缺氧性腦病恢復(fù)的重要因素［10］。已有研究表明，鐵死亡（ferroptosis）通常與其他類型細(xì)胞死亡有著相似的途徑［11］，有學(xué)者認(rèn)為缺血再灌注損傷中缺氧/復(fù)氧這一病理生理過(guò)程與鐵死亡的關(guān)系密切［12］。鐵死亡在形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)上與凋亡、壞死等明顯不同，是以細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）濃度升高（鐵沉積）、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）堆積和脂質(zhì)過(guò)氧化等為主要特征的程序性細(xì)胞死亡方式［13］。

本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷元（se‐negenin，Sen）具有抗氧化，清除氧自由基，抗凋亡和保護(hù)神經(jīng)的作用［14-16］，那么Sen是否對(duì)鐵死亡也有影響，其機(jī)制如何尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建H/R損傷大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的模型，探討這一細(xì)胞模型中是否存在鐵死亡，以及Sen干預(yù)是否會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響等，希望能為相關(guān)疾病的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 PC12細(xì)胞系

高分化PC12細(xì)胞（No.TCR-9）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 主要試劑

多聚賴氨酸和噻唑藍(lán)（MTT）、總谷胱甘肽（gluta‐thione，GSH）檢測(cè)試劑盒和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒和ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；熒光Ⅰ抗：微管相關(guān)蛋白2（microtubuleassociated protein-2，MAP-2）多克隆抗體、熒光Ⅱ抗和羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自Proteintech；RPMI-1640液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；0.25%胰蛋白酶、鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）購(gòu)自北京普博欣公司；Fe2+檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)普利萊公司；線粒體膜電位（ΔΨm）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京固與生物公司；兔抗谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）和胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11（solute carrier family 7 member 11）單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗GAPDH和?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）多克隆抗體購(gòu)自Affinity；羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物公司。

3 主要方法

3.1 高分化型PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 將胎牛血清與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶9配成10%完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)密度達(dá)到80%左右用0.25%胰酶消化液，吹打均勻后進(jìn)行傳代、鋪板。

3.2 MTT法篩選最佳實(shí)驗(yàn)條件 將對(duì)數(shù)期PC12細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后，棄上清，加100μL 10%MTT培養(yǎng)基，移至培養(yǎng)箱孵育4 h；棄上清，每孔加150μL DMSO，搖勻10 min；酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)每孔吸光度（A）值。

3.3 構(gòu)建H/R細(xì)胞模型和鐵死亡細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)分組 篩選H/R損傷PC12細(xì)胞和erastin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞鐵死亡的最佳條件。將對(duì)數(shù)期的PC12細(xì)胞接種6孔板中培養(yǎng)24 h后，根據(jù)篩選條件分為4類共9組：（1）對(duì)照組，包括control組（無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 h）、Sen組（含60μmol/L Sen的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 h）和Fer-1組（含5μmol/L Fer-1的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 h）；（2）模型組，包括H/R組（細(xì)胞培養(yǎng)板加缺氧液，并將培養(yǎng)板放入裝有缺氧劑的厭氧培養(yǎng)袋中，培養(yǎng)12 h后，棄缺氧液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)2 h）和erastin組（含10μmol/L erastin的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)14 h）；（3）Fer-1干預(yù)組，包括H/R+Fer-1組（含5μmol/L Fer-1的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后，棄原培養(yǎng)基，加入含5μmol/L Fer-1的缺氧液，無(wú)氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，棄去缺氧液，加含5μmol/L Fer-1的無(wú)血清培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)2 h）和eras‐tin+Fer-1組（含5μmol/L Fer-1無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后，加10μmol/L erastin無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h）；（4）Sen干預(yù)組，包括H/R+Sen組（把Fer-1換成Sen，其他條件同H/R+Fer-1組）和erastin+Sen組（把Fer-1換成Sen，其他條件同erastin+Fer-1組）。

3.4 免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，棄原培養(yǎng)基，PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，0.2%TritonX-100通透10 min；PBS洗3次，加10%山羊血清封閉30 min；棄原封閉液，加1∶100抗MAP-2抗體稀釋液過(guò)夜；PBS洗3次，加Ⅱ抗（1∶200）室溫避光孵育1.5 h；PBS洗3次，加DAPI染核10 min，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。將所得熒光圖片使用ImageJ軟件進(jìn)行分析：隨機(jī)選取神經(jīng)元的軸突，按照已知標(biāo)尺長(zhǎng)度，測(cè)量該段突起長(zhǎng)度，將所獲得的突起長(zhǎng)度用Graph Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.5 LDH活性的檢測(cè) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清離心；按照LDH試劑盒步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞LDH水平變化。

3.6 細(xì)胞內(nèi)Fe2+的檢測(cè) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，PBS洗2遍，棄PBS，加裂解液裂解細(xì)胞，置于搖床裂解2 h后，把細(xì)胞刮下待用；按照Fe2+檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)各組細(xì)胞Fe2+水平。

3.7 細(xì)胞內(nèi)總GSH的檢測(cè) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，PBS洗滌細(xì)胞一次，用細(xì)胞刮刀把細(xì)胞刮下，離心收集細(xì)胞，棄上清；按照總GSH試劑盒的步驟檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)總GSH水平。

3.8 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的檢測(cè) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入200μL Western blot及IP細(xì)胞裂解液，裂解30 min后，把細(xì)胞刮下，4℃、12 000×g離心10 min，取上清；按照GSH-Px試劑盒步驟，計(jì)算出各組細(xì)胞GSH-Px水平。

3.9 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，PBS洗滌細(xì)胞1次，棄PBS，加入經(jīng)PBS稀釋后的DCFH-DA（10μmol/L），37℃孵育30 min；PBS洗滌2次，加適量PBS，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度（488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)）的變化，并拍照。

3.10 ΔΨm的檢測(cè) 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，PBS洗滌細(xì)胞一次，棄PBS，按1∶1比例加細(xì)胞培養(yǎng)液和JC-1染色工作液，充分混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；孵育期間，按照每1 mL JC-1（5×）染色緩沖液加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1（1×）染色緩沖液，并放置于冰浴。孵育結(jié)束后，棄上清，用冷的JC-1（1×）緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（JC-1單體激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為529n m；JC-1聚合物的激發(fā)波長(zhǎng)為585 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm）。

3.11 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白 按3.3實(shí)驗(yàn)分組給藥處理細(xì)胞后，加RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞；4℃、12 000×g離心25 min，收集上清；通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并加5×上樣緩沖液；置于100℃金屬浴煮5 min；取一定量總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉室溫封閉1 h，TBST漂洗3次，分別用稀釋的Ⅰ抗（抗ACSL4、GPX4、SLC7A11和內(nèi)參照GAPDH抗體）4℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗3次，加入Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各蛋白的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法篩選H/R的最佳時(shí)間和erastin的最佳濃度

與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)不同H/R時(shí)間，PC12細(xì)胞活力均顯著降低（P<0.05），當(dāng)缺氧12 h，復(fù)氧2 h，細(xì)胞活力降低約50%，見(jiàn)圖1A。不同濃度的erastin作用于PC12細(xì)胞14 h后，隨著erastin濃度的升高，PC12細(xì)胞活力與對(duì)照組相比均顯著降低（P<0.05），當(dāng)erastin濃度為10μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力降低約50%，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The effects of H/R time（A）and different concentrations of erastin（B）on the viability of PC12 cells were detected by MTT assay.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.圖1 MTT法檢測(cè)不同H/R時(shí)間和不同濃度erastin對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

2 MTT法檢測(cè)Fer-1和Sen對(duì)PC12細(xì)胞的毒性

在1.25～20μmol/L濃度范圍內(nèi)的Fer-1作用于PC12細(xì)胞14 h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力變化不顯著（P>0.05），見(jiàn)圖2A；在15～240μmol/L濃度范圍內(nèi)的Sen作用于PC12細(xì)胞14 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力變化不顯著（P>0.05），見(jiàn)圖2B。這提示Fer-1和Sen在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

Figure 2.Effects of different concentrations of ferrostatin-1（Fer-1；A）and senegenin（Sen；B）on the viability of PC12 cells were detected by MTTassay.Mean±SD.n=3.圖2 MTT法檢測(cè)不同濃度Fer-1和Sen對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

3 MTT法篩選Fer-1對(duì)H/R和erastin細(xì)胞模型的最佳濃度

不同濃度Fer-1作用于H/R組，PC12細(xì)胞活力在一定濃度范圍內(nèi)先升高后降低，當(dāng)Fer-1濃度為5和10μmol/L時(shí)，與模型組相比，細(xì)胞活力顯著升高（P<0.05），且5μmol/L Fer-1效果最佳，見(jiàn)圖3A；不同濃度Fer-1作用于erastin組，PC12細(xì)胞活力先升高后降低，當(dāng)Fer-1濃度為2.5～20μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力與模型組相比顯著升高（P<0.05），而5μmol/L Fer-1效果更明顯，見(jiàn)圖3B。

Figure 3.Effects of different concentrations of ferrostatin-1（Fer-1）on the viability of PC12 cells in H/R group（A）and erastin group（B）were detected by MTT assay.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/R group；△P<0.05 vs erastin group.圖3 MTT法檢測(cè)不同濃度Fer-1對(duì)H/R組和erastin組細(xì)胞活力的影響

4 MTT法篩選Sen對(duì)H/R和erastin細(xì)胞模型的最佳濃度

不同濃度的Sen作用于H/R組，PC12細(xì)胞活力先升高后降低，當(dāng)Sen濃度為30、60和80μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力與模型組相比顯著升高（P<0.05），而60μmol/L Sen的效果更顯著，見(jiàn)圖4A；不同濃度的Sen作用于erastin組，PC12細(xì)胞活力先升高后降低，當(dāng)Sen濃度為60μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力與模型組相比顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖4B。

Figure 4.Effects of senegenin（Sen）at different concentrations on the viability of PC12 cells in H/Rgroup（A）and erastin group（B）were detected by MTT assay.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/R group；△P<0.05 vs erastin group.圖4 MTT法檢測(cè)不同濃度Sen對(duì)H/R組和erastin組細(xì)胞活力的影響

5 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)

熒光顯微鏡下觀察正常PC12細(xì)胞，成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2染色清晰，突觸明顯交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞貼壁狀態(tài)好；經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，突觸明顯縮短或消失，貼壁性差；加Fer-1或Sen干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善，突觸顯著變長(zhǎng)（P<0.05），見(jiàn)圖5。圖5A顯示細(xì)胞形態(tài)，圖5B為MAP-2熒光染色，圖5C為神經(jīng)元突起長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)圖。

6 LDH漏出和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的變化

經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，與對(duì)照組相比，PC12細(xì)胞LDH漏出水平和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平顯著升高（P<0.05）；加入Fer-1或Sen干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞LDH漏出水平和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖6。

7 細(xì)胞內(nèi)總GSH水平和GSH-Px活性的變化

經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，與對(duì)照組相比，PC12細(xì)胞內(nèi)GSH含量和GSH-Px活性顯著降低（P<0.05）；加入Fer-1或Sen干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)GSH含量和GSH-Px活性顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖7。

8 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化

Figure 5.Observation of the morphological changes of PC12 cells and the neuronal protuberance under microscope.A：the morpho‐logical changes of the cells in each experimental group；B：fluorescence staining for neuron marker MAP-2；C：measure‐ment of the neuronal protuberance length.The scale bar=100μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/Rgroup；△P<0.05 vs erastin group.圖5 顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和神經(jīng)元突起的變化

熒光顯微鏡檢測(cè)顯示，PC12細(xì)胞經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，DCF熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)（P<0.05），表明模型組ROS的含量顯著高于正常組；經(jīng)過(guò)Fer-1或Sen干預(yù)后，與模型組相比，DCF熒光強(qiáng)度顯著降低（P<0.05），即ROS的積累水平顯著降低，見(jiàn)圖8。

9 JC-1熒光探針檢測(cè)ΔΨm的變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，紅色熒光/綠色熒光比值與對(duì)照組相比顯著減?。≒<0.05），表明ΔΨm水平顯著降低；Fer-1或Sen干預(yù)后，與模型組相比，紅光/綠光比值顯著增大（P<0.05），表明ΔΨm水平得到恢復(fù)，見(jiàn)圖9。

10 Western blot檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的情況

PC12細(xì)胞經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，與正常對(duì)照組相比，GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)水平降低，ACSL4蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；Fer-1或Sen干預(yù)后，與模型組相比，ACSL4蛋白表達(dá)水平降低，GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖10。

討 論

Figure 6.The changes of lactate dehydrogenase（LDH）release（A）and ferrous ion（Fe2+）level（B）in the PC12 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/Rgroup；△P<0.05 vs erastin group.圖6 細(xì)胞乳酸脫氫酶和細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子水平的變化

Figure 7.The changes of total glutathione（GSH）level（A）and glutathione peroxidase（GSH-Px）activity（B）in the PC12 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/Rgroup；△P<0.05 vs erastin group.圖7 細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽水平和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的變化

Figure 8.The changes of the level of ROSin the PC12 cells.The scale bar=250μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/Rgroup；△P<0.05 vs erastin group.圖8 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平的變化

Figure 9.The changes of mitochondrial membrane potential in the PC12 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/Rgroup；△P<0.05 vs erastin group.圖9 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平檢測(cè)

Figure 10.The protein levels of GPX4，SLC7A11 and ACSL4 in each group were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H/Rgroup；△P<0.05 vs erastin group.圖10 Western blot檢測(cè)GPX4、SLC7A11和ACSL4的蛋白表達(dá)水平

已有研究證實(shí)缺血缺氧性腦病的病理過(guò)程可誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并伴隨脂質(zhì)過(guò)氧化［17］和細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平升高［18-19］。鐵死亡的主要特征為線粒體膜密度增高、嵴減少或消失、Fe2+升高、ROS堆積、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體system xC?被抑制、GSH耗竭和膜脂氧化損傷等［20］，鐵螯合劑和抗氧化劑可以在一定程度上抑制這一過(guò)程，發(fā)揮相應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)作用［21］。

鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和谷氨酸相似，可抑制sys‐tem xC?對(duì)胱氨酸的攝取，破壞細(xì)胞的抗氧化體系，最終導(dǎo)致鐵依賴的氧化損傷，誘發(fā)鐵死亡［13］；而鐵死亡抑制劑Fer-1是一種選擇性抑制鐵死亡的有效的藥物，它的活性取決于伯芳香胺，能通過(guò)還原機(jī)制，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化［13］，防止膜脂質(zhì)被破壞，進(jìn)而抑制鐵死亡［22］。有研究表明，在Fe2+存在下，GPX4和Fer-1可通過(guò)不同的途徑降低Fe2+水平，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的減少，比酚類抗氧化劑更有效地抑制鐵死亡［23］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin作為PC12細(xì)胞鐵死亡模型誘導(dǎo)劑，而Fer-1作為鐵死亡的抑制劑。結(jié)果顯示，經(jīng)H/R損傷或erastin誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞活力顯著降低，LDH漏出水平顯著升高，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)與正常組相比，細(xì)胞變小，變圓，類神經(jīng)元的突觸變短或消失，提示經(jīng)H/R損傷PC12細(xì)胞模型可能同時(shí)存在鐵死亡的情況。H/R損傷或erastin誘導(dǎo)鐵死亡模型在Fer-1干預(yù)后，兩組細(xì)胞的活力較模型組顯著升高，LDH漏出水平較模型組顯著降低，從而反證了H/R損傷PC12細(xì)胞模型鐵死亡的存在。Sen干預(yù)后的結(jié)果與Fer-1干預(yù)效果相類似，說(shuō)明Sen亦能抑制H/R誘導(dǎo)PC12細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

研究表明，GSH是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，防止氧化應(yīng)激和鐵死亡的重要成分［24］。system xC?是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，是由SLC7A11和SLC3A2兩個(gè)亞基組成的異二聚體，SLC7A11在促進(jìn)胱氨酸攝取和GSH的生物合成方面發(fā)揮著重要作用。鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin可抑制system xC?活性，進(jìn)而抑制了細(xì)胞對(duì)胱氨酸的攝取，導(dǎo)致細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)失衡，并最終誘發(fā)鐵死亡［13］。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。而GPX4是重要的膜脂修復(fù)酶，可以將脂質(zhì)氫過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)醇，進(jìn)而防止Fe2+介導(dǎo)的Fenton反應(yīng)引起的ROS累積，因此抑制GPX4活性易引起脂質(zhì)過(guò)氧化，并進(jìn)一步促發(fā)鐵死亡［25］。ACSL4是促鐵促脂代謝中的關(guān)鍵酶，可以催化磷脂氫過(guò)氧化物而形成花生四烯酰CoA或腎上腺酰CoA［26］。缺乏或抑制ACSL4表達(dá)的細(xì)胞系顯示出對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性較低［27］。有學(xué)者提出，ACSL4的表達(dá)水平可用于判斷細(xì)胞是否容易發(fā)生鐵死亡［28］。因此，本實(shí)驗(yàn)在探討Sen對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞中鐵死亡的影響及可能機(jī)制時(shí)，除了觀察細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ROS水平的變化之外，還對(duì)上述幾個(gè)酶的活性和蛋白表達(dá)等進(jìn)行了檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H/R損傷PC12細(xì)胞模型與正常組相比，細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ROS水平顯著升高，伴隨細(xì)胞內(nèi)GSH水平、GSH-Px活性以及ΔΨm顯著降低，這與erastin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞鐵死亡結(jié)果類似；加入Sen干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)Fe2+的升高被顯著抑制，ROS水平亦顯著降低，并且細(xì)胞內(nèi)的GSH水平、GSH-Px活性及ΔΨm水平顯著升高。這一結(jié)果與Fer-1干預(yù)組相類似。進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況的結(jié)果顯示，erastin組和H/R組的SLC7A11和GPX4蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，顯著下調(diào)，提示H/R誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷與erastin誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡相似，通過(guò)下調(diào)SLC7A11影響sys‐tem xC?合成，進(jìn)而導(dǎo)致了GPX4下調(diào)；同時(shí)erastin組和H/R損傷組的ACSL4蛋白表達(dá)上調(diào)，提示erastin組細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性增高（易發(fā)生鐵死亡），且H/R損傷有相似結(jié)果。而加入Fer-1或Sen干預(yù)或交叉干預(yù)后，GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)上調(diào)，ACSL4蛋白表達(dá)下調(diào)，且Sen與Fer-1兩者的作用相似。

綜上所述，H/R損傷PC12細(xì)胞模型中存在鐵死亡，且Sen能抑制鐵死亡，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能與Sen提高細(xì)胞清除氧自由基能力，降低細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平和上調(diào)GPX4蛋白表達(dá)等有關(guān)；交叉干預(yù)的結(jié)果提示Sen的這一作用與鐵死亡抑制劑Fer-1保護(hù)作用相似。