特異標(biāo)記生血內(nèi)皮的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系的構(gòu)建*

洪平山，于 波▲，劉雨婷，劉高科，侯思元，陳捷凱，王金勇，蘭 雨△

（1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510630；2中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州510700；3中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京100071）

造血干細(xì)胞（hematopoietic stemcells，HSC）位于成體造血系統(tǒng)的最上游，具有自我更新和分化為各種譜系血液細(xì)胞的潛能，HSC的發(fā)生發(fā)育與血管生血內(nèi)皮密切相關(guān)［1］。HSC起源于胚胎發(fā)育中期的定向造血階段，主要發(fā)生于主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-go‐nad-mesonephros，AGM）區(qū)域的背主動(dòng)脈腹側(cè)［2-3］，這些定位在動(dòng)脈血管內(nèi)皮并具有生血潛能的細(xì)胞群體就是生血內(nèi)皮細(xì)胞（hemogenic endothelial cells，HEC），HEC經(jīng)過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化向動(dòng)脈血管管腔內(nèi)出芽形成動(dòng)脈內(nèi)造血簇，HSC即產(chǎn)生于這些造血簇。由于在胚胎造血發(fā)生位點(diǎn)的HEC數(shù)量稀少且轉(zhuǎn)瞬即逝，在體內(nèi)的功能驗(yàn)證也存在技術(shù)瓶頸，這些因素增加了精準(zhǔn)捕獲這群具有HSC重建潛能的HEC的困難。為此，我們前期構(gòu)建了全新的基因敲入Neurl3-EGFP熒光報(bào)告小鼠，實(shí)現(xiàn)了對(duì)“具有HSC命運(yùn)的HEC（HSC-primed HEC）”的高效識(shí)別與分離［4］。為了更好地利用造血發(fā)育理論指導(dǎo)體外造血再生，我們借鑒Takahashi等［5］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個(gè)經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞重編程方案，其中選取Oct4、Sox2和Klf43個(gè)轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)已分化的Neurl3-EGFP小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF），簡(jiǎn)稱為NE-MEF，轉(zhuǎn)分化為具有胚胎干細(xì)胞（embry‐onic stem cells，ESC）形態(tài)與功能的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC），簡(jiǎn)稱為NEiPSC，通過各項(xiàng)多能性驗(yàn)證，完成了可高效指示造血發(fā)育的功能細(xì)胞系的構(gòu)建，為后續(xù)的體外定向誘導(dǎo)血液再生提供一種重要的報(bào)告工具。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本課題組利用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)的C57BL/6N品系小鼠（合格證號(hào)：111021300011679；購(gòu)自北京百奧賽圖生物技術(shù)有限公司），通過CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因敲入策略構(gòu)建的全新報(bào)告基因Neurl3-EGFP小鼠，毛發(fā)純黑色，8～10周齡，體重在18～20 g之間，取3只雌鼠與1只雄鼠合籠并做好標(biāo)記。由于其可在生血內(nèi)皮細(xì)胞與造血干/祖細(xì)胞階段特異性啟動(dòng)EGFP高表達(dá)，故適用于特異性，標(biāo)記造血發(fā)育中內(nèi)皮-生血轉(zhuǎn)化等重要事件。

2 主要試劑和材料

質(zhì)粒（pMXs-Oct4，pMXs-Sox2和pMXs-Klf4）購(gòu)自Addgene；Plat-E細(xì)胞購(gòu)自Cell Biolabs；轉(zhuǎn)染試劑Lipo6000和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-NANOGanti‐body購(gòu)自Bethyl；Anti-OCT3/4山羊抗兔IgG購(gòu)自San‐ta Cruz；Alexa Fluor 568標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Al‐exa Fluor488山羊抗兔IgG和驢抗小鼠IgG購(gòu)自Ab‐cam；Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen；ReverTra Ace qP‐CR RT Master Mix with gDNA Remover購(gòu)自TOYO‐BO；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自上海翊圣生物技術(shù)有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit購(gòu)自北京天根公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖DMEM培養(yǎng)基、N-2添加劑（N-2）、B-27添加劑（B-27）、Trypsin-EDTA（0.05%和0.25%）、雙抗（1×105U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺（1%GlutaMAX）、β-巰基乙醇、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和DPBS均購(gòu)自Gibco；DAPI、polybrene、維生素C和氯化鋰均購(gòu)自Sigma-Aldrich；白血病抑制因子（leuke‐mia inhibitory factor，LIF）購(gòu)自Millipore；CHIR99021和PD0325901購(gòu)自Selleck。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)液 Plat-E細(xì)胞培養(yǎng)液：高糖DMEM培養(yǎng)基/10%FBS。MEF細(xì)胞培養(yǎng)液：高糖DMEM培養(yǎng)基/10%FBS，含1%NEAA與1%雙抗。iCD1無血清培養(yǎng)液：高糖DMEM培養(yǎng)基/N-2（0.5×）/B-27（0.5×）混合，添加雙抗、1%GlutaMAX、1%丙酮酸鈉、1%NEAA、100μmol/Lβ巰基乙醇、50 mg/L維生素C、10μg/L bFGF、5 mmol/L氯化鋰、1×106U/L LIF、CHIR99021（GSK3β抑制劑，2 000×）和PD0325901（MEK抑制劑，2 000×），此培養(yǎng)液可提高重編程效率。小鼠多能干細(xì)胞維持培養(yǎng)液：含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入雙抗、1%GlutaMAX、1%丙酮酸鈉、1%NEAA、100μmol/Lβ-巰基乙醇1×106U/L LIF、CHIR99021（2 000×）和PD0325901（2 000×）。

3.2NE-MEF的分離與培養(yǎng) 性成熟雌鼠與雄鼠合籠后，次日上午觀察雌鼠陰道口有乳白色膠凍狀陰道栓即可確定受孕，記為胚胎第0.5天；在胚胎第12.5～15.5天將孕鼠脫臼安樂死后浸泡于75%乙醇中消毒20 min，在無菌條件下剖腹取出妊娠子宮，剪開宮腔夾出妊娠囊，去除胚胎頭部、四肢和內(nèi)臟，僅留取軀干部分，PBS洗3次；轉(zhuǎn)至無菌不銹鋼篩網(wǎng)中用0.25%Trypsin-EDTA浸泡，用滅菌注射器內(nèi)芯研磨成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管；室溫下消化5 min后加入3倍體積培養(yǎng)液終止消化。以1個(gè)胚胎對(duì)應(yīng)1個(gè)T75培養(yǎng)瓶的比例進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次天更換新鮮培養(yǎng)液，傳代后即為P1代。

3.3NE-MEF重編程為NE-iPSC 待10 cm培養(yǎng)皿中Plat-E細(xì)胞覆蓋約90%即用0.25%胰酶消化并計(jì)數(shù)，按每個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種8×106個(gè)細(xì)胞量的比例將其分盤，每盤對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染pMXs-Oct4/Sox2/Klf4各個(gè)質(zhì)粒，次日即可轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；按試劑盒說明書將含有相應(yīng)體積質(zhì)粒的750μL Opti-MEM培養(yǎng)基與含有30μL脂質(zhì)體Lipo6000的Opti-MEM培養(yǎng)基750μL相混合，室溫靜置5 min后轉(zhuǎn)入含Plat-E細(xì)胞的培養(yǎng)皿；轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)液；36 h后第1次收取病毒上清液，過濾備用；隔24 h第2次收上清；提前兩天將NE-MEF復(fù)蘇接種于6 cm培養(yǎng)皿，待其80%融合即可消化計(jì)數(shù)，以每孔2×104的細(xì)胞量接種于包被0.1%gelatin的12孔板；將病毒上清液與基礎(chǔ)培養(yǎng)液按1∶1比例混合，添加polybrene（1 000×）后感染NEMEF；24 h后重復(fù)第2次感染；隔18 h換成iCD1無血清培養(yǎng)液?jiǎn)?dòng)重編程；24 h后換液即為Day1，一般Day6前后可見iPSC克隆，用玻璃管針挑出克隆接種至已鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板中，換成小鼠多能干細(xì)胞維持培養(yǎng)液；隔日可將已貼壁的克隆消化成單細(xì)胞傳至12孔板。

3.4NE-iPSC的鑒定

3.4.1 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色 使用4%多聚甲醛將NE-iPSC原盤細(xì)胞固定30 min，PBS洗3次，每次5 min，取3.3μL BCIP與6.7μL NBT加入1 mL AP底物溶液，混勻后轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)皿的1個(gè)孔中，室溫避光染色30 min，ddH2O洗兩次終止染色反應(yīng)，拍照記錄。

3.4.2NE-iPSC多能性基因表達(dá)水平的分析 消化收集NE-iPSC后用Trizol Reagent裂解法提取RNA并檢測(cè)RNA濃度與純度。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA稀釋后用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。同時(shí)設(shè)置NE-MEF和小鼠ESC作為對(duì)照，管家基因Gapdh作為內(nèi)參照，每次均進(jìn)行不少于3次的獨(dú)立分析驗(yàn)證。數(shù)據(jù)經(jīng)2?ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平。RT-qPCR程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60 s退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。所用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.4.3 移植NE-iPSC產(chǎn)生畸胎瘤 消化收集NEiPSC后用PBS洗1遍，4℃、250×g離心5 min，計(jì)數(shù)，用含2%FBS的DPBS重懸細(xì)胞，在小鼠腹部與大腿連接處作皮下注射，每個(gè)部位的移植細(xì)胞量為（1～2）×106，1個(gè)月后可觀察到腫瘤包塊生長(zhǎng)，頸椎脫臼處死小鼠后分離出完整腫瘤，DPBS洗1遍，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后觀察來自三個(gè)胚層的不同組織細(xì)胞的病理變化并記錄。

3.4.4 核型鑒定 待無飼養(yǎng)層細(xì)胞的NE-iPSC生長(zhǎng)密度達(dá)80%，更換新鮮培養(yǎng)液，加秋水仙素使終濃度達(dá)0.2 mg/L，置于37℃培養(yǎng)箱60 min；吸棄培養(yǎng)液用DPBS清洗，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，250×g離心5 min；加37℃預(yù)熱的0.075 mol/L氯化鉀溶液7 mL重懸，37℃水浴20 min；用固定液（甲醇與冰醋酸按3∶1配制）預(yù)固定3 min，150×g離心5 min后棄上清，加7 mL固定液37℃水浴40 min；150×g離心5 min，保留適量固定液重懸細(xì)胞；在預(yù)冷的載玻片上滴片，轉(zhuǎn)入75℃烘箱烘3 h；0.05%胰酶消化8 s后轉(zhuǎn)入生理鹽水終止消化；用Giemsa染液染色10 min，用水輕輕沖洗后晾干，油鏡下觀察分裂相。

3.4.5 免疫熒光染色 將NE-iPSC種到已包被0.1%gelatin并鋪有小圓蓋玻片的6孔板內(nèi)，待克隆長(zhǎng)到合適大小即吸棄培養(yǎng)液，DPBS洗2遍，加4%多聚甲醛1 mL室溫固定30 min；DPBS洗2次，加入1 mL封閉通透液（3%BSA與0.2%Triton X-100按1∶1混合），室溫靜置1 h；DPBS清洗3次，按抗體最佳使用濃度用3%BSA稀釋各種Ⅰ抗，夾出圓玻片，細(xì)胞面朝上，用巴氏滴管輕輕滴加適量Ⅰ抗，4℃孵育過夜；玻片放回培養(yǎng)皿用DPBS洗4遍，按照類似Ⅰ抗的步驟染Ⅱ抗，室溫下避光孵育1 h；DPBS洗5次，DAPI染色孵育1 min，DPBS洗3次；在載玻片上滴加5μL抗熒光猝滅封片液，玻片細(xì)胞面朝下輕輕壓下完成封片，鏡下觀察熒光并記錄。

3.4.6NE-iPSC擬胚體形成實(shí)驗(yàn)與測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證

將25μL細(xì)胞懸液滴于培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)側(cè)，培養(yǎng)皿懸滴法培養(yǎng)2.5 d，收集后在鏡下觀察擬胚體形態(tài)并記錄；應(yīng)用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取NEiPSC基因組，對(duì)PCR擴(kuò)增所得序列進(jìn)行測(cè)序并與EGFP基因序列相比對(duì)。PCR所用引物序列見表2。

表2 PCR擴(kuò)增EGFP基因所用引物序列Table 2.Sequences of the primers of EGFP gene used in PCR amplification

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NE-MEF的分離與培養(yǎng)

Neurl3-EGFP熒光報(bào)告小鼠在胚胎第12.5～15.5天，安樂死孕鼠后取出胚胎，分離并培養(yǎng)胚胎成纖維細(xì)胞，選取代數(shù)在P3以內(nèi)的成纖維細(xì)胞通過共感染三因子啟動(dòng)重編程，結(jié)合iCD1高效誘導(dǎo)體系確立NE-iPSC重編程方案。實(shí)驗(yàn)流程示意圖見圖1。

Figure 1.Schematic representation of NE-iPSCgeneration protocol.圖1 NE-iPSC重編程示意圖

2 NE-MEF重編程為NE-iPSC

感染逆轉(zhuǎn)錄病毒前NE-MEF在鏡下呈長(zhǎng)梭型網(wǎng)狀交織，經(jīng)2 d的病毒感染后換為iCD1去血清培養(yǎng)液，感染后第3天左右即可觀察到NE-MEF逐漸呈向心性匯聚成團(tuán)，第6天左右在鏡下可見鳥巢樣NE-iP‐SC克隆，克隆輪廓清楚，克隆內(nèi)細(xì)胞間結(jié)合緊密，細(xì)胞核偏大。挑取單個(gè)克隆接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞上很快貼壁，2～3 d后克隆增大，形態(tài)圓且邊緣整齊，類似小鼠ESC，亮度稍高。將單個(gè)克隆消化成單細(xì)胞傳代于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，3 d左右即可形成較多稍隆起的大小均勻的類圓形細(xì)胞克隆。見圖2。

Figure 2.Reprogramming process of NE-MEF.The scale bar=200μm.A：the morphology of NE-MEFs before infection；B：day 3 after infection，the morphology of NE-MEFs were dramatically changed in iCD1 medium；C：day 6 after infection，NEMEFs formed ESC-like colonies；D：cultured day 2 on the feeder，single NE-iPSC clone was trypsinized into single-cell suspensions and replanted into fresh feeder.圖2 NE-MEF的重編程過程

3 NE-iPSC細(xì)胞系的多能性檢測(cè)

經(jīng)重編程誘導(dǎo)產(chǎn)生的NE-iPSC具有典型的胚胎干細(xì)胞形態(tài)，呈堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）染色陽(yáng)性，見圖3。RT-qPCR結(jié)果說明NE-MEF來源的NE-iPSC克隆表達(dá)的多能性基因與ESC相當(dāng)，包括Oct4、Sox2、Nanog和Rex1；多能性基因的表達(dá)水平較未重編程的NE-MEF明顯增高（P<0.01），見圖4。將NE-iPSC移植到重度聯(lián)合免疫缺陷（se‐vere combined immunodeficiency，SCID）小鼠體內(nèi)進(jìn)行多能性驗(yàn)證，歷時(shí)一個(gè)月可在注射部位觀察到較大體積的畸胎瘤，取出腫瘤組織經(jīng)固定、包埋、切片及HE染色，在光鏡下觀察到三個(gè)胚層來源的不同組織細(xì)胞，其中以腺體樣細(xì)胞、腸腔黏膜上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞等較為典型，見圖5，在同期移植了ESC的對(duì)照小鼠也觀察到同樣的現(xiàn)象。核型鑒定結(jié)果表明，NE-iPSC克隆具有正常的20對(duì)染色體，見圖6，基本排除重編程過程產(chǎn)生的核型異常。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Nanog和Oct4表達(dá)增加，見圖7。NE-iPSC懸滴法培養(yǎng)2.5 d即可演繹為擬胚體，克隆直徑在150～300μm之間，呈類圓形，邊緣整齊光滑，見圖8，與同期懸滴培養(yǎng)的ESC表現(xiàn)基本一致。

Figure 3.Morphological change of established NE-iPSCs and alka‐line phosphatase（AP）staining（scale bar=200μm）.A：phase micrographs of NE-iPSCs were shown，which were morphologically indistinguishable from ESC；B：NE-iPSCsexpressed APpositive as well as ESC.圖3 NE-iPSC呈堿性磷酸酶染色陽(yáng)性

4 EGFP的測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)NE-iPSC基因組DNA的PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，與EGFP片段進(jìn)行比對(duì)，顯示其序列完全一致，見圖9，與Neurl3-EGFP熒光報(bào)告小鼠的打靶策略示意圖相符，見圖10，證實(shí)NE-iPSC的Neurl3-EGFP在重編程過程中堿基序列并未發(fā)生突變。

討 論

特異識(shí)別生血內(nèi)皮的標(biāo)志基因?qū)τ谠煅l(fā)育與再生的研究具有重大意義，不僅可以明確不同細(xì)胞譜系的來源，而且可以提高體外定向誘導(dǎo)產(chǎn)生造血干/祖細(xì)胞的效率。近幾年，關(guān)于生血內(nèi)皮標(biāo)志基因的研究層出不窮。Swiers等［6］用Runx1 23GFP+報(bào)告基因標(biāo)識(shí)內(nèi)皮細(xì)胞，但未能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有造血和內(nèi)皮雙潛能的細(xì)胞群；Robin團(tuán)隊(duì)通過轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠Gfi1-Tomato揭示內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化事件，卻因?yàn)镠EC與非HEC在轉(zhuǎn)錄組水平高度相似，入選的細(xì)胞群體被認(rèn)為不具有典型代表性［7］。為了篩選特異性更強(qiáng)的內(nèi)皮標(biāo)志基因，結(jié)合此前在人胚胎造血干祖細(xì)胞發(fā)育過程中密切相關(guān)的生血內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)［8］，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序非偏頗地鑒定HSCprimed生血內(nèi)皮細(xì)胞，選取在HSC-primed HEC特異標(biāo)記基因中表達(dá)最顯著的Neurl3，利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Neurl3-EGFP基因敲入熒光報(bào)告小鼠［4］，基因打靶策略示意圖見圖10。

Figure 4.RT-qPCR was used to analysis the expression of pluripotent genes in NE-iPSC.mESC：mouse embryonic stem cells.The expression of pluripotent markers in NE-iPSCwas significantly increased compared with NE-MEF（control）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NE-MEFgroup.圖4 RT-qPCR對(duì)NE-iPSC克隆多能性基因的表達(dá)分析

Figure 5.Paraffin sections of teratoma formed by NE-iPSC（HE staining）.The scale bar=100μm.A：glandular cells；B：gut-like epithelium；C：muscle cells；D：neural cells.圖5 移植NE-iPSC可形成畸胎瘤

Figure 6.Karyotype identification for NE-iPSC.圖6 核型鑒定

在此之前，Neurl3并未在血液領(lǐng)域有相關(guān)的研究報(bào)道。在小鼠胚胎造血發(fā)育過程中，僅有主動(dòng)脈內(nèi)皮層特異表達(dá)Neurl3，這些表達(dá)Neurl3的細(xì)胞幾乎都共表達(dá)Runx1與CD44，雖然在胚胎第10天的主動(dòng)脈下間質(zhì)也有部分細(xì)胞表達(dá)Runx1，但是Neurl3僅在主動(dòng)脈內(nèi)皮層與Runx1共表達(dá)［4］。由此可對(duì)位于AGM區(qū)主動(dòng)脈腹側(cè)的HEC和非HEC進(jìn)行甄別?？梢姡琋eurl3-EGFP不僅可以精確定位HEC，而且可以高效富集HSC-primed HEC。

Figure 7.Results of immunofluorescence staining for NE-iPSC.The scale bar=100μm.A：red-Nanog stood for cell nucleus in NE-iPSC；B：green-Oct4 stood for cell nucleus in NE-iPSC；C：blue-DAPIstood for cell nucleus in NE-iPSC.圖7 NE-iPSC免疫熒光染色

由于臨床治療和生物醫(yī)藥工程等領(lǐng)域?qū)ρ杭?xì)胞，尤其是HSC的需求日益增加。學(xué)者們不斷對(duì)體外血液再生提出改良方案，包括了用人ESC來源的HEC移植到小鼠體內(nèi)使其分化為造血干祖細(xì)胞［9］，以及直接將小鼠成體血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)為HSC［10］。這些誘導(dǎo)策略都基于對(duì)造血發(fā)育事件的正確認(rèn)識(shí)［11］，但是存在著誘導(dǎo)效率與可重復(fù)性等問題。為了建立更高效的誘導(dǎo)體系，Guo等［12］用雙因子驅(qū)動(dòng)多能干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了造血祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，但該體系在誘導(dǎo)產(chǎn)生造血祖細(xì)胞效率方面仍有待提高。在本研究中，我們把Neurl3-EGFP報(bào)告基因小鼠體細(xì)胞重編程為NE-iPSC并進(jìn)行多能性驗(yàn)證。NE-iPSC作為體外誘導(dǎo)分化體系的起始細(xì)胞，Neurl3的引入可在體外再生造血干祖細(xì)胞過程中實(shí)現(xiàn)對(duì)HSC-primed HEC的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在提高造血干祖細(xì)胞再生效率的同時(shí)，也有助于指導(dǎo)體外誘導(dǎo)體系的進(jìn)一步優(yōu)化。

Figure 8.Embryoid body of NE-iPSC.The scale bar=100μm.圖8 NE-iPSC擬胚體形成實(shí)驗(yàn)

由于ESC細(xì)胞系的構(gòu)建存在一定技術(shù)瓶頸，而且iPSC重編程技術(shù)相對(duì)成熟且高效，同時(shí)規(guī)避了免疫排斥與道德倫理等問題［13］，故確定構(gòu)建NE-iPSC。考慮到Y(jié)amanaka經(jīng)典四因子的c-Myc是癌基因，四因子重編程方案可能出現(xiàn)阻礙重編程進(jìn)度的中間狀態(tài)pre-iPSC［14］。同時(shí)，過表達(dá)c-Myc可能引起細(xì)胞癌變，細(xì)胞生長(zhǎng)速度過快容易造成密度過大，在早期可因接觸性抑制影響重編程的進(jìn)度［15］。本研究利用iCD1去血清培養(yǎng)液［16］，高效重編程得到在形態(tài)、多能性和穩(wěn)定性等方面均不亞于ESC的NE-iPSC。NEiPSC作為精準(zhǔn)識(shí)別HSC-primed HEC強(qiáng)特異性的生物學(xué)工具，在未來的單克隆、無損、高通量的體外誘導(dǎo)體系的評(píng)估中具有廣闊的應(yīng)用前景，有望為人類臨床治療級(jí)別的造血干祖細(xì)胞在體外高產(chǎn)量再生提供技術(shù)參考。

Figure 9.NE-iPSCDNA sequencing of EGFP and comparison analysis.圖9 比對(duì)NE-iPSC EGFP序列的測(cè)序結(jié)果

Figure 10.Schematic image of targeting strategy.圖10 Neurl3-EGFP基因敲入小鼠打靶策略模式圖