肥胖PCOS患者子宮內(nèi)膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)*

楊 星，潘歆怡，郭燕嫻，李滿超，史亞男，張曉麗，梁曉燕

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510063）

肥胖已經(jīng)成為一種全球性的流行病，全世界超過6億成年人為肥胖人群。中國人群肥胖率在過去的20年中顯著上升。肥胖相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)包括月經(jīng)紊亂、子宮內(nèi)膜病變、不孕癥及妊娠期并發(fā)癥。我們的既往研究提示在飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠卵子-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物中，存在由于脂質(zhì)囤積而誘發(fā)非折疊或錯(cuò)誤折疊的新合成蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量堆積，Ca2+平衡狀態(tài)打破，進(jìn)而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能，產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)誘發(fā)卵子內(nèi)凋亡信號的產(chǎn)生，降低肥胖小鼠卵子發(fā)育潛能［1］。盡管肥胖對女性生育力的不良影響已經(jīng)得到了廣泛重視，但病理生理學(xué)研究及有效的治療策略仍未完全闡明。

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是女性無排卵性不孕最常見的原因之一，對月經(jīng)周期、排卵率、妊娠率和活產(chǎn)率產(chǎn)生諸多負(fù)面影響［2］。PCOS婦女中約有38%～66%是肥胖者［3］，而脂肪細(xì)胞是機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官，通過分泌一系列生物活性物質(zhì)，如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素和白細(xì)胞介素等，促進(jìn)慢性亞急性炎癥反應(yīng)狀態(tài)［4］。PCOS患者血循環(huán)中致病性炎癥調(diào)節(jié)因子顯著增加。我們的前期研究提示PCOS患者卵巢組織內(nèi)顆粒細(xì)胞炎癥性細(xì)胞因子IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子α（tumor necro‐sis factor-α，TNF-α）表達(dá)增加［5］，對應(yīng)卵泡液內(nèi)炎癥細(xì)胞因子含量增高。而這一類肥胖患者卵泡液又可以誘導(dǎo)卵子內(nèi)的脂質(zhì)囤積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并進(jìn)而引發(fā)凋亡比例的增加［1］。炎癥細(xì)胞通路是肥胖及卵巢功能異常重要的鏈接環(huán)節(jié)［6］。

肥胖對于包括卵子在內(nèi)的諸多器官產(chǎn)生不利影響，但肥胖對子宮內(nèi)膜影響的結(jié)論并不一致。進(jìn)行供卵治療的肥胖女性胚胎著床率無差異，提示肥胖對子宮內(nèi)膜容受性沒有負(fù)面影響［7］。然而肥胖小鼠的子宮內(nèi)膜胚胎著床位點(diǎn)減少，內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對孕激素刺激的反應(yīng)減弱，子宮內(nèi)膜蛻膜化過程受損［8］。肥胖女性來源的原代內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)中也表現(xiàn)出間質(zhì)蛻膜化異常［8］。蛻膜化和植入缺陷可能會對胎盤的形成產(chǎn)生負(fù)面影響。許多肥胖婦女的妊娠并發(fā)癥都與胎盤功能障礙有關(guān)［9］。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎兒染色體分析發(fā)現(xiàn)，肥胖女性具有顯著高的整倍體流產(chǎn)率再次表明肥胖是子宮內(nèi)膜功能異常的潛在獨(dú)立影響因素［10］。

PCOS患者廣泛存在肥胖狀態(tài)，且合并高雄激素血癥及高胰島素血癥，PCOS人群中不良妊娠結(jié)局更為顯著。PCOS患者復(fù)雜的內(nèi)分泌狀態(tài)是否會加重肥胖對內(nèi)膜的不良影響？本研究擬通過對肥胖PCOS患者子宮內(nèi)膜進(jìn)行細(xì)胞脂毒性反應(yīng)測定，明確肥胖PCOS患者內(nèi)膜上皮脂質(zhì)對于子宮內(nèi)膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的影響。

材料和方法

1 研究對象

本研究納入在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心進(jìn)行助孕治療的患者。年齡介于20～35歲擬行宮腔鏡檢查，其中包括符合鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)的BMI≥25 kg/m2的PCOS患者37名（obese組），以及正常體重對照組患者（18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）18名（moderate組）。對照組患者月經(jīng)周期規(guī)則，正常卵巢儲備，由于盆腔輸卵管因素或男方因素接受體外受精-胚胎移植治療。PCOS患者行人工周期黃體酮轉(zhuǎn)換后第7日獲取內(nèi)膜組織活檢標(biāo)本；正常排卵患者選取排卵后7日黃體期內(nèi)膜組織。本研究已通過中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與產(chǎn)前診斷委員會審批，倫理編號為2019ZSLYEC-005S。

2 方法

2.1 油紅O染色 子宮內(nèi)膜組織冰凍切片，蒸餾水浸洗洗掉包埋劑。60%異丙醇浸洗2 min，油紅O工作液染色2～5 min，60%異丙醇調(diào)色2 min，清水洗滌，蘇木精復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化2 s，流水反藍(lán)，甘油明膠封片。

2.2 RT-qPCR檢測子宮內(nèi)膜組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的mRNA表達(dá) 使用RNeasy Micro Kit（Qia‐gen）提取顆粒細(xì)胞中的RNA。紫外分光光度計(jì)測定所提RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用特異性引物（Qiagen）測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）及熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的mRNA表達(dá)。于Rotor-GeneTM 6000（Corbett Research）進(jìn)行g(shù)PCR反應(yīng)。2?ΔΔCt方法定量分析mRNA的表達(dá)水平。

2.3 Western blot檢測子宮內(nèi)膜組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 子宮內(nèi)膜組織經(jīng)RIPA裂解液冰浴研磨，離心后取上清液，BCA法測定胞漿總蛋白，SDSPAGE分離蛋白，電泳完成后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素薄膜上，脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST漂洗，隨后加入相應(yīng)Ⅰ抗［蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase Rlike endoplasmic reticulum kinase，PERK）、ATF4和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer binding protein homologous protein，CHOP）抗體］，4℃孵育過夜，TBST漂洗后加入HRP標(biāo)記Ⅱ抗，常溫孵育1 h，TBST漂洗，暗室中加ECL超敏發(fā)光液，用ImageJ分析各條帶灰度值。

2.4 TUNEL染色 子宮內(nèi)膜組織冰凍切片采用TUNEL檢測試劑盒（Roche）試劑盒進(jìn)行操作：用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min；使用Pro‐teinase K工作液處理組織后使用PBS漂洗；加入50μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應(yīng)1 h；PBS漂洗后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm）。

Figure 1.The endometrial tissues of obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）were stained with oil red Oat the implantation stage，and the lipid droplets in the endo‐metrial tissues were semi-quantitatively observed.The lipid content in the epithelium and stroma of endometrial tissues in obese patients was significantly higher than that in control group.The number and the size of lipid droplets in the endome‐trium increased significantly.The scale bar=50μm.圖1 兩組子宮內(nèi)膜組織中脂滴含量的檢測結(jié)果

2.5 子宮內(nèi)膜組織中凋亡信號DNA laddering檢測 子宮內(nèi)膜組織低溫下將組織勻漿，加入抽提緩沖液，置于37℃水浴溫育1 h。加入0.2 mg/L蛋白酶K，50℃溫育至液體變得清亮，以等體積的飽和酚抽提3次。加無水乙醇和醋酸鈉沉淀DNA，溶于TE緩沖液。用分光光度計(jì)測量260 nm波長處的吸光度（A）值，計(jì)算DNA濃度。取10μg DNA于1.6%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙啶染色，紫外燈下觀察拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 油紅O染色結(jié)果

對肥胖PCOS患者及對照組患者種植期子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行油紅O染色發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜上皮及組織間質(zhì)中，中性脂滴染色比例顯著增加，上皮中脂滴體積增大，數(shù)量有肉眼可見的增多，提示肥胖PCOS患者內(nèi)膜組織中中性脂滴含量顯著高于正常體重對照組，肥胖者異常的代謝狀態(tài)直接影響到了胚胎種植的內(nèi)膜環(huán)境中的脂質(zhì)含量（圖1）。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因ATF4、GRP78及HSP70的mRNA表達(dá)情況

與對照組相比，肥胖PCOS患者黃體中期子宮內(nèi)膜組織中ATF4的mRNA表達(dá)量顯著增加（P<0.05），GRP78及HSP70的mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（圖2）。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

肥胖PCOS患者子宮內(nèi)膜組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路中相關(guān)蛋白PERK及ATF4的蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.05），CHOP蛋白表達(dá)量在2組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（圖3）。

4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

使用子宮內(nèi)膜組織冰凍切片進(jìn)行TUNEL染色之后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)其中凋亡信號，結(jié)果顯示，肥胖PCOS患者子宮內(nèi)膜中的凋亡信號顯著高于對照組（P<0.01），見圖4。但在最終使用DNA laddering檢測凋亡條帶時(shí)，2組均未檢測到顯著標(biāo)識的凋亡碎片條帶（圖5）。

Figure 2.The mRNA expression of endoplasmic reticulum stress-related molecules ATF4，GRP78 and HSP70 in the endometrium of obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs moderate group.圖2 子宮內(nèi)膜組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的mRNA表達(dá)

Figure 3.Western blot for determining the protein levels of PERK，ATF4 and CHOPin the endometrium from obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs moderate group.圖3 兩組子宮內(nèi)膜組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白檢測結(jié)果的比較

討 論

本研究所納入BMI大于25 kg/m2符合肥胖診斷標(biāo)準(zhǔn)的PCOS患者［11］，該群體具有最典型的血清代謝指標(biāo)紊亂，高血清膽固醇和非酯化脂肪酸濃度，高血糖和胰島素抵抗［12］。異常血清代謝變化可反映在卵泡液中，卵泡液組成成分影響在體及體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞成熟過程及質(zhì)量［13-14］。并伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路激活進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號產(chǎn)生［15］。因此在本研究中，我們進(jìn)一步觀察了肥胖PCOS婦女異常的代謝狀態(tài)是否同樣反映在子宮內(nèi)膜組織中，是否同樣激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。結(jié)果提示肥胖組子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)內(nèi)具有典型的中性脂滴浸潤，脂滴體積增大，浸潤范圍廣；伴隨上皮組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子ATF4表達(dá)增加，熒光TUNEL染色提示內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)凋亡信號增加，PERK及ATF4表達(dá)增加，但2組內(nèi)膜組織中CHOP及細(xì)胞凋亡DNA碎片的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，子宮腔內(nèi)高脂狀態(tài)激發(fā)細(xì)胞脂毒性反應(yīng)。

Figure 4.The apoptosis of endometrial cryosections fromobesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2；a and b）and moderate controls（ovu‐latory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2；c and d）was detected by TUNEL assay.The scale bar=75μm.Arrows inticate positive staining.Mean±SD.n=8.**P<0.01 vs moderate group.圖4 TUNEL染色及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)

Figure 5.DNA ladder assay.Total DNA was isolated from endometrium of obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2；O）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2；M）for DNA fragment assay.Neither of each group had detectable fragment band.n=8.圖5 子宮內(nèi)膜組織中凋亡DNA碎片檢測

脂滴是細(xì)胞內(nèi)以中性脂質(zhì)形式儲存能量的細(xì)胞器，通過脂肪合成和脂肪動員分解動態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量平衡，在能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這種自我平衡作用對正常細(xì)胞和機(jī)體功能至關(guān)重要，脂滴在肥胖等諸多涉及脂質(zhì)代謝紊亂的疾病中大量增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是具有多種功能的重要細(xì)胞器，完成蛋白質(zhì)的合成和跨膜蛋白分泌［16］，包括蛋白質(zhì)降解、鈣失衡、缺氧和細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)等應(yīng)激狀態(tài)，可導(dǎo)致未折疊蛋白累積，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［17］。在應(yīng)激狀態(tài)下，未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）被激活。UPR由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)3條傳感通路控制，包括肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、PERK和ATF6。其中PERK主要通過減弱蛋白翻譯和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激參與UPR，可特異性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子eIF2α、ATF4和CHOP。已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的下游事件UPR的3個(gè)分支都參與NF-κB的激活，進(jìn)而調(diào)控編碼促炎癥細(xì)胞因子的基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了細(xì)胞炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可以阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白在羊慢性子宮內(nèi)膜上皮中的表達(dá)，如ATF6、IRE1、GRP78、ATF4、EIF2和LC3等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑預(yù)處理降低了炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、IL-8和caspase-1生成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥細(xì)胞因子激活之間存在密切關(guān)聯(lián)，子宮內(nèi)膜功能異常機(jī)理中可能包括亞急性炎癥細(xì)胞反應(yīng)狀態(tài)。

我們的研究結(jié)果提示肥胖女性異常脂質(zhì)代謝狀態(tài)可伴隨內(nèi)膜組織的高脂狀態(tài)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK應(yīng)激通路中ATF4基因的激活，PERK及ATF4蛋白表達(dá)增加，凋亡相關(guān)蛋白CHOP的表達(dá)量未及明顯差異，雖然TUNEL可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水平凋亡信號的比例增加，但未最終在內(nèi)膜細(xì)胞凋亡后的DAN碎片化程度中發(fā)現(xiàn)顯著異常狀態(tài)的存在。PCOS可能涉及內(nèi)膜組織凋亡、自噬及存活，免疫耐受及對胚胎容受性等多種生理活動，與女性生殖健康密切相關(guān)。我們所觀察到的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中脂質(zhì)含量增加所伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)還需要進(jìn)一步擴(kuò)大人群范圍進(jìn)行研究論證。